一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQIDNO.1～24。3.本發明針對G6PD基因6個高頻突變位點，提供了一種準確及特異性好、檢出率高、成本低及推廣性好，且能區分雜、純合突變的快速的G6PD缺陷癥基因突變檢測試劑盒，在基因水平上為G6PD缺乏癥的及早診斷和預防提供快速可靠的分子診斷依據,能在最短時間內使患者確診，及時對癥處理，避免病情進一步惡化，不僅對降低G6PD缺乏癥的危害，減少家庭的經濟和精神負擔具有重要的社會與經濟意義，同時具有較高的臨床推廣應用價值及廣泛的市場前景。
【專利說明】一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒。
【技術領域】
[0001]本發明涉及診斷試劑盒，用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的體外診斷。
【背景技術】
[0002]葡萄糖_6_憐酸脫氧酶（Glucose-6-phosphatedehy Drogenase, G6PD)缺陷癥是一種常見的X連鎖不完全顯性遺傳病，也是人類最常見的酶缺陷病之一。Gero缺陷癥在我國發病率約為4%~15%，個別地區高達40%以上，常見于我國西南（重慶、四川及貴州）和華南數省（廣東、廣西及海南等）。
[0003]G6ro是存在于所有細胞和組織中的磷酸戊糖旁路代謝的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供還原型輔酶II (NADPH)用于各種生物合成及維持血紅蛋白和紅細胞膜的穩定性。G6H)缺乏不僅影響NADPH的生物合成，防礙過氧化氫和成熟紅細胞的其他化合物的解毒作用；G6H)缺乏癥患者可由多種誘因如誤食蠶豆、氧化性藥物、感染性疾病等均可誘發急性溶血，嚴重威脅人類健康。Gero缺陷癥患者臨床表現變化大。患者在無誘因誘導情況下與常人無異，一旦經接觸誘因常會導致急性溶血，起病急促，進展迅速，從無癥狀到新生兒黃疽、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形細胞血溶性貧血，嚴重者導致新生兒期重癥核黃疽，如不及時對癥處理常會導致多種嚴重的并發癥，造成永久性神經系統的損傷甚至死亡，極大威脅人民生命健康。
[0004]我國G6ro缺陷癥的輔助診斷經歷了酶活性測定與基因分析等多種診斷方法。由于酶學法檢測影響因素眾多，準確性低，尤其對于Gero缺乏癥基因攜帶者的“雜合子”女性患者（其酶活性變化范圍很大：既可表現為正常，也可低至半合子水平）酶活性檢測很難檢出，也是G6ro缺乏癥目前實驗室漏檢的主要原因。由于已明確G6ro基因突變是G6ro缺陷癥的分子基礎，使得基因水平診斷成為G6ro缺陷癥臨床確診的最直接手段。
[0005]目前已存在一些獲得認可且已推廣的方法。其中部分已有的一些方法如單鏈構象多態性分析法（SSCP)，變性梯度凝膠電泳法（DGGE)，溫度梯度凝膠電泳（TGGE)、高效液相色譜分析法（DHPLC)、DNA直接測序等，檢測準確度雖高，但由于費用昂貴、手續復雜、耗時長等因素，限制了其在臨床推廣使用；而其他一些獲得認可方法，如等位基因特異性擴增法(ARMS-PCR)、PCR錯配限制性酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交（ASO)法，也仍存在要么效率低下、漏檢率或假陽性率高；要么檢測位點過少，無法區分雜合或純合突變等諸多的缺限，導致許多G6ro缺陷癥患者得不到及時診斷或誤診，限制了臨床上的及時救治，錯過了早期干預的時機。
【發明內容】
[0006]本發明針對目前葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的檢測現狀，提供一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，能夠一次區分G6H)基因中6個高頻突變位點中的正常與突變DNA，以及突變DNA中的純合突變與雜合突變狀況，達到準確，快速，廉價的診斷目的。
[0007]本發明的目的是通過以下措施實現的：
[0008]一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQ IDN0.1~
24。所述序列分別針對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥（G6PD)致病相關的六個主要高頻原發突變位點G1388A、G1376T、A95G、C1004T、C1024T、G871A，針對每一個突變位點分別采用四條引物-兩條外引物和兩條內引物，兩條外引物擴增的片段作為PCR體系的內對照，排除體系自身原因造成的誤診，兩條內引物分別反向擴增突變及正常的等位基因，能夠一次鑒定區分G6H)基因中正常與突變DNA，以及突變DNA中的純合突變與雜合突變狀況。
[0009]本發明試劑盒的診斷原理如圖I所示，Pl和P2為擴增含有突變點基因片段的外引物，SI和S2為兩條特異性引物即內引物，分別與DNA雙鏈的兩條單鏈互補，其3'端正好與SNP位點重合，由引物的3'端控制著引物的延伸反應，根據延伸產物的長度確定SNP類型，并通過在引物的3'端區域引入一個人為不匹配堿基來提高延伸反應的特異性。野生型(W)基因只能與相匹配的特異性引物S2發生延伸反應。特異性引物SI由于其3'末端堿基與模板不配對，故不發生延伸反應，因此PCR擴增后的產物只有DNA片段P1P2和P1S2 ；同理，突變型（M)基因僅與其配對的特異性引物SI發生延伸反應，特異性引物S2由于其3'末端堿基與模板不配對，故不發生延伸反應.因此PCR擴增后的產物只有DNA片段P1P2和S1P2。
[0010]為了進一步簡化檢測程序，降低檢測成本，并保證檢測的準確性和特異性，SEQ IDNO. I ~4 與 SEQ ID NO. 13 ~16，SEQ ID NO. 5 ~8 與 SEQ ID NO. 17 ~20，SEQ ID NO. 9 ~12與SEQ ID NO. 21~24分別在同一反應體系。成功構建了多重四引物擴增受阻突變體系PCR技術（Mutiplex Tetra-primer-ARMS-PCR, MT-ARMS-PCR)，能在單管內進行將多種單個突變位點的檢測，極大簡化檢測程序，降低檢測成本，方便實用。同一樣本僅進行三管PCR檢測，即可快速、準確、高特異性的得到G6H)缺陷癥6個高頻位點突變的基因檢測結果。
[0011]上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥體外診斷試劑盒，SEQ ID NO. 9 ：SEQ ID NO. 10 ：SEQ ID NO. 11 ：SEQ ID NO. 12 ：SEQ ID NO. 21 ：SEQ ID NO. 22 ：SEQ ID NO. 23 ：SEQ ID NO. 24 = 2 —10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10，SEQ ID NO. 5 :SEQ ID NO. 6 ：SEQ ID NO. 7 ：SEQ ID NO. 8 ：SEQ ID NO. 17 ：SEQ ID NO. 18 ：SEQ ID NO. 19 ：SEQ IDNO. 20 = 2 ~10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10,SEQ ID NO. I ：SEQ ID NO. 2 ：SEQ ID NO. 3 ：SEQ ID NO. 4 ：SEQ ID NO. 13 ：SEQ ID NO. 14 ：SEQ IDNO. 15 ：SEQ ID NO. 16 = 7 ： 7 ： 7 ： 7 ： 12. 5 ： 12. 5 ： 5 ： 5，以摩爾比計。本試劑盒特定調整外引物與內引物用量，其效果在于有效的平衡外側與內側PCR產物擴增效率，提高結果的特異性，便于擴增結果的準確判讀。
[0012]為了更簡單方便的得到更清晰易辨的檢測結果，上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒的使用方法是將三組引物分別與DNA擴增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95°C保溫lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的條件進行35個PCR擴增循環，在72°C保溫IOmin進行成像或測序檢測。優選為95°C 30s,63°C 30s、72°C 30s。
[0013] 有益效果[0014]I.使用本發明的試劑盒，可直接通過PCR擴增條帶的長度，一次性鑒定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥G6H)基因中6個高頻突變位點中正常與突變DNA，以及其DNA突變是純合突變或雜合突變。
[0015]2.本發明可進行6個單管PCR或三管雙重同時擴增，一次電泳得到檢測結果，所需儀器簡單，具有操作簡單、觀察簡單、耗費低廉、檢測快速而準確的優勢，適合臨床推廣普及，產業化應用。
[0016]3.本發明針對G6H)基因6種高頻突變位點，開發出一種準確及特異性好、檢出率高、成本低及推廣性好，且能區分雜、純合突變的快速的G6ro缺陷癥基因突變檢測試劑盒，在基因水平上為Gero缺乏癥的及早診斷和預防提供快速可靠的分子診斷依據，能在最短時間內使患者確診，及時對癥處理，避免病情進一步惡化，不僅對降低G6ro缺乏癥的危害，減少家庭的經濟和精神負擔具有重要的社會與經濟意義，同時具有較高的臨床推廣應用價值及廣泛的市場前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖I本發明試劑盒的檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的原理；
[0018]圖2實施例1①PCR擴增產物成像結果；
[0019]圖3實施例1②PCR擴增產物成像結果；
[0020]圖4實施例1③PCR擴增產物成像結果；
[0021 ]圖5實施例1④PCR擴增產物成像結果；
[0022]圖6實施例1⑤PCR擴增產物成像結果；
[0023]圖7實施例1⑥PCR擴增產物成像結果
[0024]圖8為實施例1①G1388A位點無突變的局部測序圖；
[0025]圖9為實施例1①G1388A位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為A ：
[0026]圖10為實施例1①G1388A位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為A ；
[0027]圖11為實施例1②G1376T位點無突變的局部測序圖
[0028]圖12為實施例1②G1376T位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為T
[0029]圖13為實施例1②G1376T位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為T
[0030]圖14為實施例1③A95G位點無突變的局部測序圖
[0031]圖15為實施例1③A95G位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為A突變為G ：
[0032]圖16為實施例1③A95G位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為A突變為G ：
[0033]圖17為實施例1④C1004T位點無突變的局部測序圖
[0034] 圖18為實施例1④C1004T位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為C突變為T[0035]圖19為實施例1④C1004T位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為C突變為τ
[0036]圖20為實施例1⑤C1024T位點無突變的局部測序圖
[0037]圖21為實施例1⑤C1024T位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為C突變為T ；
[0038]圖22為實施例1⑤C1024T位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為C突變為T ；
[0039]圖23為實施例1⑥G871A位點無突變的局部測序圖
[0040]圖24為實施例1⑥G871A位點為純合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為A ：
[0041]圖25為實施例1⑥G871A位點為雜合突變的局部測序圖，在圖中顯示為G突變為A ：
[0042]圖26多重擴增同時檢測A95G和G871A兩個位點的PCR擴增產物成像結果；
[0043]圖27多重擴增同時檢測G1376T和C1024T兩個位點的PCR擴增產物成像結果；圖28多重擴增同時檢測G1388A和C1004T兩個位點的PCR擴增產物成像結果。
【具體實施方式】
[0044]下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。
[0045]實施例1
[0046]I.樣本：人全血提取的DNA(50~100ng/ul)。樣本I和2為正常對照，是指擴增模板來源于無下述6個高頻突變的正常人血DNA ;樣本3和4為純合突變體，是指擴增模板來源于有下述6個高頻突變的G6H)缺陷癥病人全血DNA，且突變為純合子突變；樣本5和6為雜合突變，是指擴增模板來源于有下述6個高頻突變的G6H)缺陷癥病人全血DNA，且突變為雜合子突變。
[0047]2.試劑：（..io.l.aq ' Hot Start Green Master Mix, 2X ：包含 2XGreen Go TaqReaction Buffer(pH8. 5),400 μ M dATP、400 μ M GATP、400 μ M dCTP、400 μ M dTTP、4mMMgCl2> Nuclease-Free Water、DNA 聚合酶。
[0048]3. T-ARMS-PCR反應體系及擴增程序
[0049]①G1388A采用以下引物、體系及程序對各樣本進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳成像結果如圖2所示。
[0050]內引物：S1 ：GACGAGCTCCGTGAGGCCTGTCA(SEQ ID NO. I)
[0051 ] S2 ： TGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAAGAC(SEQ I D NO. 2)
[0052]外引物：P1：GCCCTACAGAGAAGGAGCAGTGTGGAG(SEQ ID NO. 3)
[0053]P2 ：CTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGAT(SEQ ID NO. 4)
[0054]反應體系
【權利要求】
1.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQ ID N0.1~24。
2.如權利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，SEQID N0.1 ~4 與 SEQ ID N0.13 ~16，SEQ ID N0.5 ~8 與 SEQ ID N0.17 ~20，SEQ ID N0.9 ~12與SEQ ID N0.21~24分別在同一反應體系。
3.如權利要求2所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，SEQID N0.9:SEQ ID N0.10:SEQ ID N0.11:SEQ ID N0.12:SEQ ID N0.21:SEQ ID N0.22:SEQ IDN0.23:SEQ ID N0.24=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.7:SEQ ID N0.8:SEQ ID N0.17:SEQ ID N0.18:SEQ ID N0.19:SEQ ID N0.20=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2:SEQ ID N0.3:SEQ ID N0.4:SEQ ID N0.13:SEQ ID N0.14:SEQ ID N0.15:SEQ IDN0.16=7:7:7:7:12.5:12.5:5:5，以摩爾比計。
4.如權利要求1~3所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒使用方法，將所述SEQ ID N0.1~24分別與DNA擴增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95 °C保溫lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的條件進行35個PCR擴增循環，在72°C保溫1min進行 成像電泳分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017862SQ201410180904
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】黃軼, 李陽, 宋利華 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院, 黃軼