一種提高井岡霉素產量的發酵方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高井岡霉素產量的發酵方法。該方法采用將孢子懸浮液進行菌種活化與平板培養，制成孢子活化液，再將孢子活化液接種于種子培養基中進行初步培養，得到種子培養液，再將種子培養液接種于發酵培養基中進行發酵培養，并將發酵一定時間的培養液取上清液滅菌后加入發酵培養基中，實現井岡霉素的發酵生產。本發明所述的方法在不加大能耗的前提下，獲得了較高的井岡霉素產量，縮短了發酵周期，降低了生產成本，在工業化生產中具有較大的應用價值。
【專利說明】一種提高井網霉素產量的發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物【技術領域】的微生物發酵方法，具體是一種提高井R霉素產量的發酵方法。
【背景技術】
[0002]井R霉素又稱有效霉素，是一種安全高效的抗真菌抗生素。目前在我國以及東南亞各主要糧食產區，井R霉素作為一種優質農藥在防治水稻、玉米以及小麥紋枯病方面取得了顯著的成效。另外，作為合成抗糖尿病臨床藥物阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的重要原料，井R霉素的發酵生產在醫藥領域也受到了廣泛關注。目前工業化發酵采用的菌株是上海農藥所報道的吸水鏈霉菌5008變種(Sirepio焊Ce1S hygroscopi cus var.jinggangensis 5008 )，盡管自70年代開始該菌株使用已有近40年，但其代謝產物井岡霉素仍是最為有效、應用面積最廣的農用抗生素。
[0003]微生物的群體感應(Quorum sensing, QS)也稱為自誘導,最初是指細菌調節自身菌體密度的一種環境感應系統。通過擴散性信號小分子(又稱為自誘導物)與轉錄活化蛋白的相互作用而打開與細胞群體密度有關的基因表達。這些信號分子從細菌細胞擴散到環境中，一旦達到一個臨界濃度(或者說達到某一特定的群體密度)，這些信號分子就可誘導調節一系列目標基因的轉錄，可調節的功能包括抗生素的生物合成、穩定期的進入等。目前，已在許多革蘭氏陽性菌和陰性菌中發現群體感應系統可調控許多基因的表達。
[0004]經文獻查閱發現為提高井R霉素的產量人們也做了廣泛研究，從優良菌種選育、培養及優化到發酵條件控制和產品的分離純化，都取得了卓越的成果。中國發明申請號200610112671.2 (循環發酵生產井網霉素的方法)，公開了一種循環發酵生產井網霉素的新方法。中國發明申請號201010173832.5 (井R霉素發酵生產方法)，公開了一種生物工程【技術領域】的井R霉素發酵生產方法，該方法在不加大能耗的前提下，縮短了發酵周期，提高了設備利用率，獲得較高的井R霉素產量。中國發明申請號201110088294.4 (—種提高井岡霉素發酵水平的生產方法)，公開了一種提高井R霉素發酵水平的生產方法，明確了碳源的品種、補入時機和補入方式，根據碳源不同的補入量，把發酵周期延長，較大幅度地提高井岡霉素的發酵水平。中國發明申請號201310010562.X (—種高效節能的井R霉素發酵方法)，公開了一種高效節能的井R霉素發酵方法。而這些研究也表明，在現有的高效發酵基礎上，再靠這些方面的技術操作來提高井R霉素產量，其提升空間就比較有限。
[0005]前人研究顯示，通過向發酵培養基中添加發酵上清液，利用群體感應的方法可提高菌核青霉發酵過程中核叢青霉素的產量。因此，在現有的發酵水平的基礎上，控制成本能耗的前提下，若能通過發酵液回添，在發酵過程中提前添加內源群體感應信號分子，刺激細胞之間的感應作用，促進相關基因的表達，從而實現相關次級代謝廣物的廣量提聞，將為提聞井R霉素的廣量提供一種新的思路。
[0006]參考文獻
Raina S， Odell Mj Keshavarz T.Quorum sensing as a method for improvingsclerotiorin production in Penic i11ium sc Ierotiorum [J].Journal ofbiotechnology, 2010, 148(2): 91-98。
【發明內容】
[0007]本發明在現有的發酵技術基礎上，通過向發酵液中添加前一批發酵上清液，利用群體感應現象，使細胞群體感應分子的數量快速達到啟動次級代謝的閾值，提前進入發酵穩定階段，以提高井R霉素的發酵效率及產量。該方法在控制能耗的前提下，縮短了發酵周期，提高了設備利用率，獲得較高的井R霉素產量，降低了生產成本，在未來的工業化生產中具有巨大的應用價值。
[0008]本發明是通過以下技術方案實現的。
[0009]提高井R霉素產量的發酵方法包括如下步驟:
第一步，將_80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體產孢培養基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養5-8 d后取平板表面覆蓋的孢子，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網變種5008菌株，Strep tomyces hygroscopi cus var.jinggangensi s 5008,屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ； 第二步，將孢子活化液與種子培養基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養基中，接種后于37°C下培養，培養15-30 h ；
第三步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養72-120 h后發酵結束，將發酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20°C保存；
第四步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養5-20 h后，在發酵培養基中添加第三步得到的發酵上清液
0.01-2.0%，繼續培養72-108 h后發酵結束。
[0010]所述的固體培養基的組分為:黃豆餅粉20 g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L,余量為自來水。
[0011]所述的種子培養基的組分為:玉米粉30 g/L、黃豆餅粉22 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
[0012]所述的發酵培養基的組分為:玉米粉100 g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
[0013]本發明利用微生物的群體感應現象，提前向發酵液中添加含群體感應信號分子的發酵上清液，利用群體感應信號分子對其進行刺激，可激活群體感應通路的響應，促進相關基因的表達，使得某些次級代謝物的分泌提前進行，并提高次級代謝物的產量，提高生產效率。本發明確定了發酵上清液的最適添加時間為發酵開始12 h，最適添加濃度為0.5%，96h發酵培養后，井R霉素的絕對積累量從12 g/L提高到了 16 g/L，降低了生產成本。且使發酵96 h就達到最高產量，發酵提前24 h結束，縮短了發酵周期，取得了更大的生產效率。【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例中發酵上清液的添加時間對井岡霉素發酵產量的動態影響圖。
[0015]圖2為實施例中發酵上清液的添加濃度對井R霉素發酵產量的動態影響圖。
【具體實施方式】
[0016]下面對本發明的實施例作詳細說明。本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0017]提高井R霉素產量的發酵方法包括如下步驟:
第一步，將_80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培養基的平板上，然后將平板倒置，于37 °C培養5-8 d,待表面布滿青灰色孢子時取出，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網變種5008菌株，hygroscopi cus var.jinggangensi s 5008,屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ；
第二步，將孢子活化液與種子培養基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養基中，接種后于37°C下培養，培養15-30 h ；
第三步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養72-120 h后發酵結束，將發酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20°C保存；
第四步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養5-20 h后，在發酵培養基中添加第三步得到的發酵上清液0.01-2.0%，繼續培養到72-108 h后發酵結束。
[0018]所述的固體培養基的組分為:黃豆餅粉20 g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L,余量為自來水。
[0019]所述的種子培養基的組分為:玉米粉30 g/L、黃豆餅粉22 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
[0020]所述的發酵培養基的組分為:玉米粉100 g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
[0021]實施例1
發酵培養基中發酵上清液添加時間對井R霉素產量的影響考察，選擇3個時間段:種子液接種前即O h、發酵開始后12 h、發酵開始后24 h，分別添加不同濃度的發酵上清液，進行發酵試驗。實施步驟和結果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養
將配制的固體孢子培養基(成分:黃豆餅粉2 g、甘露醇2 g、瓊脂按2 g，自來水100 mL)滅菌，倒平板冷卻后待用。將_80°C保存的井R霉素產生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液甘油凍存管融化，將其涂布于固體培養基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養5-8 d后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子長勢良好的平板上加入5 mL無菌水，用涂布棒輕輕刮動平板表面覆蓋的孢子，使其懸浮于無菌水中，制成孢子活化液。
[0022](2)種子培養
將不銹鋼彈簧卷曲成環狀，置于250 mL錐形瓶底部，裝入50 mL種子培養基(成分:玉米粉3 g、黃豆餅粉2.2 g、酵母粉I g、NaCl 0.2 g、KH2P04 0.08 g、蒸餾水100 mL)，滅菌。待培養基冷卻至室溫，吸取孢子活化液50 PL加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養24 h，至少設置3個平行樣。
[0023](3)發酵培養
對照組:將不銹鋼彈簧卷曲成環狀，置于250 mL錐形瓶底部，瓶內裝入50 mL發酵培養基(成分:玉米粉10 g、黃豆餅粉2.5 g、酵母粉0.5 g、NaCl 0.1 g、KH2P04 0.15 g、去離子水100 mL)。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養液進行井岡霉素檢測。
[0024]發酵液添加組:設置了三個發酵上清液添加時間O h、12 h、24 h，設置相對較寬的添加濃度范圍0.01%,0.1%、1.0%。
[0025]O h添加組:發酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內裝入50 mL發酵培養基，滅菌冷卻后直接加入不同量的處理好的發酵上清液(0.01%,0.1%、1.0%)。每個劑量組至少3個平行樣，然后將9個搖瓶接種種子液。轉接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養液進行井岡霉素檢測。
[0026]12 h添加組:發酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內裝入50 mL發酵培養基，滅菌。轉接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL,種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養。培養進行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發酵上清液(0.01%,0.1%、1.0%)，每個劑量組至少設置3個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37°C、220 rpm繼續培養，培養再進行12 h即達到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養液進行井R霉素檢測。
[0027]24 h添加組:發酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內裝入50 mL發酵培養基，滅菌。轉接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養。培養進行到24 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中先取出2 mL培養液作為井R霉素檢測樣品(24 h取樣點)，然后加入不同劑量的處理好的發酵上清液(0.01%、0.1%、1.0%)，每個劑量組至少設置3個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37 °C、220 rpm繼續培養，培養再進行24 h即達到48 h取樣點，依次在48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。
[0028](4)井R霉素產量檢測
樣品處理:取2 mL發酵液于離心管，10000 rpm離心5 min,吸取0.5 mL上清液于新離心管。加入0.5 mL氯仿，劇烈震蕩直至形成乳濁液。將乳濁液常溫靜置15 min, 12000 rpm離心5 min。吸取上清液，并稀釋5倍到測量范圍內，以0.22 μπι微孔濾膜過濾，作為HPLC
上樣樣品。
[0029]井岡霉素標品處理:井岡霉素標準品粉末，配成10 g/L (0.1 g/10 mL)，取100μ L>200 μ L>300 μ L、400 μ L、500 μ L 加水至 I mL(濃度為 I g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L，乘以標品純度即為標準品的實際濃度)。
[0030]流動相配置:5 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，吸取1.8 g/L的NaH2P04.2H20溶液51 mL,吸取17.9 g/L的Na2HP04.12H20溶液49 mL，用去離子水定容1000 mL，調節pH到7.0。流動相抽濾、脫氣處理20 min。
[0031]液相色譜條件:流動相為98%的磷酸鹽緩沖液與2%的甲醇；流速為I mL/min ;檢測波長210 nm，使用伊力特Hypersil ODS 25 μπι、4.6 mmX250 mm分析柱，柱溫為35°C ；出峰時間約為8 min。根據峰面積對比標準曲線得到井R霉素含量，因樣品處理時均稀釋5倍，所以比對得到的含量乘以5得到井R霉素的發酵產量。
[0032]2.實施結果分析
對照組與發酵上清液不同添加時間下井網霉素的最高產量分別為:對照組12.47 g/L；O h添加0.01%發酵上清液組13.24 g/L、0 h添加0.1%發酵上清液組13.71 g/L,O h添加1.0%發酵上清液組14.06 g/L, 12 h添加0.01%發酵上清液組13.59 g/L、12 h添加0.1%發酵上清液組14.13 g/L、12 h添加1.0%發酵上清液組15.35 g/L, 24 h添加0.01%發酵上清液組13.08 g/L、24 h添加0.1%發酵上清液組13.62 g/L、24 h添加1.0%發酵上清液組13.94 g/L。由此可見，在不同的添加濃度下，處理組均在12 h添加的井R霉素產量更高。其中發酵上清液添加量在1.0%時相對于對照組井R霉素產量有較大提高，所以對其在不同添加時間的動態影響作圖(見圖1)。由于吸水鏈霉菌5008在發酵進行到10-12 h時處于細胞代謝最旺盛的對數生長期，因此我們分析相對于O h和24 h，12 h向發酵液中添加上清液對井R霉素產量提高的影響更明顯，與對照組相比可提高23%左右。
[0033]實施例2
由實施例1得出，發酵培養基中在12 h添加發酵上清液可以促進井R霉素產量提高，接下來更加詳細地比較了不同上清液添加量對井R霉素產量的影響，先選擇3組相對較低添加濃度0.01%,0.05%,0.10%ο實施步驟和結果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養 同實施例1。
[0034](2)種子培養 同實施例1。
[0035](3)發酵培養 對照組:同實施例1。
[0036] 發酵液添加組:發酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內裝入50 mL發酵培養基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL，種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養。培養進行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發酵上清液(0.01%、0.05%,0.1%)，每個劑量組至少設置三個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37°C、220 rpm繼續培養，培養再進行12 h即達到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養液進行井R霉素檢測。
[0037] (4)井R霉素產量檢測 同實施例1。
[0038](5 )吸水鏈霉菌5008生物量檢測
樣品處理:取2 mL發酵液于離心管中，10000 rpm離心5 min,去除上清液,沉淀用作測量。用STE緩沖液懸浮菌體沉淀，離心后去上清反復洗滌兩次，用STE緩沖液將沉淀復溶到2 mL，分裝兩個2 mL離心管(250 μ L/管+250 μ L STE)。將20 μ L溶菌酶液(50 mg/mL)加入其中的一個離心管，另一管做為對照實驗。將加入溶菌酶的離心管與對照離心管一同放入37°C的恒溫水浴中反應I h。在反應后的樣品中加入10 UL 10% SDS溶液并充分震蕩，使細胞進一步裂解。放置5 min, 12000 rpm離心10 min,以濃度為0-100 μ g/mL的牛血清蛋白制作標準曲線，吸取上清液稀釋25倍到測定范圍，用考馬斯亮藍G250工作液染色，以Bradford法測定蛋白濃度。其中STE緩沖液組分為:1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)
2.5 mL、0.5 mol/L EDTA 0.5 mL、5 mol/L NaCl 5 mL 定容至 250 mL。
[0039]樣品測定:分別取試管，其中一支加入1.0 mL空白樣，另外一支加入同體積的處理樣，加入5 mL考馬斯亮藍G250搖勻放置5 min, 595 nm處吸光度，用測得的吸光值從標準曲線上查得相當于牛血清蛋白的mg數，乘以稀釋倍數(2X25)得蛋白量表征的生物量。
[0040](6)發酵培養基殘糖測定
參考培養基中各組分含糖量數據(玉米粉82.92%，黃豆餅粉24.57%，酵母粉25.89%)，計算得出培養基初始糖濃度為90.35 g/L。本研究以濃度為0-100 mg/L的葡萄糖標準溶液制作標準曲線，采用苯酚-濃硫酸法測定殘留可溶性還原糖含量。具體操作:
樣品處理:取2 mL發酵液加入到離心管中，10000 rpm離心5min,吸取上清液。根據樣品的發酵時間，72 h前樣品(包括72 h)梯度稀釋1000倍，96 h后(包括96 h)梯度稀釋500 倍。
[0041]標品處理:葡萄糖烘干Id,配制10 g/L標品母液,稀釋100倍(100 mg/L),取200μ L、400 μ L、600 μ L、800 μ L、1000 μ L 加水至 I mL (濃度:20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L),每個濃度3個平行。樣品測定:加入5%苯酹溶液5 mL ,再與5 mL濃H2S04混合均勻，快速加入，邊加邊振蕩，放置反應10 min，冷卻后在488 nm下檢測吸光值。比照標準曲線，分別乘以稀釋倍數(1000或500)得殘糖量。
[0042]2.實施結果分析
發酵液回添量在濃度較低的情況下，井R霉素產量較對照組有一定的提高，但提高量較低，隨著添加濃度的增加，產量提高逐漸增大(見圖2)。12 h添加0.01%組產量14.57 g/L、12 h添加0.05%組產量14.85 g/L、12 h添加0.10%組產量15.16 g/L。根據生物量與殘糖測定結果得知，在添加不同濃度發酵液情況下，發酵液處理組與對照組生物量與殘糖量均沒有顯著差異，這表明單位細胞井R霉素的產量有所提高，而并非添加發酵液后使細胞量提升而提高井R霉素產量。
[0043]實施例3
發酵培養基中在12 h添加發酵上清液可促進井R霉素產量提高，接下來更加詳細地比較了不同上清液添加量對井R霉素產量的影響，選擇3個相對較高的添加濃度:0.50%、1.0%、1.5%。實施步驟和結果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養
同實施例1。
[0044](2)種子培養 同實施例1。
[0045](3)發酵培養 對照組:同實施例1。
[0046]發酵液添加組:發酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內裝入50 mL發酵培養基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL，種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220 rpm培養。培養進行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發酵上清液(0.50%、1.0%、1.5%)，每個劑量組至少設置三個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37°C、220 rpm繼續培養，培養再進行12 h即達到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養液進行井R霉素檢測。
[0047](4)井R霉素產量檢測 同實施例1。
[0048](5 )吸水鏈霉菌5008生物量檢測 同實施例2。
[0049](6)發酵培養基殘糖測定 同實施例2。
[0050]2.實施結果分析
發酵液回添量在0.5%和1.0%時，井R霉素產量較對照組有較大提高(見圖2)，0.5%較
1.0%提高更大，再加大添加量到1.5%時，產量提高有所下降，因此得出最適添加量為0.5%。最高產量出現在添加0.5%發酵液處理組中，發酵96 h時，井R霉素產量由對照組的12.47g/L提高至16.39 g/L，產量提高了 31.5%左右。根據對生物量與殘糖的測定結果來看，對照組與處理組之間的生物量與殘糖量并無明顯差異，證明單位細胞的井R霉素產量有提高。由于細胞感應信號分子濃度達到一定閾值即會產生群體感應現象，信號分子濃度的不斷提高并不能持續增加井R霉素的產量，因此添加發酵上清液最適濃度有一定范圍，在實際應用中的添加濃度也應嚴格控制。
【權利要求】
1.一種提高井R霉素產量的發酵方法，其特征在于包括如下步驟: 第一步，將-80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培養基的平板上，然后將平板倒置，于37 °C培養5-8d,待表面布滿青灰色孢子時取出，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網變種5008菌株，Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ； 第二步，將孢子活化液與種子培養基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養基中，接種后于37°C下培養，培養15-30 h ； 第三步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養72-120 h后發酵結束，將發酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20 °C保存； 第四步，將種子培養液與發酵培養基按照體積比為1:10的比例接種到發酵培養基中，接種后于37°C下培養5-20 h后，在發酵培養基中添加第三步得到的發酵上清液0.01-2.0%，繼續培養到72-108 h后發酵結束。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是，所述的固體培養基的組分為:黃豆餅粉20g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L，余量為自來水。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是，所述的種子培養基的組分為:玉米粉30g/L、黃豆餅粉22 g/L、 酵母粉10 g/L, NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
4.如權利要求1所述的方法，其特征是，所述的發酵培養基的組分為:玉米粉100g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L, NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
【文檔編號】C12R1/55GK103937856SQ201410159547
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】周文文, 李瑋, 屠鵬程, 高慧, 劉燕, 鄭曉冬 申請人:浙江大學