一種新的食管癌標志基因的檢測及應用的制作方法
【專利摘要】一種新的食管癌標志基因的檢測及應用，本發明涉及一種長鏈非編碼RNA及其應用，根據該長鏈非編碼RNA序列，設計并合成特異性實時定量PCR引物和探針，制備用于食管癌輔助診斷或者療效預測的制劑。利用實時定量PCR制劑，在食管癌臨床病例標本中檢測該長鏈非編碼RNA的表達水平，發現該長鏈非編碼RNA在食管癌中表達顯著上調，本發明有望制備用于食管癌輔助診斷或者療效預測的制劑。
【專利說明】—種新的食管癌標志基因的檢測及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及一種長鏈非編碼RNA及其應用，具體而言，本發明涉及一種長鏈非編碼RNA在制備食管癌輔助診斷或者預后制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]食管癌(Esophageal Carcinoma, EC)是嚴重危害全人類健康的惡性疾病，全球范圍內其發病率和死亡率分別居第八位和第六位。EC主要有兩種病理類型:食管鱗狀細胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)和食管腺癌(EsophagealAdenocarcinoma, EAC),我國病理類型以鱗癌為主(占90%以上)。據世界衛生組織公布的最新資料顯示，我國每年新發ESCC患者超過25萬人，因食管癌死亡的患者約20萬人，發病率居全國各類惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位，均遠超世界平均水平。盡管，目前臨床上用于食管癌檢查和治療的技術手段在不斷改進，但患者總體5年生存率仍然極低。近半個世紀以來，國內外關于EC發病機制的研究已在mRNA、蛋白質以及miRNA領域取得了一系列成果，但其確切的發病機制目前仍在積極的研究探索之中。(Jemal A, et al.Globalcancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians2011，61:69-90 ;Enzinger PC，et al.Esophageal cancer.N Engl J Med2003，349:2241-2252 ;陳萬青.2004-2005年中國惡性腫瘤發病與死亡的估計.中華腫瘤雜志2009，31:664-668 ;赫捷，等.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策.中國癌癥雜志，2011，(7) =501-504.)
[0003]人類基因組測序計劃完成以后，證實長期備受關注的蛋白編碼基因僅約占整個轉錄組的2 %，超過98%的轉錄產物為ncRNA (noncoding RNA，ncRNA)。隨著RNA組學研究的進展，起初被認為是基因組轉錄“噪音”的ncRNA，被逐步證實其在包括人類在內的多物種，甚至是植物的生理及病理活動中，均具有鮮為人知的廣泛而多樣化的功能。目前證實具有調控作用的ncRNAs主要分為長度> 200nt的LncRNAs以及< 200nt的microRNAs，雖然microRNAs是目前為止研究相對比較深入的一類小ncRNAs，但隨后人們發現在各個物種中，LncRNAs不僅數量大、種類多，而且在基因的轉錄和翻譯、細胞分化和個體發育、遺傳和表觀遺傳等生命活動中的調控作用較microRNAs更為廣泛、精細和復雜(Bimey E, et al.1dentification and analysis of functional elements ini % ofthehuman genome by the ENCODE pilot project.Nature2007,447:799-816 ；Wilusz JE,et al.Long noncoding RNAs !Functional surprises from the RNA world.Genes andDevelopment2009，23:1494-1504 ;Prasanth KV, et al.Eukaryotic regulatory RNAs:An answer to the ! genome complexity ! conundrum.Genes and Development2007,21:11-42 ；Tsai MC, et al.Long intergenic noneoding RNAs:new links in cancerprogression.Cancer Res2011，71:3_7 ；Pauli A,et al.Non-coding RNAs aS regulatorsof embryogenesis.Nature Reviews Genetics2011，12:136-149 ;Van LeeuwenS，etal.Long non-coding RNAs:Guardians of development.Differentiation2010,80: 175-183 ;0romUA，et al.Long Noncoding RNAs with Enhancer-like Function in HumanCells.Cell2010,143:46-58 ；Caley DP, et al.Long noncoding RNAs, chromatin，anddevelopment.The Scientific World Journal 2010，10:90-102.)。 [0004]長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，IncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年研究發現它是一類具有重要生物學功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，在細胞分化和發育、基因轉錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發揮重要的調控作用。近年來，越來越多的權威研究證實IncRNA在腫瘤的發生發展中起著抑制或促進腫瘤的作用，在調控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲轉移能力等方面，均具有十分重要作用。目前已有較多LncRNAs被證實在包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、結直腸癌、膀胱癌等在內的人類多種腫瘤中存在差異表達并執行重要的調控功能(Gupta RA, et al.Long non-codingRNA HOTAIR reprograms chromatin state topromote cancer metastasis.Nature2010,464:1071-1076 ；Cui Z,et al.The prostate cancer-up-regulated long noncoding RNAPlncRNA-1modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation ofandrogen receptor.Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations2013,31:1117-1123 ；Khaitan D，et al.The melanoma-upregulated long noncoding RNASPRY4-1T1 modulates apoptosis and invasion.Cancer Research2011，71:3852-3862 ;DuY, et al.Elevation of Highly Up-regulated in liver Cancer (HULC)by HepatitisB Virus X Protein Promotes Hepatoma Cell Proliferation via Down-reguIatingpl8.J Biol Chem2012，287:26302-26311 ；Ling H，et al.CCAT2，a novel noncoding RNAmapping to8q24， underlies metastatic progression and chromosomal instabilityin colon cancer.Genome Research2013，23:1446-1461 ;Liu Z，et al.Downregulationof GAS5Promotes Bladder Cancer Cell Proliferation， Partly by Regulating CDK6.PLoS 0NE2013，8:9Article Number e73991.)。為探索 LncRNA 在 ESCC 中是否具有功能，發明人在人ESCC組織及細胞系中，用目前已經證實在其它腫瘤中具有相關功能的LncRNA進行探索性研究，證實在乳腺癌組織中發現的LncRNA HOTAIR不僅在ESCC癌與正常組織中差異表達，而且在ESCC細胞株中可明顯抑制腫瘤細胞凋亡并促進腫瘤轉移(Chen FJ, etal.Upregulation of the long non-coding ma hotair promotes esophageal squamouscell carcinoma metastasis and poor prognosis.Molecular Carcinogenesis 2013,52:908-915.)。此外，發明人也證實在前列腺中發現的PlncRNA-1在ESCC組織中均顯著上調并可調控腫瘤細胞增殖能力(Wang CM，et al.Upregulation of the Long Non-codingRNA PlncRNA-1Promotes Esophageal Squamous Carcinoma Cell Proliferationand Correlates with Advanced Clinical Stage，Dig Dis Sci2013.doi:10.1007/sl0620-013-2956-7.)。
[0005]然而，追蹤文獻發現除發明人所在課題組外，關于食管鱗狀細胞癌的IncRNA表達譜及其相關指標的功能性的研究目前還較少。為系統探索ESCC的IncRNA表達譜，發現與ESCC發生發展特異性相關的一組IncRNAs，發明人釆用芯片技術篩選到一條在人ESCC癌組織中顯著高表達的IncRNA，該基因被命名為AL589743.1 (Ensemble database)，其轉錄區域位于14號染色體反義鏈19，650，037-19，687，565bp之間，基因全長約為4676bp。發明人研究證實:與正常組織相比，該IncRNA在人ESCC癌組織中顯著高表達，并在后期的大樣本組織 qRT-PCR (Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,實時定量PCR)實驗中進一步證實該指標在人ESCC癌組織中的表達顯著高于正常組織。為便于后期研究及論述，發明人將其命名為HUESCC_lncRNA3 (highly up-regulated in esophageal squamous cellcarcinoma, long noncoding RNA3)。本發明人重點關注了 ESCC的IncRNA表達譜，這一類新型的基因調控因子將有望進一步豐富和完善包括食管鱗癌在內的腫瘤發病機制的研究，也為發現腫瘤診斷及預后判斷的標志物、新的腫瘤治療靶點帶來希望。
【發明內容】
[0006]為系統研究人食管鱗狀細胞癌的IncRNA表達譜，發現與人食管鱗狀細胞癌發生與發展密切相關的新的IncRNAs，由發明人提供的6對食管癌和正常組織標本，通過Qiagen公司的RNA提取試劑盒(RNeasy Micro KU，貨號74004)提取RNA后，采用北京博奧生物有限公司的晶芯IncRNA芯片V2(4X180K)檢測篩選出一條在食管癌組織中顯著高表達的IncRNA，命名為HUESCC-lncRNA3，其基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示。后期經過共110對人ESCC癌與正常組織樣本qRT-PCR驗證發現85對樣本中該IncRNA表達在腫瘤組織中顯著上調。該IncRNA有望成為腫瘤診斷和預后判斷的標志物，同時也為腫瘤的治療提供了新的祀點。
[0007]本發明的目的是提供一種檢測在食管鱗狀細胞癌組織中高表達的IncRNA序列及其應用方法。
[0008]本發明系統的研究食管鱗狀細胞癌的IncRNA表達譜，發現與食管鱗狀細胞癌發生與發展密切相關的新的IncRNA。
[0009]本發明的目的是提供一種檢測在食管鱗狀細胞癌組織中高表達的HUESCC-lncRNA3 序列。
[0010]本發明提供了所述HUESCC-lncRNA3序列的檢測應用方法，根據該序列制備用于食管癌輔助診斷或者療效預測的制劑。
[0011]本發明根據所述HUESCC-lncRNA3序列設計了 3對引物用于檢測HUESCC_lncRNA3序列。
[0012]Pairl 上游引物:SEQ ID N0.2
[0013]Pairl 下游引物:SEQ ID N0.3
[0014]Pair2 上游引物:SEQ ID N0.4
[0015]Pair2 下游引物:SEQ ID N0.5
[0016]Pair3 上游引物:SEQ ID N0.6
[0017]Pair3 下游引物:SEQ ID N0.7
[0018]本發明根據所述HUESCC_lncRNA3序列設計并合成出用于實時定量PCR的檢測引物組。所述引物組適用于SYBR Green、TaqMan探針、分子信標、雙雜交探針、復合探針等的檢測。
[0019]優選的用于染料類實時定量PCR檢測的引物組分別為:
[0020]Pair3 上游引物:SEQ ID N0.6
[0021]Pair3 下游引物:SEQ ID N0.7
[0022] 本發明中，qRT-PCR、實時定量PCR、熒光定量PCR是同一概念，可以相互替換使用。[0023]本發明的另一目的是提供一種檢測HUESCC_lncRNA3表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該熒光定量PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準確、穩定性好，具有良好的應用前景。
[0024]本發明制備了一種檢測IncRNA表達水平的染料類實時定量PCR試劑盒，組分如下:特異性引物、標準DNA模板、突光染料、實時定量PCR反應液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.6，下游引物序列為SEQ ID N0.7。所述熒光定量PCR反應液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer緩沖液。所述熒光染料優選SYBRGreen II, Taq酶優選熱啟動酶。
[0025]本發明還公開了一種檢測食管鱗癌的染料類熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量PCR體系:
[0026]上游引物(10μπιο1/1)2μL ;下游引物(10 μ mol/L) 2 μ L ;樣品 cDNA4 μ L (或標準 DNA 模板 DNA2 μ L) ；50XROX Reference Dyel μ L ;2X SYBR Premex Ex Taq II (TliRNaseH Plus) 25 μ L，加離子水至50 μ L。熒光定量PCR程序:95°C 30s預變性，接40個循環:95V 5s,60°C 30-34s。
[0027]本發明還公開了一種長鏈非編碼RNA的檢測方法，包括樣品總RNA的提取、樣品cDNA 的制備、HUESCC-lncRNA3 的擴增。
[0028]以上所述的樣品總RNA的提取、樣品cDNA的制備、HUESCC_lncRNA3擴增的具體步驟包括:
[0029]I)樣品總RNA的提取:按照Life Technologies公司的TRIZOL?_試劑(貨號15596026)所需試劑及步驟提取食管鱗狀細胞癌組織或腫瘤的Total RNA ;再用NanoDropND-1000 核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的純度和濃度，甲醛變性膠電泳質檢確保提取的RNA的完整性。
[0030]2)樣品 cDNA 的制備:米用 TaKaRa 試劑盒 PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser (Perfect Real Time)(貨號 RR047A)對提取的總 RNA 反轉錄合成 cDNA ;該試劑盒內含RNase-Free DNase，可有效去除混雜的基因組DNA。
[0031]第一步去除基因組DNA反應，反應體系及條件如下:
【權利要求】
1.一種長鏈非編碼RNA在制備用于食管癌輔助診斷或者療效預測試劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述食管癌為食管鱗狀細胞癌。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述長鏈非編碼RNA序列如序列表中SEQID N0.1 所示。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的用于食管癌輔助診斷或者療效預測的試劑為實時定量PCR檢測試劑。
5.一種用于食管癌輔助診斷或者療效預測的實時定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括根據核苷酸序列為SEQ ID N0.1的長鏈非編碼RNA設計并合成出特異性用于實時定量PCR的檢測引物。
6.根據權利要求5所述 的試劑盒，其特征在于，用于長鏈非編碼RNA實時定量PCR檢測的特異性引物如序列表中SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
7.一種長鏈非編碼RNA的檢測方法，包括樣品RNA的提取、樣品cDNA的制備、IncRNA的擴增。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品RNA的提取、樣品cDNA的制備、IncRNA的擴增的具體步驟包括: 1)樣品總RNA的提取:按照LifeTechnologies公司的TRIzol?試劑所需試劑及步驟提取食管鱗狀細胞癌組織或腫瘤的Total RNA ;再用NanoDiOp ND-1000核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)定量所提取的 RNA 的純度和濃度，甲醒變性膠電泳質檢確保提取的RNA的完整性。 2)樣品cDNA 的制備:米用 TaKaRa 試劑盒 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNAEraser (Perfect Real Time)(貨號RR047A)對提取的總RNA反轉錄合成cDNA ;該試劑盒內含RNase-Free DNase，可有效去除混雜的基因組DNA。 3)IncRNA 的擴增:采用 TAKARA SYBR PremixEx Taq? II (Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒，以反轉錄的cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923985SQ201410118231
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】曹秀峰, 李蘇卿, 史衛紅, 仝宇梭, 庹磊, 汪春梅, 謝海偉, 劉子豪, 楊同昕, 呂進, 紀律, 朱斌, 王和明, 李義生 申請人:南京市第一醫院