牛支原體擴大培養專用培養基（mb-hls）及其制備方法

牛支原體擴大培養專用培養基（mb-hls）及其制備方法
【專利摘要】牛支原體擴大培養專用培養基（MB-HLS）及其制備方法，其特征在于：無需加入20%的血清以及小牛胸腺DNA，用去脂肪、筋腱健康的牛心、肺組織，加入適量的胰蛋白酶、NaCl、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4·2H2O、無水碳酸鈉、2.8%CaCl2、水解乳蛋白、HCI、NaOH和酚紅，蒸汽加熱、攪拌、過濾、滅菌方法制成的培養基，培養72小時后牛支原體蛋白含量為1.61-1.83mg/ml。本發明具有成本低、菌體蛋白含量高的優點，為牛支原體疫苗的研發與大批量生產提供有力的技術支撐。
【專利說明】牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物防疫領域，尤其是一種牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)及其制備方法。
【背景技術】
[0002]牛支原體(Mycoplasmabovis)是犢牛傳染性肺炎與關節炎的主要病原體。該病屬世界范圍分布，歐洲每年約有25%~33%的犢牛肺炎是由支原體引起的，相當于每年損失
1.44億~1.92億歐元，其中英國每年有190萬頭患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭，美國每年由于牛支原體導致的牛呼吸系統疾病和乳腺疾病所造成的損失達1.40億美元，單個牛場最高感染率達70%[1]。我國自2008年以來，已有7個省區報道該疾病的發生，發病率為50~100%，病死率10~50%[2~5]。本課題組對新疆六個地區15個牛場調查表明，被檢測牛場均有牛支原體感染，血清陽性率高達76.43%，從44份病死犢牛肺臟及關節液中分離鑒定出18株牛支原體[6]，進一步證實牛支原體已成為嚴重危害國內奶牛健康的重要病原體。
[0003]由牛支原體感染引起的犢牛傳染性肺炎與關節炎屬國內外近十年來新發動物傳染病，由于犢牛發病后病程長，藥物治療效果較差，費用高，因此疫苗研制受到重點關注，但目前除美國外，幾乎沒有商品化疫苗應用于牛支原體感染的預防。美國雖有兩種商業化全細胞疫苗，但未見公開發表的證據確實其有效性[7]。影響全細胞疫苗研制的限定因素是需要大量培養獲得高濃度的支原體抗原。由于牛支原體對生長所需要的營養極為苛刻，生長緩慢，且多數菌株不發酵或弱發酵葡萄糖，難以檢測生長狀況；大量培養的技術難度較高，很大程度上限制了牛支原體疫苗的研發與應用。
[0004]目前國外報道及通用的牛支原體培養基存在的主要問題是:
培養基中需要添加10~20%的血清以及小牛胸腺D N A，這無疑增加了牛支原體大量培養的成本，影響了疫苗生產廠家的研發費用及疫苗應用單位的使用成本，這是長期以來支原體疫苗生產中未能解決的一項關鍵技術問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于,研究建立了一種無需加入10~20%的血清以及小牛胸腺D NA，從而，顯著降低培養基成本，又能滿足牛支原體良好生長的牛支原體擴大培養專用培養基，為牛支原體疫苗的研發與生產提供技術支撐。
[0006]本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
一.基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ；
1:250 ~1:300 胰蛋白酶(Trpsin):1 ~1.3g ;
NaCl:4 ~4.5g ;
KCl:0.1 ~0.3g ;MgS04.7H20:0.25 ~0.75g；
MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；
KH2P04.2H20:0.015 ~0.045g ；
無水碳酸鈉:3.5~5g ;
1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ；
水解乳蛋白:2.25~2.75g；
HCI:8 ~IOml ；
Imol 的 NaOH:
0.2 ~0.6% 酚紅:1.6 ~2.0ml ；
去離子水:至 1000ml ；
二.添加劑部分 葡萄糖:5~15g ；
25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ;
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ;加入去離子水300~600ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到78~80°C時停止加熱:
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用40%的無水碳酸鈉溶液調整pH為7.8~
8.2，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250~1:300胰蛋白酶(Trpsin) I~1.3g，置于35~50°C水浴中3~5小時，期間檢測pH值并調整為7.8~8.2 ;
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴50~70分鐘；
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至7.8~8.2，110~120°C蒸汽加熱5~IOmin ；
過濾，按配方依次加入 NaCl:4 ~4.5g ；KC1:0.1 ~0.3g ；MgS04.7Η20:0.25 ~0.75g ；MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；ΚΗ2Ρ04.2Η20:0.015 ~0.045g ;1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ;水解乳蛋白:2.25 ~2.75g ;葡萄糖:5 ~15g ；25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ；0.2~0.6%酚紅:1.6~2.0ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.1~0.15 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
[0007]本發明培養基的72小時培養物中的菌體蛋白含量為1.61-1.83mg/mlml，顯著高于加入20%的血清以及小牛胸腺D N A的“葡萄糖血清肉湯”培養基(0.97mg/ml);高于“改良Thiaucourt’s培養基”(1.49mg/ml),高于牛心湯培養基(0.99mg/ml),本培養基的成本為37.5元/升，遠遠低于“葡萄糖血清肉湯”培養基545.5元/升，改良Thiaucourt’ s培養基”466.48元/升，牛心湯培養基232.2元/升。
[0008]本發明具有成本低、菌體蛋白含量高的優點，為牛支原體疫苗的研發與大批量生產提供有力的技術支撐。
【具體實施方式】
[0009]實施例1:本發明的 牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
一.基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.3g ；
NaCl:4.2g ；
KCl:0.2g ；
MgS04.7H20:0.35g ；
MgCl2.6H20:0.6g ；
Na2HP04.2H20:0.035g ；
KH2P04.2H20:0.025g ；
無水碳酸鈉:4g ；
2.5%CaC12:1.65ml ；
水解乳蛋白:2.6g ；
HCI:9ml ；
Imol 的 NaOH:
0.5% 酚紅:1.7ml ；
去離子水:至1000ml ；
二.添加劑部分 葡萄糖:8g ；
25%酵母酸浸汁:6ml ；
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:300g ;加入去離子水500ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到80°C時停止加熱；
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用30%的無水碳酸鈉溶液調整pH為8，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) Ig,置于45°C水浴中5小時，期間檢測pH值并調整為8 ；
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴55分鐘；
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至8.2，110°C蒸汽加熱IOmin;
過濾，按配方依次加入 NaCl:4.4g ；KC1:0.15g ；MgS04.7H20:0.5g ；MgC12.6H20:0.5g ；Na2HP04.2H20:0.03g ；KH2P04.2H20:0.035g ；1.5%CaC12:1.5ml ;水解乳蛋白:
2.25g ;葡萄糖:15g ;30%酵母酸浸汁:15ml ；0.4%酚紅:1.8ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.1 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
[0010]實施例2:
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
一.基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:300g ；
1:300 胰蛋白酶(Trpsin):lg ；
NaCl Ag ；
KCl:0.28g ；MgS04.7H20:0.45g ；
MgCl2.6H20:0.5g ；
Na2HP04.2H20:0.02g ；
KH2P04.2H20:0.018g ；
無水碳酸鈉:3.5g ；
2.8%CaC12:1.25ml ；
水解乳蛋白:2g ；
HCI:8ml ；
Imol 的 NaOH:
0.2% 酚紅:1.6ml ； 去離子水:至1000ml ；
二.添加劑部分 葡萄糖:7g ；
280%酵母酸浸汁:5ml ；
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ;加入去離子水400ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到78°C時停止加熱；
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用35%的無水碳酸鈉溶液調整pH為8，冷卻至500C以下時，邊攪拌邊加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) 1.3g，置于50°C水浴中3.5小時，期間檢測pH值并調整為8 ；
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴55分鐘；
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至8，115°C蒸汽加熱9min ；
過濾，按配方依次加入 NaCl:4.3g ；KC1:0.3g ；MgS04.7H20:0.4g ；MgC12.6H20:0.4g ；Na2HP04.2H20:0.031g ；KH2P04.2H20:0.03g ；1.4%CaC12:1.25ml ;水解乳蛋白:2.3g ;葡萄糖:10g ;25%酵母酸浸汁:10ml ；0.4%酚紅:1.6ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.12 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
[0011]實施例3:
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.1g;
NaCl:4.3g ；
KCl:0.3g ；
MgS04.7H20:0.75g ；
MgCl2.6H20:0.45g ；
Na2HP04.2H20:0.016g ；
KH2P04.2H20:0.017g ；
無水碳酸鈉:3g ；
2.6%CaC12:1.4ml ；水解乳蛋白:2.4g ；
HCI:9.5ml ；
Imol 的 NaOH:
0.4% 酚紅:1.5ml ；
去離子水:至1000ml ；
二.添加劑部分 葡萄糖=1Og ;
26%酵母酸浸汁:7ml ；
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ;加入去離子水350ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到79°C時停止加熱；
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用40%的無水碳酸鈉溶液調整pH為7.8，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250胰蛋白酶(Trpsin)l.lg，置于40°C水浴中4小時，期間檢測PH值并調整為7:
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴53分鐘:
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至7，115°C蒸汽加熱8min:
過濾，按配方依次加入 NaCl:4.5g ；KC1:0.2g ；MgS04.7H20:0.25g ；MgC12.6H20:
0.35g ；Na2HP04.2H20:0.033g ；KH2P04.2H20:0.25g ；2%CaC12:1.45ml ;水解乳蛋白:
2.4g ;葡萄糖:7g ;26%酵母酸浸汁:8ml ；0.3%酚紅:1.9ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.12 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
[0012]實施例4:
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
一.基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:350g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.2g ；
NaCl:4.5g ；
KCl:0.27g ；
MgS04.7H20:0.7g ；
MgCl2.6H20:0.7g ；
Na2HP04.2H20:0.045g ；
KH2P04.2H20:0.045g ；
無水碳酸鈉:5g ；
3.5%CaC12:1.75ml ；
水解乳蛋白:2.75g；
HCI:10ml ；
Imol 的 NaOH:
0.6% 酚紅:2.0ml ；
去離子水:至1000ml ；
二.添加劑部分葡萄糖:15g ；
30%酵母酸浸汁:15ml ;
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:350g ;加入去離子水450ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到78°C時停止加熱；
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用40%的無水碳酸鈉溶液調整pH為7.8，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250胰蛋白酶(Trpsin)l.2g，置于35~50°C水浴中
3.小時，期間檢測pH值并調整為7.8 ；
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴65分鐘；
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至7.8，115°C高壓蒸汽加熱8min ；
過濾，按配方依次加入 NaCl:4g ；KC1:0.1g ；MgS04.7H20:75g ；MgC12.6H20:0.75g ；Na2HP04.2H20:0.045g ；KH2P04.2H20:0.045g ；3%CaC12:1.75ml ;水解乳蛋白:2.75g ;葡萄糖:15g ;28%酵母酸浸汁:12ml ；0.4%酚紅:1.9ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.14 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
[0013] 實施例5:
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)由下述配方組成:
一.基礎部分1000ml的培養基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:280g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.15g ；
NaCl:4.4g ；
KCl:0.1g ；
MgS04.7H20:0.3g ；
MgCl2.6H20:0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015g ；
KH2P04.2H20:0.02g ；
無水碳酸鈉:4.5g ；
1.4%CaC12:1.35ml ；
水解乳蛋白:2.65g;
HCI:8.2ml ；
Imol 的 NaOH:
0.3% 酚紅:1.8ml ；
去離子水:至1000ml ；
二.添加劑部分 葡萄糖=IOg ;
27%酵母酸浸汁:8ml ；
本發明的牛支原體擴大培養專用培養基(MB-HLS)，由下述制備方法獲得:
取去脂肪、筋腱健康的的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:280g ;加入去離子水520ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到80°C時停止加熱；
續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用40%的無水碳酸鈉溶液調整pH為8.2，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) 1.15g，置于4°C水浴中5小時，期間檢測PH值并調整為8.2 ；
邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴65分鐘；
過濾，冷至室溫時，用ImolNaOH調整pH至8.2，115°C高壓蒸汽加熱7min ；
過濾，按配方依次加入 NaCl:4.25g ；KC1:0.17g ；MgS04.7H20:0.35g ；MgC12.6H20:
0.4g ；Na2HP04.2H20:0.035g ；KH2P04.2H20:0.035g ；4%CaC12:1.52ml ;水解乳蛋白:
2.62g ;葡萄糖:8.5g ;26%酵母酸浸汁:6ml ；0.2%酚紅:1.9ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000 ml，用ImolNaOH調pH至8.0，用0.1 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
【權利要求】
1.一種牛支原體擴大培養專用培養基，其特征在于:由下述配方組成: 一.基礎部分1000ml的培養基中含: 去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ； . 1:250~1:200胰蛋白酶1~1.3g ;
NaCl:4 ~4.5g ;
KCl:0.1 ~0.3g ;
MgS04.7H20:0.25 ~0.75g；
MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；
KH2P04.2H20:0.015 ~0.045g ； 無水碳酸鈉:3.5~5g ; . 1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ； 水解乳蛋白:2.25~2.75g；
HCI:8 ~IOml ；
Imol 的 NaOH: . 0.2 ~0.6% 酚紅:1.6 ~2.0ml ； 去離子水:至1000ml ； 二.添加劑部分 葡萄糖:5~15g ； .25~30%酵母酸浸汁:5~15ml。
2.一種牛支原體擴大培養專用培養基，其特征在于:由下述制備方法獲得: 取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ;加入去離子水300~600ml，蒸汽加熱、攪拌，溫度達到78~80°C時停止加熱； 續加去離子水使培養基的總量達到1000ml，用30~50%的無水碳酸鈉溶液調整pH為7.8~8.2，冷卻至50°C以下時，邊攪拌邊加入1:250~1:300胰蛋白酶I~1.3g，置于35~50°C水浴中3~5小時，期間檢測pH值并調整為7.8~8.2 ; 邊攪拌邊加入濃HCI，蒸汽浴50~70分鐘；過濾，冷至室溫時，用NaOH調整pH至7.8~8.2，110~120°C蒸汽加熱5~IOmin ；過濾，按配方依次加入 NaCl:4 ~4.5g ；KC1:0.1 ~0.3g ；MgS04.7Η20:0.25 ~0.75g ；MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；ΚΗ2Ρ04.2Η20:0.015 ~0.045g ;1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ;水解乳蛋白:2.25 ~2.75g ;葡萄糖:5 ~15g ；25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ；0.2~0.6%酚紅:1.6~2.0ml ;補充去離子水，使培養基的總量達到1000ml，用NaOH調pH至7.8~8.2用0.1~0.15 μ m濾膜過濾除菌，在I~5°C貯存備用。
【文檔編號】C12R1/35GK103937728SQ201410188388
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】剡根強, 王靜梅, 楊銘偉 申請人:石河子大學