一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，本發明包括以下步驟：（1）鱈魚皮預處理；（2）酶解反應：加入胰蛋白酶酶解反應；（3）超濾得GM2組分；（4）DEAE-SepharoseFF離子交換層析分離得到GM2-2組分；（5）SephadexG-25層析分離得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型膠原蛋白肽。本發明以水產加工副產物鱈魚皮為原料，從中提取具有肝細胞修復作用的膠原蛋白肽，簡單易行，生產成本低，可以顯著提高水產加工副產品的價值，避免浪費的同時還保護了環境，還能為開發相關功能性食品提供前期基礎。
【專利說明】一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及海洋生物提取【技術領域】，特別涉及一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 鱈魚皮由于其蛋白含量高，故其主要的生物活性成分即為活性肽。現在 研究發現，鱈魚皮生物活性肽具有抗氧化、抗病毒、抗胃潰瘍等作用。Dai-Hung Ngo等從太平洋鱈魚皮中分離純化兩種膠原蛋白肽，Thr-Cys-Ser-Pro (388 Da)和 Thr-Gly-Gly-Gly-Asn-Val (485. 5 Da)。通過電子自旋共振法證明了純化的肽的抗氧 化活性，同時也具有血管緊張素轉換酶抑制作用，說明鱈魚皮膠原蛋白肽具有抗氧化 和抗高血壓的作用（Dai-Hung Ngoa, BoMiRyua, Thanh-SangVoa, etal. Free radical scavenging and angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptidesfrom Pacific cod (Gadus macrocephalus) skin gelatin [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011，4(9) : 1110 - 1116)。宛寧從鱈魚皮中分離的到一種膠原蛋白肽 PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL，該肽能直接作用于病毒顆粒，病毒的凝集價顯著降低且成劑 量依賴性，具有極強的流感病毒神經氨酸酶抑制活性，活性肽的抗病毒作用具有多靶點（苑 寧.鱈魚皮中流感病毒神經氨酸酶抑制活性肽的研究[D].青島：中國海洋大學，2013)。 王志聰等探究鱈魚皮膠原蛋白肽的抗酒精性胃潰瘍作用，采用酒精誘導大鼠急性胃潰瘍模 型，試驗組灌胃給予不同劑量的膠原肽，檢測胃潰瘍指數、胃潰瘍抑制率并對胃潰瘍病灶部 位進行組織學觀察。結果與模型組相比，各受試物均能夠降低大鼠胃腺的出血損傷，降低胃 潰瘍指數，具有良好的抗酒精性胃潰瘍作用（王志聰，孫京沙，倪鑫，等.鱈魚皮膠原蛋白 肽的抗酒精性胃潰瘍作用[J].中國海洋藥物雜志，2012, 35(5) :17-22 )。
[0003]目前，膠原蛋白肽的保健功能主要在美容護膚、補鈣健骨、止血免疫等方面，但是 現在還未有研究關于膠原蛋白肽對肝臟的損傷保護作用，而現有的肝臟損傷的保護主要依 靠各類藥物，但是藥物都存在一定的毒性和抗藥性，生物活性肽是具有無毒、安全的特點， 是理想的輔助治療材料，亟需開發一種對肝臟的損傷保護效果好的生物活性肽。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，以水產加 工副產物鱈魚皮為原料，從中提取具有肝細胞修復作用的膠原蛋白肽，簡單易行，生產成本 低，可以顯著提高水產加工副產品的價值，避免浪費的同時還保護了環境，還能為開發相關 功能性食品提供如期基礎。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是： 一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，包括以下步驟： (1)鱈魚皮預處理：將鱈魚皮洗凈后用4°C純水浸泡20-30min，后用濃度0. 1-0. 2mol/L NaOH浸泡6-8小時，用清水沖洗至pH=7,浙干水分后，用濃度0. 1-0. 2mol/L的冰醋酸溶脹 10-12小時，最后用剪刀剪碎； (2)酶解反應：將步驟（1)預處理后的鱈魚皮與水按照1:4 (w/v)的料液比混合，然后 加入胰蛋白酶酶解反應； 采用胰蛋白酶酶解的產物對肝細胞的損傷修復效果最好。
[0006] (3)超濾：步驟（2)酶解反應結束后，滅酶，離心，收集上清液，上清液用超濾膜超 濾，截留獲得分子量為5-10KDa的組分，冷凍干燥后得GM2組分；GM2組分對肝細胞的損傷 修復效果最好。
[0007] (4) DEAE-Sepharose FF 離子交換層析分離：將 GM2 組分上 DEAE-Sepharose FF 離 子交換柱，采用PH4. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液作為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后得 到GM2-2組分；GM2-2組分對肝細胞的損傷修復效果最好。
[0008] (5)3印1^(1616-25層析分離：將612-2組分經3印1^(1616-25凝膠柱洗脫后，從上 樣開始計時，收集90-100min時間段洗脫液獲得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型 膠原蛋白肽。GM2-2-3組分對肝細胞的損傷修復效果最好。
[0009] 作為優選，步驟（2)酶解條件為：胰蛋白酶用量為每g鱈魚皮加入2000U，酶解溫度 50°C，pH 6,時間8h。這樣的條件下酶解效果最好，所得產物對肝細胞的損傷修復效果最好。
[0010] 作為優選，步驟（4)中DEAE-S印harose FF離子交換柱的洗脫條件具體為：GM2組 分加超純水配制成200mg/ml的溶液上樣，每次上樣量為2ml，洗脫速度為lml/min。
[0011] 作為優選，步驟（5)中Sephadex G-25凝膠柱的洗脫條件具體為： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 壓柱 12h，至填充量為 70± lcm ; 將GM2-2組分加超純水配制成lmg/ml的溶液上樣，上樣量：1. 5ml，超純水洗脫，洗脫速度： 0· 5ml/min〇
[0012] 本發明的有益效果是： 1、簡單易行，生產成本低，可以顯著提高水產加工副產品的價值，避免浪費的同時還保 護了環境，還能為開發相關功能性食品提供前期基礎。
[0013] 2、產品安全無毒，對肝細胞損傷修復作用好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1是不同蛋白酶酶解鱈魚皮所得組分作用經LPS誘導的Chang Liver細胞的細 胞0D值。
[0015] 圖2是超濾所得不同組分作用經LPS誘導的Chang Liver細胞的細胞0D值。
[0016] 圖3是GM2組分的DEAE-S印harose FF離子柱分離圖譜。
[0017] 圖4是GM2組分的DEAE-S印harose FF離子柱分離所得不同組分作用經LPS誘導 的Chang Liver細胞的細胞0D值。
[0018] 圖5是GM2-2組分Sephadex G-25層析分離圖譜。
[0019] 圖6是GM2-2組分Sephadex G-25層析分離所得不同組分作用經LPS誘導的Chang Liver細胞的0D值。
[0020] 圖7為本發明的產品對DPPH自由基的清除能力圖。
[0021] 圖8為本發明的產品對ABTS自由基的清除能力圖。
[0022] 圖9是經本發明的產品作用LPS誘導的Chang Liver肝細胞細胞形態變化，其中A 為正常組，B為LPS誘導組，C為低劑量（5mg/ml) GM2-2-3作用組，D為高劑量（lOmg/ml ) GM2-2-3作用組。
[0023] 圖10為流式細胞儀的結果圖，其中：A、正常組細胞；B、LPS誘導組細胞；C、低濃 度GM2-2-3 (5mg/ml)作用后細胞；D、高濃度GM2-2-3 (10mg/ml)作用后細胞。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0025] 本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0026] 及試劑 鱈魚皮購自浙江舟山佳和加食品加工有限公司；正常人肝細胞：張氏肝細胞（Chang Liver細胞）購自中南大學湘雅醫學院細胞中心，本實驗室傳代培養。
[0027] NaOH、冰醋酸等分析純購自國藥集團化學試劑有限公司；RPMI1640培養基購自 Gibco公司；胎牛血清（FBS)購自杭州四季青生物制品有限公司；似!10)3購自上海虹光化 工廠；胰蛋白酶、MTT購自Sigma公司；青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司； S印hadex G-25,上海源葉生物科技有限公司；大腸桿菌脂多糖（0111:B4 LPS)、四氮唑藍 (MTT)均購自sigma公司。
[0028] 實施例1 : 一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，包括以下步驟： (1)鱈魚皮預處理：將鱈魚皮洗凈后用4°C純水浸泡20min，后用濃度0. Imol/LNaOH浸 泡8小時，用清水沖洗至pH=7,浙干水分后，用濃度0. lmol/L的冰醋酸溶脹12小時，最后用 剪刀剪碎成約lcmX lcm左右小塊。
[0029] (2)酶解反應：將步驟（1)預處理后的鱈魚皮與水按照1:4 (w/v)的料液比混合， 然后加入胰蛋白酶酶解反應，酶解條件為：胰蛋白酶用量為每g鱈魚皮加入2000U，酶解溫 度50°〇邛!16，時間811。
[0030] (3)超濾：步驟（2)酶解反應結束后，KKTC水浴滅酶15min，4°C、10000轉/min離 心10min，收集上清液，上清液用超濾膜超濾，截留獲得分子量為5-10KDa的組分，冷凍干燥 后得GM2組分。
[0031] (4) DEAE-Sepharose FF 離子交換層析分離：將 GM2 組分上 DEAE-Sepharose FF 離 子交換柱(購自亞太恒信公司），采用PH4. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液(醋酸濃度50mmol/l)作 為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后得到GM2-2組分；洗脫條件具體為：GM2組分加超 純水配制成200mg/ml的溶液上樣，每次上樣量為2ml，洗脫速度為lml/min。
[0032] (5)3印1^(1616-25層析分離：將612-2組分經3印1^(1616-25凝膠柱洗脫后，從上 樣開始計時，收集90-100min時間段洗脫液獲得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型 膠原蛋白肽； Sephadex G-25凝膠柱洗脫條件具體為： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 壓柱 12h，至填充量為 70± lcm ; 將GM2-2組分加超純水配制成lmg/ml的溶液上樣，上樣量：1. 5ml，超純水洗脫，洗脫速度： 0· 5ml/min〇
[0033] 實施例2 : 一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，包括以下步驟： (1)鱈魚皮預處理：將鱈魚皮洗凈后用4°C純水浸泡30min，后用濃度0. 2mol/L NaOH浸 泡6小時，用清水沖洗至pH=7,浙干水分后，用濃度0. 2mol/L的冰醋酸溶脹10小時，最后 用剪刀剪碎成約lcmX lcm左右小塊。
[0034] (2)酶解反應：將步驟（1)預處理后的鱈魚皮與水按照1:4 (w/v)的料液比混合， 然后加入胰蛋白酶酶解反應，酶解條件為：胰蛋白酶用量為每g鱈魚皮加入2000U，酶解溫 度50°〇邛!16，時間811。
[0035] (3)超濾：步驟（2)酶解反應結束后，KKTC水浴滅酶15min，4°C、10000轉/min離 心lOmin，收集上清液，上清液用超濾膜超濾，截留獲得分子量為5-10KDa的組分，冷凍干燥 后得GM2組分。
[0036] (4) DEAE-Sepharose FF 離子交換層析分離：將 GM2 組分上 DEAE-Sepharose FF 離 子交換柱(購自亞太恒信公司），采用PH4. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液(醋酸濃度50mmol/l)作 為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后得到GM2-2組分；洗脫條件具體為：GM2組分加超 純水配制成200mg/ml的溶液上樣，每次上樣量為2ml，洗脫速度為lml/min。
[0037] (5)3印1^(1616-25層析分離：將612-2組分經3印1^(1616-25凝膠柱洗脫后，從上 樣開始計時，收集90-100min時間段洗脫液獲得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型 膠原蛋白肽； Sephadex G-25凝膠柱洗脫條件具體為： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 壓柱 12h，至填充量為 70± lcm ; 將GM2-2組分加超純水配制成lmg/ml的溶液上樣，上樣量：1. 5ml，超純水洗脫，洗脫速度： 0· 5ml/min〇
[0038] 工藝分析研究 1、最佳酶種及酶解條件選擇 1. 1選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作供選酶，按照蛋 白酶各自的最適作用溫度和pH值（見表1)酶解已經預處理的魚皮，加酶量為4000U/g，料 液比為1:4,反應5h,酶解預處理后的魚皮原料。 表1不同觸的最適溫度和pH 最適溫度（τ) 最適pH _喊性蛋白酶__55__10J_ 中性蛋白酶 35-45 6.5-7.5 _胃蛋白酶__3>45__3_ 木瓜蛋白酶 45 ^ 6-0 _陳蛋白酶__50__SJ_
[0039] 酶解完畢后，10(TC滅酶lOmin，過濾后冷凍干燥，備用。
[0040] 正交試驗 在初步確定酶解條件的基礎上，選擇酶解時間、pH值、加酶量、溫度等因素，設計正交試 驗，因素與水平見表2。
【權利要求】
1. 一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 鱈魚皮預處理：將鱈魚皮洗凈后用4°C純水浸泡20-30min，后用濃度0. l-o. 2mol/L NaOH浸泡6-8小時，用清水沖洗至pH=7,浙干水分后，用濃度0. 1-0. 2mol/L的冰醋酸溶脹 10-12小時，最后用剪刀剪碎； (2) 酶解反應：將步驟（1)預處理后的鱈魚皮與水按照1:4 (w/v)的料液比混合，然后 加入胰蛋白酶酶解反應； (3) 超濾：步驟（2)酶解反應結束后，滅酶，離心，收集上清液，上清液用超濾膜超濾，截 留獲得分子量為5-10KDa的組分，冷凍干燥后得GM2組分； (4) DEAE_Sepharose FF離子交換層析分離：將GM2組分上DEAE-Sepharose FF離子交換 柱，采用PH4. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液作為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后得到GM2-2 組分； (5) Sephadex G-25層析分離：將GM2-2組分經Sephadex G-25凝膠柱洗脫后，從上樣開 始計時，收集90-100min時間段洗脫液獲得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型膠原 蛋白肽。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)酶解條件為：胰蛋白酶用量 為每g鱈魚皮加入2000U，酶解溫度50°C，pH 6,時間8h。
3. 根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟（4)中DEAE-Sepharose FF 離子交換柱的洗脫條件具體為：GM2組分加超純水配制成200mg/ml的溶液上樣，每次上樣 量為2ml，洗脫速度為lml/min。
4. 根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟（5沖S印hadex G-25凝膠 柱的洗脫條件具體為： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 壓柱 12h，至填充量為 70± lcm ; 將GM2-2組分加超純水配制成lmg/ml的溶液上樣，上樣量：1. 5ml，超純水洗脫，洗脫速度： 0· 5ml/min〇
【文檔編號】C12P21/06GK104152518SQ201410200628
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月14日 優先權日:2014年5月14日
【發明者】丁國芳, 滕芳芳, 楊最素, 劉晨晨 申請人:浙江海洋學院