通過lps刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過LPS刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型。細菌脂多糖（LPS）具有破壞腸上皮屏障功能，本發明旨在鑒定來源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF（C-BF）是否對LPS誘導的腸炎具有保護作用。IPEC-J2是從豬空腸段分離的腸上皮細胞系，豬消化系統與人的非常相似。通過體內大鼠模型和體外豬IPEC-J2細胞模型檢測了Cathelicidin-BF保護LPS誘導的腸道屏障功能受損的作用。我們發現，外源Cathelicidin-BF對LPS誘導的大鼠腸道屏障功能受損和LPS致IPEC-J2細胞損傷模型有保護作用。
【專利說明】通過LPS刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域,具體涉及Cathelicidin-BF對脂多糖誘導的大鼠腸上皮屏障功能障礙及脂多糖致豬腸上皮細胞屏障損傷模型的保護作用。
【背景技術】
[0002]在體內小腸黏膜上皮成連續的單層狀，它在抵抗微生物引發的胃腸道疾病方面起著關鍵作用。屏障完整性缺陷，作為黏膜炎性疾病的主要病理生理學特征，導致滲透性增加進而導致水和血漿蛋白的滲漏到管腔，同時腸細菌和/或微生物的副產物移位進入體循環引起全身敗血癥。因此，維持腸上皮屏障的完整性對于腸道穩態是十分重要的。眾所周知，在體內，由革蘭氏陰性菌產生細菌內毒素(脂多糖，LPS)導致黏膜通透性增加是由LPS對腸上皮細胞如粘膜缺血的間接作用導致的。通過跨膜電阻(TER)所示，LPS對IEC -6細胞作用是破壞緊密連接蛋白的屏障功能。LPS增加腸上皮細胞的滲透性與腸緊密連接相關蛋白再分配有關。
[0003]體內和體外動物和人體試驗研究表明，LPS可能對腸屏障功能和細菌移位造成損害。盡管許多研究已證實LPS對腸道黏膜完整性具有破壞效果，但極少數試驗研究有效地應用于臨床和非抗生素治療LPS誘導的腸炎方法。
[0004]Cathelicidins是具有保守的親肽序列一大抗菌肽家族,首先在哺乳動物被發現。LL-37/hCAP-18是在人類中發現的唯一的抗菌肽，而我們研究中所涉及的抗菌肽C-BF是從爬行動物中首次被發現的Cathelicindin家族抗菌肽。雖然抗菌肽如cathelicidins有殺死病原微生物的活力，但有新的證據顯示這些肽在不同的生理過程，如細胞增殖和遷移，免疫調節，促進傷口愈合，血管生成，細胞因子和組胺的釋放等具有多個受體介導的功能。在小鼠上，Cathelicidins已被證實可以通過減少腸毒素引起的黏膜結構的改變部分降低艱難梭菌結腸炎和毒素A腸炎。從金環蛇蛇毒純化得到的Cathelicidin-BF是一個具有30個氨基酸的多肽，具有較高的抗菌活性和非常迅速的微生物殺滅效果。然而，抗菌肽C-BF是否有腸道屏障功能的維護和重建的保護作用從未進行過相關研究。
【發明內容】
[0005]本發明旨在鑒定來源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否對LPS誘導的腸炎有保護作用。
[0006]為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案:
一種通過LPS刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型，研究來源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否對LPS誘導的腸炎有保護作用，
1)對于大鼠，建立5mg/kg劑量脂多糖誘導雄性Sprague-Dawley大鼠腸炎模型,LPS采用腹腔注射的方式。大鼠通過腹腔注射不同濃度(5mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg) C-BF的PBS溶液，注射順序及時間為先注射不同劑量C-BF，24h后注射5mg/kg的LPS，于4h后處死取樣，研究抗菌肽C-BF的保護功能，另一種處理方式為先注射5mg/kg的LPS，于4h后注射不同劑量的C-BF，24h后處死取樣，研究抗菌肽C-BF的治療作用，側重于研究C-BF的保護功倉泛;
2)在體外建立LPS刺激豬腸道上皮細胞系J2 (IPEC-J2)細胞模型，處理方式為先10 μ g/ml C-BF處理24小時，再I μ g/ml LPS處理4小時后收取細胞。
[0007]進一步，3)對于大鼠，采取一截空腸段，利用尤斯灌流室測定電導率來評估腸上皮細胞和IPEC-J2細胞單層屏障的完整性，通過測定血漿D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)的水平評價大鼠腸上皮細胞的滲透性，通過RT-PCR和western blot測定緊密連接蛋白(TJs)mRNA和蛋白水平來評估其屏障功能，通過HE染色觀察腸上皮形態結構及測量絨毛高度與隱窩深度比值，通過透射電鏡觀察腸上皮細胞超微結構，通過免疫熒光和共聚焦成像法分析TJs在組織中位置和分布；
4)對于豬腸上皮細胞，利用尤斯灌流室測定跨膜電流，來評估營養物質轉運效率，通過透射電鏡，qRT-PCR, western-blot,免疫熒光技術方法評價C-BF對豬腸上皮細胞屏障功能的保護作用及初步機制；
5)綜合體內大鼠實驗和體外細胞實驗，評價C-BF在改善腸道屏障功能方面的作用。
[0008]本發明的有益效果在于:
在體內，通過LPS誘導的大鼠腸炎模型發現C-BF可以緩解空腸黏膜結構的改變，恢復上皮屏障功能，并阻止緊密連接蛋白表達下降。在體外，通過LPS誘導IPEC-J2細胞模型發現C-BF可以防止屏障功能中斷，還原和重新分配緊密連接蛋白。
[0009]這是第一次同 時從體內體外試驗揭示抗菌肽C-BF可通過改善腸屏障功能防止LPS誘導的腸炎。C-BF對改善LPS誘導的腸炎的保護作用表明它可被用在LPS介導的腸疾病的潛在的預防和治療藥劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1.LPS單獨處理或LPS+C-BF處理大鼠空腸黏膜結構的改變
圖1A是空腸黏膜H&E染色(X40)圖。對照:對照大鼠未經LPS和C-BF處理。LPS:大鼠用LPS單獨處理。LPS+5CBF，+10CBF, +20CBF:大鼠先注射LPS后分別再添加5，10或20mg/kg 的 C-BF。5CBF+, 10CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF 后再注射LPS，顯示不同濃度C-BF或LPS和C-BF不同添加順序對LPS誘導空腸黏膜改變的恢復作用。
[0011]圖1B是空腸黏膜的透射電鏡。對照:對照大鼠未經LPS和C-BF處理，上皮細胞和TJ (―)是完整的。LPS:大鼠用LPS單獨處理。LPS+5C，+10C, +20C:大鼠先注射LPS后分別再添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF。5C+，1C+, 20C+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg的C-BF后再注射LPS。顯示不同濃度C-BF或LPS和C-BF不同添加順序對LPS誘導空腸黏膜改變的恢復作用。
[0012]圖2是C-BF緩解LPS對大鼠上皮屏障的影響圖
(A) 10 或 20 mg/kg C-BF顯著抑制了 LPS誘導的 DAO增加(Ρ〈0.05)。(B) 10 mg/kg C-BF，無論在LPS注射之前還是之后添加,會引起血衆D-1actate水平的最顯著下降(P〈0.05)。(C) C-BF恢復了 LPS誘導的空腸營養物質吸收減少(P〈0.05)。(D) C-BF改善了 LPS誘導的空腸TER下降(P〈0.05)。LPS+5CBF, +10CBF, +20CBF:大鼠先注射LPS后分別再添加5，10或 20 mg/kg 的 C-BF。5CBF+，10CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF后再注射LPS。
[0013]圖3是C-BF抑制LPS誘導的緊密連接蛋白表達下降圖。
[0014](A)用LPS, LPS+5CBF, LPS+10CBF或LPS+20CBF處理大鼠的空腸黏膜緊密連接蛋白表達。C-BF (10, 20 mg/kg)顯著改善了 LPS誘導的Claudin-Ι和Occludin表達下降。C-BF (5，10，20 mg/kg)顯著改善了 LPS 誘導的 Claudin-2 和 JAM 表達下降。C-BF(20 mg/kg)顯著改善了 LPS 誘導的 TJP-1 表達下降。(B) LPS, 5CBF+LPS, 10CBF+LPS 和20CBF+LPS處理大鼠的空腸黏膜緊密連接蛋白表達。C-BF (5，10，20 mg/kg)顯著改善了LPS 誘導的 Claudin-2 和 Occludin、JAM 表達下降。C-BF (10, 20 mg/kg)顯著改善了 LPS誘導的Claudin-1表達下降。C-BF (5，10 mg/kg)顯著改善了 LPS誘導的TJP-1表達下降。LPS+5CBF，+10CBF, +20CBF:大鼠先注射 LPS 后分別再添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF。5CBF+，1CBF+, 20CBF+LPS:大鼠先添加 5，10 或 20 mg/kg 的 C-BF 后再注射 LPS。
[0015]圖4是C-BF降低LPS誘導的單層IPEC-J2細胞的TJs和完整性損害圖
(A)對照組、LPS和CB-F+LPS組IPEC-J2細胞TJs的透射電鏡圖片。對照組TJs (—)是完整的；LPS組，TJs (―)是受損的；CB-F+LPS組，TJs (―)是不完整的；(B)對照、LPS、CB-F+LPS的IPEC-J2細胞AISC。C-BF恢復了 LPS誘導的營養物質吸收下降。(C)對照、LPS、CB-F+LPS 組 IPEC-J2 細胞的 TER。
[0016]圖5是C-BF緩解LPS誘導的occludin和Z0-1表達下降圖
(A)添加C-BF對LPS誘導的occludin和Z0-1的mRNA表達影響；(B)添加C-BF對LPS誘導的occludin和ZO-1 的蛋白表達影響表；(C)經C-BF預處理后免疫熒光染色觀察LPS處理細胞相比occludin蛋白的分布；(D)經C-BF預處理后免疫熒光染色觀察LPS處理細胞相比Z0-1蛋白的分布。
【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖對本發明做詳細描述，實施例僅是描述而非限定本發明。
[0018]1、C-BF能減少由LPS誘導的大鼠空腸黏膜形態改變
為了評估C-BF在LPS相關腸炎中的潛在作用，我們在C-BF作用前后用LPS腹腔內注射健康成年大鼠(10只每組)。由圖1所示，LPS處理的大鼠產生腸炎并伴有腸黏膜形態改變，而在LPS注射前后添加C-BF則能顯著降低LPS誘導的空腸黏膜損害，可從H&E染色看出(圖1A)。LPS處理組可觀察到明顯的腸絨毛高度減少和隱窩深度增加(表一)。LPS處理前后添加10或20 mg/kg C-BF可顯著提高絨毛高度和減少隱窩深度(表一)。
[0019]
【權利要求】
1.一種通過LPS刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型，研究來源于蛇的抗菌肽Cathelicidin-BF (C-BF)是否對LPS誘導的腸炎有保護作用，其特征在于， 1)對于大鼠，建立5mg/kg劑量脂多糖誘導雄性Sprague-Dawley大鼠腸炎模型,LPS采用腹腔注射的方式，大鼠通過腹腔注射不同濃度(5mg/kg，10mg/kg, 20mg/kg)C-BF的PBS溶液，注射順序及時間為先注射不同劑量C-BF，24h后注射5mg/kg的LPS，于4h后處死取樣，研究抗菌肽C-BF的保護功能，另一種處理方式為調換兩者的注射順序，研究抗菌肽C-BF的治療作用； 2)在體外建立LPS刺激豬腸道上皮細胞系J2(IPEC-J2)細胞模型，處理方式為先10 μ g/ml C-BF處理24小時，再I μ g/ml LPS處理4小時后收取細胞。
2.根據權利要求1所述的通過LPS刺激建立的大鼠及豬腸道上皮細胞的綜合模型，其特征在于，進一步， 3)對于大鼠，采取一截空腸段，利用尤斯灌流室測定電導率來評估腸上皮細胞和IPEC-J2細胞單層屏障的完整性，通過測定血漿D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)的水平評價大鼠腸上皮細胞的滲透性，通過RT-PCR和western blot測定緊密連接蛋白(TJs) mRNA和蛋白水平來評估其屏障功能，通過HE染色觀察腸上皮形態結構及測量絨毛高度與隱窩深度比值，通過透射電鏡觀察腸上皮細胞超微結構，通過免疫熒光和共聚焦成像法分析TJs在組織中位置和分布； 4)對于豬腸上皮細胞，利用尤斯灌流室測定跨膜電流，來評估營養物質轉運效率，通過透射電鏡，qRT-PCR，western-blot，免疫熒光技術方法評價C-BF對豬腸上皮細胞屏障功能的保護作用及初步機制； 5)綜合體內大鼠實驗和體外細胞實驗，評價C-BF在改善腸道屏障功能方面的作用。
【文檔編號】C12Q1/26GK104031878SQ201410207726
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】汪以真, 張海文, 金靈紅 申請人:浙江大學