一種食酸菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種食酸菌，食酸菌（Acidovorax?sp.）SHS-01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.8388，保藏日期為2013年10月24日。本發明一種食酸菌具有較廣的降解譜，能使畜禽糞便中四環素的殘留量降低80％以上，從而促進堆肥的腐熟程度，成功的解決了含有畜禽糞便中由于含四環素而對微生物產生抑制作用而難以進行有效堆肥的問題，大大降低了生產和使用過程中的工作量，降低了生產和使用成本。本發明對于保護生態環境，保護人類的身體健康具有重要的意義。此外本發明一種食酸菌，食酸菌（Acidovorax?sp.）SHS-01，培養條件簡單、生產使用成本低，容易保存，使用方便，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。
【專利說明】一種食酸菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境及生物【技術領域】,尤其涉及一種食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-Ol及其在四環素降解中的應用。
【背景技術】
[0002]抗生素具有殺死微生物、抑制微生物繁殖或生長，疾病等功效，因而大量的飼用抗生素被用作飼料添加劑預防和治療細菌引起的，稱之為抗菌生長促進劑。抗生素在畜禽機體內，僅有少部分經過羥基化、裂解和葡萄糖普酸化等代謝反應生成無活性產物，大部分仍以原形隨糞尿排出體外，所以，畜禽糞便中普遍含有抗生素類物質。
[0003]四環素是目前畜禽養殖中使用最為普遍的抗生素之一，是一種廣譜抗生素。相關研究顯示，糞便中的四環素濃度最高可達到200mg/kg。在糞便施用之前對其進行處理以降低抗生素含量，將有效減小四環素可能帶來的環境風險。將畜禽糞便進行堆肥處理，具有成本低、效率高、無二次污染、生態恢復性好等優點，所以篩選出四環素降解菌對于處含四環素畜禽糞的堆肥具有重大意義。
【發明內容】
[0004]發明目的:為了克服現有技術的不足，本發明的第一目的在于提供一種對四環素具有降解作用的食酸菌。
[0005]本發明的第二目的在于提供一種食酸菌在四環素降解中的應用。
[0006]技術方案:為 了解決上述第一目的，本發明所采用的技術方案為:一種食酸菌，其分類命名為食酸菌(Acidovorax sp.)SHS_01,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，保藏編號為:CGMCC N0.8388，保藏日期為2013年10月24曰。
[0007]為了解決上述的第二目的，本發明所采用的技術方案為:所述食酸菌在四環素降解中的應用。
[0008]具體應用為:
[0009](I)將降解四環素殘留的食酸菌SHS-Ol的試管種接種于LB培養基中，振蕩培養至對數期；
[0010](2)將步驟(1)培養好的菌種按10%的接種量接種入500L的種子罐，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養溫度為30-35°C，培養時間為60h，培養至對數生長期，得到種子液；
[0011](3)將步驟(2)所得到種子液按10%的接種量接入生產罐進行發酵培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養溫度為30_35°C，培養時間為60h，發酵完成后的培養液即為應用于四環素降解中的菌劑。[0012]更進一步的，所述步驟(1)中LB培養基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化鈉 10.0g, pH7.0。
[0013]更進一步的，所述步驟(2)中種子罐所用培養基的配方為:葡萄糖0.8%，(NH4)2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
[0014]本發明中所述的食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-Ol的生理活性特征如下:
[0015]所述食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01主要生物學特性為G-，對數生長期菌體為短桿狀，該菌能液化明膠，水解葡萄糖、果糖、乳糖和麥芽糖，不能水解甘露醇、核糖、木糖和蔗糖。
[0016]有益效果:與現有技術相比，本發明的優點是:
[0017](I)本發明公開的一種食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01具有較廣的降解譜,能使畜禽糞便中四環素的殘留量降低80%以上，大大降低了生產和使用過程中的工作量，降低了生產和使用成本。所制備的菌劑具有生產使用成本低，使用方便，去除效果好的優點，適合在畜禽糞便堆肥過程中使用。本發明對于保護生態環境，保護人類的身體健康具有重要的意義。使用該菌劑可以是畜禽糞便中的四環素含量明顯降低從而促進堆肥的腐熟程度。本發明成功的解決了含有畜禽糞便中由于含四環素而對微生物產生抑制作用而難以進行有效堆肥的問題。 [0018](2)食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01培養條件簡單、生產使用成本低,容易保存，使用方便，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明菌株SHS-01菌體結晶紫染色照片(1000x)；
[0020]圖2為本發明菌株SHS-01對四環素的搖瓶降解試驗結果示意圖；
[0021]圖3為本發明使用菌株SHS-01進行堆肥試驗對四環素降解情況示意圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實驗例詳細闡述本發明食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01的應用。
[0023]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01的篩選、分離和鑒定:
[0024](I)取從生產四環素的某農藥廠生產車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0mL加入四環素濃度為100mg/L的IOOmL無機鹽液體培養中，其配方為:1000mL蒸懼水、1.50gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.00g (NH4) 2S04，ρΗ7.0，于 160r/min，30°C條件下振蕩培養，每隔5天按3%的接種量轉接到新鮮的無機鹽培養基中，連續轉接5次；
[0025](2)取上面得到的富集菌液1.0mL，加入9.0mL無菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL無菌水中，充分混勻配成10_2的富集液，以此類推，對富集液進行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1mL涂布于含四環素的濃度為IOOmg/L無機鹽固體培養基(培養基配方為:1000mL蒸餾水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50gKH2P04、0.20gMgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og (NH4) 2S04, 20.0Og 瓊脂，ρΗ7.0)上，30°C培養 7 天；
[0026](3) 7天后從上述無機鹽固體培養基上挑取單菌落，于3.0mL的LB液體培養基中培養24小時后，LB液體培養基配方為:1000mL蒸餾水、NaCl 10.00g、蛋白胨10.00g、酵母粉5.0Og、pH7.0于8000r/min的條件下離心2min,倒去上清液,加入3.0mL的無菌水搖勻,仍于8000r/min的條件下離心2min,按此方法用無菌水洗兩遍后,加入3.0mL無菌水重懸該菌。吸取1.0mL該菌液加入IOOmL四環素濃度為100mg/l的無機鹽液體培養基中，于160r/min，30°C條件下振蕩培養7天后，用高效液相色譜測其降解效果。將降解效率較高的一株囷株保存，進行后續實驗；
[0027](4)將降解菌株接種于LB固體培養基上，其配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, PH7.0 ;30°C恒溫培養48h后觀察菌落形態，用光學顯微鏡觀察菌體形態(1000X)。菌株的生理生化鑒定按照《常見細菌系統鑒定手冊》進行。鑒定為SHS-Ol屬(Acidovorax sp.);命名為:SHS_01。其結晶紫染色照片如圖1所示，主要生物學特性為G-，對數生長期菌體為短桿狀，該菌能液化明膠，水解葡萄糖、果糖、乳糖和麥芽糖，不能水解甘露醇、核糖、木糖和蔗糖。
[0028]將食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01進行搖瓶試驗，檢驗其對四環素的降解效果:
[0029]在含100mg/L四環素的無機鹽培養基中，其配方為:1000mL蒸餾水、1.50g K2HPO4,0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og(NH4)2SO4, ρΗ7.0，按 3% 的接種量接種SHS-01，于30°C振蕩培養，48小時取樣測定。與空白相比，如圖2所示，處理樣品的吸收峰明顯下降，四環素被降解90%以上。
[0030]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01在四環素降解中的應用:
[0031]實施例1:
[0032](I)將食酸菌SHS-01的原種在培養皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養基的1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養至對數期；其中LB培養基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0033](2)準備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養基配方為:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.2。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至30°C后，培養60h，將上述培養好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養至對數生長期，攪拌速度為180r/min，無菌空氣通入量為1:0.6 ;
[0034](3)將到達對數期的種子液按10%的接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基成分與種子罐培養基相同。生產罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態備用。接種后的生產罐溫度控制 在30°C，生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6，攪拌速度為180r/min，培養60h。發酵結束后菌體數量達到10億個/mL以上，即為應用于四環素降解中的菌劑。發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0035]實施例2:
[0036](I)將食酸菌SHS-01的原種在培養皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養基的1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養至對數期；其中LB培養基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0037](2)準備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養基配方為:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.5。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至35°C后，培養60h，將上述培養好的搖瓶菌種按10 %的接種量接種入500升種子罐，培養至對數生長期，攪拌速度為240r/min，無菌空氣通入量為1:1.2 ;
[0038] (3)將到達對數期的種子液按10%的接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基成分與種子罐培養基相同。生產罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態備用。接種后的生產罐溫度控制在35°C，生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1.2，攪拌速度為240r/min，培養60h。發酵結束后菌體數量達到10億個/mL以上，即為應用于四環素降解中的菌劑。發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0039]實施例3:
[0040]( 1)將食酸菌SHS-Ol的原種在培養皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養基的1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養至對數期；其中LB培養基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0041](2)準備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養基配方為:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值
7.4。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，培養60h，將上述培養好的搖瓶菌種按10 %的接種量接種入500升種子罐，培養至對數生長期，攪拌速度為220r/min，無菌空氣通入量為1:0.9 ;
[0042](3)將到達對數期的種子液按10%的接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基成分與種子罐培養基相同。生產罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態備用。接種后的生產罐溫度控制在33°C，生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.9，攪拌速度為220r/min，培養60h。發酵結束后菌體數量達到10億個/mL以上，即為應用于四環素降解中的菌劑。發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0043]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01在堆肥試驗中對四環素降解的應用:
[0044]堆肥采用新鮮奶牛糞便，選取原料配比為牛糞:稻草段:稻草粉末:自來水為
17.6:0.36:0.23:0.45，此原料中的C/N為25:1，含水率控制在75%，四環素含量為50mg/kg。將上述實施例1-3制備的菌劑和經過滅菌處理(121°C，30min)上述實施例1_3制備的菌劑的以0.5% (質量比)的接種量接種至堆體中，混合均勻后開始堆置。經過50天堆肥過程后，分別測定肥堆中四環素含量，如圖3所示，未經滅菌處理的菌劑50d后對四環素的降解率達80%以上，而經滅菌處理后的菌劑50d后對四環素的降解率僅30%左右，結果表明，本發明一種食酸菌(Acidovorax sp.)SHS_01可直接用于畜禽糞便堆肥中對四環素降解，成功的解決了含有畜禽糞便中由于含四環素而對微生物產生抑制作用而難以進行有效堆肥的問題。
【權利要求】
1.一種食酸菌，其分類命名為食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-OI,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.8388，保藏日期為2013年10月24曰。
2.權利要求1所述的食酸菌在四環素降解中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，采用以下生產流程得到應用于四環素降解中的食酸菌: (1)將降解四環素殘留的食酸菌SHS-Ol的試管種接種于LB培養基中，振蕩培養至對數期； (2)將步驟(1)培養好的菌種按10%的接種量接種入500L的種子罐，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為18 0-240r/min，培養溫度為30_35°C，培養時間60h，培養至對數生長期，得到種子液； (3)將步驟(2)所得到種子液按10%的接種量接入生產罐進行發酵培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養溫度為30-35°C，培養時間60h，發酵完成后的培養液即為應用于四環素降解中的菌劑。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述步驟(1)中LB培養基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述步驟(2)中種子罐所用培養基的配方為:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏0.02%, pH 值 7.2-7.5。
【文檔編號】C12R1/01GK103923852SQ201410083651
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】馬愛軍, 何任紅, 張小華 申請人:江蘇農林職業技術學院