一種同時檢測rna病毒、dna病毒、支原體和衣原體的方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術應用領域，公開了一種在同一臺實時熒光定量PCR儀上同時檢測RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的上機反應程序，通過與相應的RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體在不同的熒光定量PCR儀器上、以不同的反應程序進行檢測相比較，具有較高的特異性、穩定性以及統一性。
【專利說明】【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及生物技術應用領域，尤其是用于常見的RNA病毒、DNA病毒、支原體和 衣原體的同時檢測與鑒定。 -種同時檢測RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的方法 【背景技術】
[0002] 目前，國內外新興的檢測病原微生物的方法是實時熒光定量PCR技術（Real-time fluorescent quantitative PCR)，這是一種在PCR反應體系中加入突光基團，利用突光信 號積累實時監測整個PCR進程，該技術不僅實現了對模板的定性和定量，而且具有靈敏度 高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具有實時性和準確性 等特點。因而，在呼吸道病原體檢測中具有巨大應用優勢。
[0003] 但目前對于RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的檢測都是分別進行，由于基因 組的特性、長度以及復雜度不同，不易于同時在同一個PCR儀上同時檢測，假陽性高，不穩 定，效率低。
[0004] 本專利成功建立的在同一臺熒光定量PCR儀上、同時檢測RNA病毒（以甲型H1N1 流感病毒為例、簡寫HI)、DNA病毒（以人腺病毒為例、簡寫ADV)、支原體（以人肺炎支原體 為例、簡寫MP)和衣原體（以人肺炎衣原體為例、簡寫CP)的方法，該方法具有特異性強、靈 敏度高、穩定性強的特點且操作簡便快速，在急性呼吸道病毒的現場檢測、衛生評價、臨床 診斷等方面顯示出良好的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明是由國家"十二五"科技重大專項2012ZX10004206-002支持的。在本發明 中，我們成功建立了在同一臺熒光定量PCR儀上、應用同樣的反應程序檢測RNA病毒、DNA病 毒、支原體和衣原體的方法。通過與各自病原體在不同的PCR儀上、以不同的反應程序進行 檢測的結果進行比較，說明該方法具有較高的特異性、靈敏度、高效性和穩定性。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種同時檢測RNA病毒（以甲型H1N1流感病毒為例）、 DNA病毒（以人腺病毒為例）、支原體（以人肺炎支原體為例）和衣原體（以人肺炎衣原體 為例）的配制體系，該方法使用針對各自病原體設計及合成的引物和探針進行配制。
[0007] 在一個實施方案中，所述方法包括以下配制成份：
[0008] a)反應緩沖液；
[0009] b)反應酶；
[0010] c)針對各自病原體的上、下游引物；
[0011] d)針對各自病原體的探針；
[0012] e)無 RNA酶的水補足體系要求的體積。
[0013] 在一個具體實施方案中，所述方法為熒光定量PCR/RT-PCR配制體系。
[0014] 在本發明的第二方面，提供一種在同一臺實時熒光定量PCR儀上、同時檢測RNA病 毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體和人肺炎 衣原體為例）的上機反應程序，該方法使用第一方面所述的配制體系。
[0015] 在一個實施方案中，所述方法包括以下程序：
[0016] a)熒光通道的設置；
[0017] b)反轉錄的溫度與時間；
[0018] c)預熱的溫度與時間；
[0019] d)預循環（預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環數）；
[0020] e)熱循環（預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環數）；
[0021] f)以界定的Ct值來判定檢測結果。
[0022] 在一個具體實施方案中，所述方法為熒光定量PCR/RT PCR擴增程序，并使用所述 配制體系作為反應體系。
[0023] 在本發明的第三方面，提供第二方面所述的上機反應程序的診斷試劑中的應用。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1為同時加入甲型H1N1型流感病毒（RNA病毒）、人腺病毒（DNA病毒）、人肺炎 支原體（支原體）、人肺炎衣原體（衣原體）陽性模板的熒光擴增圖。 【具體實施方式】
[0025] 本發明的技術途徑是首先利用已經設計并合成的RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣 原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例）相應基因 的保守區設計特異性引物和探針序列，確定了最佳配制體系及上機擴增程序，并且進行特 異性、靈敏度及穩定性的驗證實驗及臨床樣本的檢測應用，成功建立了 RNA病毒、DNA病毒、 支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例） 一步法多重熒光RT-PCR同一臺PCR儀的上機反應。
[0026] 同時，需要指出的是，本發明所述的檢測方法和試劑盒不僅應用于對患者（人）的 樣品進行檢測，也包括對環境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動物樣品等多 種樣品的非診斷目的的檢測。其應用也都是本領域技術的常用技術手段，并不需要進行特 別的、富有創造性的改變。
[0027] 實施例1. RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、 人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例）各病原體特異性引物和探針一步法熒光定量PCR/ RT-PCR檢測程序的建立
[0028] 1. 1按照英杰公司的核酸提取試劑盒（QIAamp? viral RNA Mini Kit)來提取樣 本核酸。
[0029] 1. 2RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原體以及人肺炎衣原體為例）一步法多重熒光RT-PCR檢測體系的配制
[0030] 配制試劑采用 Ambion 公司的 AgPath-IDTM One-st印 RT-PCR Kit (P/N :4387424), 體系為25 μ 1 :
[0031] 2xRT-PCR buffer 12.5μΙ 25 XRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer ] ·5μ1 引物、探針 0.5μ1 (引物終濃度為400nM、探針終濃度為ΙΟΟηΜ) 模板 5μ1 無RNA酶的水 4.5μ1
[0032] 1. 3RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型Η1Ν1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原體以及人肺炎衣原體為例）一步法熒光定量PCR/RT-PCR檢測方法的上機擴增程序
[0033] 采用羅氏公司的Roche480儀進行上機擴增，其程序如下：
[0034] 先設置FAM熒光采集通道；
[0035] 反轉錄溫度與時間：48°C, 30 min; 預變性溫度與時間：95°C，lOmin;
【權利要求】
1. 一種非診斷目的的同時檢測RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的方法： 配制PCR反應體系： a) 反應緩沖液； b) 反應酶； c) 針對各自病原體的上、下游引物； d) 針對各自病原體的探針； e) 無 RNA酶的水補足體系要求的體積。 設置上機反應程序， a) 熒光通道的設置； b) 反轉錄的溫度與時間； c) 預熱的溫度與時間； d) 預循環（預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環數）； e) 熱循環（預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環數）； f) 以界定的Ct值來判定檢測結果。
2. 如權利要求1所述的方法，PCR反應體系中，采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-st 印 RT-PCR Kit，P/N :4387424,體系為 25μ 1 : 2xRT-PCR buffer 12.5μ1 25 xRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer 1.5μ1 弓I物、探針 0.5μ1，引物終濃度為400nM、探針終濃度為ΙΟΟηΜ 模板 5μ1 無 RNA酶的水 4.5μ1。
3. 如權利要求1所述的方法，其中上機反應程序設置如下： 先設置FAM熒光采集通道； 反轉錄溫度與時間：48°C，30min; 預變性溫度與時間：95?，lOmin;
預熱溫度與時間·· 95°C，15 s; 熒光吸收溫度為60?，共10 退火溫度與時間： 60°C, 45s 預熱溫度與時間： 95°C，15 s; 熒光吸收溫度為60X：,共35 退火溫度與時間： 60°C, 45s 結果判定標準為：Ct值<34,判定為陽性；Ct值>36,判斷為陰性；Ct值在34?36之 間為可疑。
4. 如權利要求1或2所述方法，其中所述引物序列為SEQ ID NO :1-12所示。
5. 如權利要求1所述方法在檢測食品及原料、環境樣本中病原微生物方面的用途。
6. 如權利要求1所述方法可以在基層或小型實驗基地進行，同時也可應用于現場檢 測、衛生評價等方面。
【文檔編號】C12Q1/68GK104109721SQ201410083117
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】崔淑娟, 石偉先, 田麗麗, 張新, 于霞麗, 孫玉蘭, 王海濱, 張玉松 申請人:崔淑娟