牛體外受精胚胎培養液和培養方法

牛體外受精胚胎培養液和培養方法
【專利摘要】本發明提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養液，所述培養液中含NaCl109.0-110mM、KCl2.9-3.1mM、NaHCO326.0-26.5mM、MgCl2·6H2O0.5-1.0mM、KH2PO31.0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-10mM。將牛體外受精胚胎置于上述培養液中進行體外培養，結果顯示明顯優于未添加GSH的對照組，提高了囊胚發育率及胚胎質量，降低體外生產胚胎的成本，為牛IVF技術應用于實踐提供實驗基礎，可大大加速遺傳育種進程。
【專利說明】牛體外受精胚胎培養液和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業-畜牧獸醫領域，具體地說，涉及一種牛體外受精胚胎培養液和培養方法。
【背景技術】
[0002]隨著現代農業科技的發展，為了更充分利用良種母牛的繁殖潛力，加速遺傳育種進程，在生產實踐中應用高效的繁殖新技術成為必然。活體采卵(Ovum pick UP,0PU)和體外受精技術(In Vitro Fertilization, IVF)是二十世紀八十年代快速發展起來的胚胎工程新技術，二者相結合可獲得大量遺傳系譜明確的胚胎，從而縮短世代間隔。目前，這兩種技術已經成為歐美和大洋洲等畜牧業發達國家的農場主為擴大良種母牛群而采用的重要繁殖技術。然而，采用常規的牛胚胎培養體系(CRlaa和SOF液)，牛體外受精的囊胚發育率較低，而且胚胎質量也遠不及體內胚胎，導致胚胎移植受體后的妊娠率低，因此如何提高囊胚發育率及胚胎質量成為體外受精胚胎生產的重點和研究的焦點。
[0003]早在1878年，德國人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動物的體外受精技術。但直到1951年，美籍華人張民覺和Austin分別發現精子體外獲能現象后，體外受精技術才獲得了突破性進展。牛體外受精技術受到卵母細胞的體外成熟、精子的體外獲能、受精卵的體外培養環境等多個方面的影響。
[0004]胚胎的體外培養是IVF技術的一個關鍵環節，亦是卵母細胞體外成熟和體外受精技術最終效果的體現和檢驗。在體外受精后，受精卵在向囊胚發育過程中將需經歷一系列重要的變化，包括合子的形成 、第一次卵裂、胚胎基因組的激活、致密化以及形成囊胚。這一過程中，外界環境的變化會導致基因表達發生改變，從而影響胚胎的正常發育及質量。目前，哺乳動物早期胚胎的體外培養研究主要集中在改善培養液成分以滿足不同發育階段的胚胎營養需求。基于Rosenkrans等(1991年)開發的Charles Rosenkransl (CRl)培養液和Tervit等(1972年)開發的合成輸卵管液(SyntheticOviductal Fluid, S0F),經多年不斷改進逐步形成了兩種培養體系。據Hakan Sagirkaya等(2007年)和Somfai等(2010年)研究成果表明，CRlaa培養液用于牛胚胎培養有較好的效果，可以廣泛應用于牛的胚胎培養Thompson, J.G.等(2000年)和Jean M.Feugang等(2009年)的研究結果顯示，SOF培養液也是一種適合于牛胚胎培養的培養體系。張志平等(2006年)和桑國俊等(2008年)研究結果也顯示，經過優化的CRlaa和SOF培養液均適合于牛的體外胚胎培養，均取得良好的培養效果。哺乳動物早期胚胎發育是一個高度協調且精確調節的過程。在進化過程中，配子細胞逐步形成了一系列的分子級聯網絡，以保證胚胎發育周期系統地進行。在發育過程中，胚胎的內外活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, R0S)與抗氧化劑的平衡對早期胚胎發育起著決定性作用。
[0005]大多生化反應均產生R0S，其在細胞內、外均有著重要的作用，一部分ROS起著信號分子的作用，但是大多數ROS對機體是有害的。Brooker，R.J.等(2011年)報道，ROS可以引起細胞DNA損傷、不飽和脂肪酸的氧化、蛋白質中氨基酸的氧化甚至可以導致某些酶的失活。一般來說，ROS以四種形式存在，其中H2O2氧化作用較強，是引起氧化傷害的最主要因素。
[0006] 大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白質形式存在的一種抗氧化劑，能夠清除多種自由基:超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、次氯酸和脂氧自由基，并且能夠維持細胞內外氧化還原平衡。細胞內外環境GSH和ROS水平是影響受精卵發育過程中的兩個重要因素。早在2000年，de Matos等曾通過在體外胚胎培養過程中添加β-巰基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸來提高囊胚率。
[0007]盡管體外受精技術能成功應用于許多哺乳動物，但由于體外受精的囊胚率低而導致體外受精胚胎的生產成本高、效率低，限制了該技術在牛快速擴繁實踐中的廣泛應用。因此，如何能夠降低成本并提高牛IVF胚胎生產效率和胚胎質量成為亟待解決的問題。
[0008]目前，牛體外受精的技術體系中主要以CRlaa和SOF液為胚胎體外培養液，并在此基礎上進行改進，囊胚發育率均有不同程度的提高，囊胚發育率平均為30%-40%。對于囊胚質量,可以通過囊胚細胞總數、ICM細胞數/總細胞數比例、細胞凋亡率來評估。囊胚細胞總數根據囊胚所處階段的不同而不同，S.1wasaki等(1990年)獲得的牛早期囊胚總細胞數平均為44，ICM細胞數/囊胚總細胞數比例為15.8%左右；Andrew J.Watson等(2000年)統計牛囊胚細胞凋亡率約為7.7%-13%。

【發明內容】

[0009]本發明旨在提高牛IVF胚胎生產效率和胚胎質量，提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養液和培養方法。
[0010]為了實現本發明目的，本發明的一種牛體外受精胚胎培養液，所述培養液配方為=NaCl 109.0-1lOmM, KC12.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM、KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽l_10mM，以水配制。
[0011]所述培養液配方優選為:NaC1109.0M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6H200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-lOmM。
[0012]所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L-異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L。
[0013]所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-絲氨酸 1.05g/L。
[0014]優選地，所述培養液中谷胱甘肽含量為lmM、3mM、5mM或7mM。
[0015]更優選地，所述培養液中谷胱甘肽含量為3mM或5mM。
[0016]最優選地，所述培養液中谷胱甘肽含量為3mM。
[0017]本發明還提供一種牛體外受精胚胎的培養方法，將牛體外受精胚胎置于上述牛體外受精胚胎培養液中，在38.5°C、0.5%C02、100%濕度條件下進行體外培養。
[0018]本發明具有以下優點:
[0019]本發明通過在培養液中添加一定濃度的谷胱甘肽(Glutathione, GSH),能顯著提高體外胚胎的發育能力。同時對囊胚進行差異染色，區分內細胞團(Inner CellMass, ICM)、滋養層細胞和凋亡細胞，比較總細胞數，并計算ICM細胞數/總細胞數比例和凋亡率，結果顯示添加GSH的試驗組優于對照組，提高了囊胚發育率及胚胎質量，降低體外生產胚胎的成本，為牛IVF技術應用于實踐提供實驗基礎，可大大加速遺傳育種進程。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0021]實施例牛體外受精胚胎的培養方法
[0022]一、試劑
[0023]成熟培養液:含0.01IU/ml FSHUOIU/ml LH、I μ g/ml 雌二醇、100ng/ml IGF、50ng/ml EGF, lOOU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10%胎牛血清的TCM-199培養液。
[0024]洗精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、L 25mM 丙酮酸鈉、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、10mM 咖啡因、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素的水溶液。 [0025]受精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、
0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、1.25mM丙酮酸鈉、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml BSA、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的水溶液。
[0026]胚胎前期培養液:含109.5mM NaCl,3.1mM KCl,26.2mMNaHC03、0.8mM MgCl2.6Η20、
1.19mM ΚΗ2Ρ03、0.4mM丙酮酸鈉、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸H6mg/ml BSA>ImM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸的水溶液。胚胎后期培養液:含109.5M NaCl,
3.1M KC1、26.2M NaHC03>0.8M MgCl2.6Η20、1.19ΜΚΗ2Ρ03、0.4Μ丙酮酸鈉、1.5Μ葡萄糖、5Μ半乳糖酸1丐、10v/v%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、IM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸的水溶液。
[0027]所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L-異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L。
[0028]所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸
1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-絲氨酸 1.05g/L。
[0029]二、卵母細胞的采集和體外成熟
[0030]1.從屠宰場采集牛卵巢，置于37°C生理鹽水中，3h內送至實驗室。
[0031]2.使用含有青霉素和鏈霉素的溫熱的生理鹽水將卵巢清洗3-5次。
[0032]3.使用真空蠕動泵，用18號針頭抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。[0033]4.體視顯微鏡下挑選卵母細胞-卵丘細胞復合體(COCs)，在洗卵液中將COCs洗漆兩次，在成熟培養液中洗漆一次。
[0034]5.將洗干凈的COCs放入含有成熟培養液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養50枚 COCs，培養 22-24h。
[0035]三、體外受精
[0036]1.將COCs從成熟培養液中移入50 μ I受精滴中，每滴放15枚COCs。
[0037]2.38°C水浴解凍精液，使用5ml洗精液在500g條件下離心5min ;棄上清，再加入5ml洗精液離心5min，棄上清，使用洗精液調整精子濃度，使精子濃度約為2X IO7個/ml。
[0038]3.取50 μ I精液，與含有COCs的受精滴混合成為100 μ I的液滴。
[0039]4.38.50C，5%C02氣體，95%濕度條件下精卵共孵育8h。
[0040]四、胚胎體外培養
[0041]1.精卵共孵育8h后，取出卵母細胞，使用lmg/ml的透明質酸酶處理3min，然后使用移液槍反復吹打，直至卵丘細胞基本脫落。
[0042]2.使用含10%FBS的TCM199終止透明質酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在胚胎前期培養液中洗3次后放入胚胎前期培養液滴中進行培養。
[0043]3.48h后，將卵裂至4-8細胞的胚胎移至胚胎后期培養液滴中，48h后半量更換胚胎后期培養液。
[0044]4.第7天時,統計囊胚率。
[0045]五、GSH最適添加濃度篩選
[0046]1.配制0.5M的GSH作為儲液。
[0047]2.使用GSH儲液，按照終濃度為lmM、3mM、5mM、7mM梯度配制為試驗組，以非添加組為對照。
[0048]3.分別于培養的第48h、第5天、第7天，統計各個組的卵裂卵與8細胞率、桑椹胚率和囊胚率。
[0049]六、胚胎差異染色
[0050]1.選取體外培養第7天的囊胚,使用2%多聚甲醒固定20min。
[0051 ] 2.使用含0.5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS-BSA)洗兩次，放入透化液(50 μ ITriton,5 μ I Tween 和 9.945ml PBS)中，室溫放置 30min。
[0052]3.使用2M鹽酸室溫處理20min，然后使用IOOmM Tris-HCl室溫處理lOmin，使
⑶X2蛋白能夠與一抗結合。
[0053]4.使用PBS-BSA清洗三次，將囊胚放入封閉液(Iml山羊血清、5μ ITween和
8.995ml PBS)中，室溫封閉lh，然后轉入4°C冰箱封閉過夜。
[0054]5.棄去封閉液,⑶X2 —抗用封閉液按1:200稀釋,室溫孵育2h,棄去一抗稀釋液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
[0055]6.caspase-3一抗(購自 Cell Signaling Technology 公司)用封閉液按 1:200 稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。 [0056]7.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋⑶X2特異性二抗(購自Sigma公司)，室溫下避光放置lh。避光條件下棄去二抗稀釋液，用PBS清洗3次，每次5min。
[0057]8.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋caspase-3特異性二抗(購自LifeTechnologies公司),室溫下避光放置lh。避光條件下棄去二抗稀釋液,用PBS清洗3次，每次5min。
[0058]9.加入10 μ g/mL的Hochest33342染液染細胞核，室溫作用5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0059]10.實驗重復三次，每次隨機選取10個囊胚，計算凋亡率、ICM細胞數/總細胞數來評估囊胚質量。
[0060]七、數據統計
[0061]實驗數據采用統計軟件SAS V8中的ANOVA程序進行分析，Duncan’ smultiple-range檢驗方法判定處理間的差異顯著性，當p〈0.05時認為差異顯著。
[0062]八、胚胎后期培養液中添加GSH可顯著提高牛體外受精囊胚的發育率
[0063]選擇GSH添加濃度為O、1、3、5、7mM進行篩選，通過統計卵裂率、4-8細胞率、桑椹胚率、囊胚率(表1 )，結果各組間的卵裂率和4-8細胞率均差異不顯著(P > 0.05);對桑葚胚發育率，3mM和5mMGSH添加組均顯著高于對照組和其他實驗組(P < 0.05)，但這兩組間差異不顯著(P > 0.05);對囊胚率，和5mM GSH添加組均顯著高于對照組(p < 0.05),而7mM的GSH添加組與對照組間差異不顯著(p > 0.05)，可見在胚胎后期培養液中添加GSH均可提高牛IVF胚胎的體外發育率。
[0064]表1不同GSH濃度對牛IVF胚胎發育的影響
[0065]
【權利要求】
1.一種牛體外受精胚胎培養液，其特征在于，所述培養液配方為=NaCl 109.0-1lOmM,KCl 2.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM, KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸|丐5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-1OmM,以水配制； 所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為:L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L_異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L ； 所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為:L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L_谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-絲氨酸1.05g/L。
2.根據權利要求1所述的培養液，其特征在于，所述培養液配方為:NaC1109.5M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6Η200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸鈉 0.4mM、葡萄糖 1.5mM、半乳糖酸韓5mM>10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-10禮。
3.根據權利要求1或2所述的培養液，其特征在于，所述培養液中谷胱甘肽含量為lmM、3mM、5mM 或 7mM。
4.根據權利要求3所述的培養液，其特征在于，所述培養液中谷胱甘肽含量為3mM或5mM。
5.根據權利要求4所述的培養液，其特征在于，所述培養液中谷胱甘肽含量為3mM。
6.牛體外受精胚胎的培養方法，其特征在于，將牛體外受精胚胎置于權利要求1-5任一項所述培養液中，在38.5°C、0.5%C02、100%濕度條件下進行體外培養。
【文檔編號】C12N5/073GK103898046SQ201410073635
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】杜衛華, 孫尉俊, 朱化彬 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所