三個抗草丁膦水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及草丁膦的抗性顯著增強的谷氨酰胺合成酶，其是由野生型水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶經體外定向分子進化得到的突變體。突變體編號、氨基酸序列和對應氨基酸突變位點分別為：OsGS1m1，SEQIDNo2，G245S/G318V；OsGS1m2，SEQIDNo4，N54S/S115F/G245S；OsGS1m3，SEQIDNo6，V200A/T293A/R295K。對比草丁膦對酶活抑制常數Ki，突變體OsGS1m1、OsGS1m2、OsGS1m3分別比野生型谷氨酰胺合成酶的抗性提高了43.7、19、87.5倍。通過這三個突變基因在釀酒酵母中的功能驗證，進一步證明了這三個基因中的表達能提高釀酒酵母對草丁膦的耐受性（從10mM提高到100mM以上）。因為酵母表與植物表達模式非常接近，所以在酵母中的功能驗證結果表明三個突變體在培育抗草丁膦植物方面有很好的應用潛力。
【專利說明】三個抗草丁膦水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶突變體
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，具體涉及一組由人工合成的野生型水稻谷氨酰胺合成酶經DNA改組(DNA shuffling)技術得到的突變基因，該組基因編碼的谷氨酰胺合成酶對草丁膦的抗性顯著增強。該發明所述的基因可用于構建轉化植物的表達載體。
【背景技術】
[0002]轉基因抗草丁膦作物是僅次于抗草甘膦作物的第二位抗除草劑作物，已商業化的耐草丁膦作物有玉米、油菜、甜菜、棉花等。2001年加拿大種植的400萬公頃油菜中，80%是抗除草劑品種，其中抗草甘膦油菜占47 %，抗草丁膦油菜占13 %。草丁膦的殺草原理是它能抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS),使氨在植物體內迅速積累,光合作用和光呼吸停止，葉綠體受損，從而導致雜草死亡。常規作物不具有降解草丁膦的能力，如果直接接觸，草丁膦會殺死常規作物。耐草丁膦作物(商品名叫Liberty Link作物)含有來源于微生物的ifer或基因。這兩個基因編碼的草丁膦乙酰轉移酶(PAT)能夠催化乙酰輔酶A與草丁膦游離氨基結合，降解被植物吸收的草丁膦，從而消除草丁膦對谷氨酰胺合成酶抑制和植物氨代謝的干擾，賦予植物對草丁膦的耐性。Bar基因來自于潮濕鏈霉菌(5:hygroscopicus'),板pat基因則來自于綠色產色鏈霉菌(51 Viridochromogenes')。盡管兩個基因來源不同，但它們很相似。耐草丁膦作物之所以能夠抗草丁膦是因為這種作物具有分解草丁膦的能力，也就是說，草丁膦在接觸谷氨酰胺合成酶之前就被草丁膦乙酰轉移酶分解掉。為了提高ifer 基因在植物的表達，大多數生產上利用的基因都經過了密碼子偏愛改造，但是氨基酸序列沒有變化。雖然，小鼠喂毒試驗結果表明草丁膦乙酰轉移酶能在胃和腸道中徹底分解，在食用過程中不會出現潛在的危害。但是，由于該基因來源于微生物，而不是來源于農作物本身，不同程度上都會造成消費者的抵觸心理。
[0003]由于谷氨酰胺合成酶是草丁膦的靶標酶，盡管Bar能快速降解草丁膦，但是草丁膦在接觸谷氨酰胺合成酶之前很難徹底將其分解，因為很多谷氨酰胺合成酶分布在細胞膜上，因此草丁膦在轉Bar基因農作物上應用時，會不同程度地干擾植物的氮代謝，同時影響植物正常的生長和發育。目前抗草甘膦除草劑農作物的培育大多使用對除草劑不敏感的
基因。但是尚未見對草丁膦不敏感的谷氨酰胺合成酶基因及其商業應用的研究報道或專利，推測可能的原因是自然界缺乏草甘膦分解酶，而bar則對草丁膦具有很強的分解效果。植物中過量表達野生型谷氨酰胺合成酶只能部分緩解草丁膦傷害，如將豌豆來源的野生型^基因轉化小麥，轉基因植株可以緩解草丁膦的傷害，但耐性程度不足以商業化應用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供三個草丁膦抗性提高的水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶突變基因及其制備方法，所述突變基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No K SEQ ID No3、SEQID No 5所示；所述突變基因的氨基酸序列分別如SEQ ID No 2, SEQ ID No4、SEQ ID No 6所示；其對應的氨基酸突變位點分別為:G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K。這三個突變基因編碼的谷氨酰胺合成酶對草丁膦的抗性顯著增強。通過所述的突變基因在釀酒酵母中的表達和草丁膦耐受性的驗證，表明改組基因具有構建植物表達載體，獲得耐草丁膦植物的應用潛力。
[0005]為達到上述目的，本發明主要采用如下技術方案:
根據已知的水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶基因{OsGS\, Genbank登錄號AB037595)為基礎，人工合成了該基因并構建到大腸桿菌表達載體PYM4807，進一步采用DNAshuffling技術建立隨機突變文庫，并轉化缺陷型菌株JW3841-1，通過在不同濃度草丁膦(20-200 mM) M9固體培養基上的培養，篩選得到對草丁膦抗性提高的突變體。經序列測定，得到如SEQ ID No 1-6所示的核苷酸和氨基酸序列。突變體的編號和對應氨基酸突變位點分別為:0sGSlml，G245S/G318V ；0sGSlm2, N54S/S115F/G245S ；0sGSlm3, V200A/T293A/R295K。對比草丁膦對酶活抑制常數4，突變體OsGSlml、0sGSlm2、0sGSlm3分別比野生型谷氨酰胺合成酶的抗性提高了 43.7、19、87.5倍。通過這三個突變基因在釀酒酵母中的功能驗證，進一步證明了這三個基因中的表達能提高釀酒酵母對草丁膦的耐受性(從10 mM提高到100 mM以上)。因為酵母菌iSeiccheiromycGS cerevisiae)不僅具有原核系統生長快、容易培養和易于遺傳操作等優點，而且具有典型真核系統的特性，具有糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質折疊等翻譯后加工等過程，其表達模式與植物表達模式非常接近，所以在酵母中的功能驗證結果表明三個突變體在培育抗草丁膦植物方面有很好的應用潛力。
[0006]與現有技術相比，本發明的創造性在于:
利用生長快、容易培養和易于遺傳操作的原核系統篩選對草丁膦抗性提高的突變體，避免了因植物生長周期過長帶來的麻煩，提高了篩選效率；同時本發明還采用與植物表達模式接近的釀酒酵母驗證了突變體的功能。
[0007]有益效果
本發明提供的對草丁膦的抗性顯著增強的突變基因，具有用于構建轉化植物的表達載體，培育抗草丁膦轉基因作物的應用潛力。
[0008]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1轉化突變與OsGSl的大腸桿菌在不同濃度草丁膦M9固體培養基的生長情況的比較。草丁膦的濃度分別為0、10、25、75、100、200 mM。
[0010]圖2突變與OsGSl核苷酸序列比對。
[0011]圖3突變與OsGSl氨基酸序列比對。
[0012]圖4突變體和OsGSl序列和酶活特性的比較。
[0013]圖5轉化突變與OsGSl的釀酒酵母在不同濃度草丁膦SD-Trp固體培養基的生長情況的比較。草丁膦的濃度分別為0、10、20、50、100禮。
[0014]
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。
[0016]本發明實施中未注明的實驗方法，如連接、轉化、相關培養基的配制等參照分子克隆實驗指南第三版(黃培堂等譯，中國，科學出版社，2002)中方法進行。大腸桿菌谷氨酰胺合成酶缺陷型菌株JW3841-1 (glnA732::Kan)由美國耶魯大學大腸桿菌菌株保存中心(CGSC#10775)提供;質粒 pBluescrip SK+購自美國 Stratagene 公司；pYM4807 載體由實驗室自行構建保存(徐虎等，Characterizat1n of a Glucose-, Xylose-, Sucrose-,and D-Galactose -Stimulated b-Glucosidase from the Alkalophilic BacteriumBacillus, Curr Microb1l, 2011, 62:833-839);擴增使用的 KOD FX taq 酶購自日本Toyobo公司；所需引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，PYF1274載體購自上海永業農科生物工程有限公司；其它未注明的化學藥品為分析純級，購自上海國藥集團有限公司。
實施例
[0017]1、構建含有重組的細胞質型水稻谷氨酰胺合成酶基因的表達質粒
以細胞質型水稻谷氨酰胺合成酶基因基因(GenBank Access1n N0.AB037595)為模板，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成野生細胞質型水稻谷氨酰胺合成酶基因，該基因經及麗TI和fee I雙酶切后，以正確的閱讀框插入到大腸桿菌表達載體PYM4807中，獲得含有野生細胞質型水稻谷氨酰胺合成酶基因的質粒，定義為pYM4807-0sGSl。
[0018]2 DNA改組方法構建野生細胞質型水稻谷氨酰胺合成酶基因OsGSl基因突變文庫
2.1突變文庫的構建
I)基因的擴增:根據已知的PYM4807載體序列，用Primer 5.0設計Pl(GAGACGGTCACAGCTTGTCTG)和 P2(ATGCCTGGCAGTTCCCTACTC)兩條引物用于 PCR 反應。反應體系包括:1 μ L質粒pYM4807-0sGSl ；4 μ L 2.5 mmol/L dNTPs ；5 μ L 1XPCR Buffer ；0.3μ L rTaq ;引物各IyL ;補充ddH20至50 μ L0 PCR反應條件為，94預變性1min; 94 °C變性30s，72°C退火30s和延伸1.5 min，共35個循環，1.5%瓊脂糖膠回收1.5 Kb的基因片段，回收產物用入 100 μ L DNase I 緩沖液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1 mmol/L MgCl2)溶解。
[0019]2)DNase I酶解:在回收的基因片段里加入0.1 U DNase I, 30°C酶解3 min，經80°C處理1min失活DNase I后，用12%丙烯酰胺凝膠電泳對酶解產物進行分離，最后用透吸袋法回收50-1OObp的小片段。
[0020]3)無引物 PCR (Primerless PCR):反應體系包括 25 μ L 小片段 DNA ；4 μ L 2.5mmol/L dNTPs ;5 μ L 1XPCR Buffer ；0.3 μ L rTaq ；15.7 μ L ddH20;反應程序為，94 預變性 2 min; 94°C變性 30s, 42°C退火 30s ；72 °C延伸 2 min，共 45 個循環，1% Agrose 電泳檢測PCR擴增結果。
[0021]4)有引物PCR(Primer PCR):用I μ L無引物PCR擴增產物為模板，其它參照步驟I)進行PCR擴增，回收1.5 kp擴增產物。
[0022]5)擴增產物經3W//I和feci雙酶切后，以正確的閱讀框插入到大腸桿菌表達載體PYM4807中，通過電擊轉化大腸桿菌DH5 α感受態，獲得水稻谷氨酰胺合成酶基因AsM的首輪突變文庫。
[0023]2.2突變文庫的多輪構建和篩選
將實施例2.1所述的突變文庫轉化到缺陷型菌株JW3841-1后，涂布在含有20 mM草丁磷的M9平板上，28 ° C培養48 h。用牙簽挑取10個正常生長的單菌落，抽取質粒作為模板按照實施例2.1繼續建第二輪突變文庫；將第二輪突變文庫涂布在含有50 mM草丁磷的M9平板上篩選，同樣挑取10個正常生長的單菌落，抽取質粒作為模板建第三輪的突變文庫；在此基礎上，建立第四輪的突變文庫，涂布在200 mM草丁磷的M9平板上篩選，經回轉驗證，最終得到能抵抗此濃度的3個突變體(圖1)，編號分別為:0sGSlml、0sGSlm2、0sGSlm3。經序列測定，得到所述突變體的核苷酸序列，分別如SEQ ID No K SEQ ID No3、SEQ ID No5所示，通過比對發現核苷酸發生了如圖2所示的改變；經翻譯得到其編碼的氨基酸序列，分別如SEQ ID No 2、SEQ ID No4、SEQ ID No 6所示，通過氨基酸序列比對發現其對應的氨基酸突變位點分別為:G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K (圖 3，圖 4)。
[0024]3突變體酶活特性研究
3.1蛋白表達和純化
將野生型和實施例2.3得到的含有谷氨酰胺合成酶突變基因的質粒分別轉入大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)中，涂布于含有Ap (氨芐青霉素，100 Pg/ml)的2YT固體培養基中，37 1:培養過夜至長出菌落。挑取新鮮轉化的的3-4個克隆，接入100 ml含有Ap (100Kg/ml)抗生素的LB液體培養基中，用250ml搖瓶，37°C震搖培養至0D600值達到0.6-1.0。將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g 4°C離心5分鐘收集菌體。重懸細胞于5ml預冷的破碎緩沖液(100 mM This-鹽酸緩沖液，0.5M NaCl,0.5mg/ml 溶菌酶，ImM PMSF, ImM MgC12)中。把混合菌體在冰水中用超聲破碎儀破碎。破碎好的菌液經12000 rpm，4°C離心30分鐘后，收集上清。用0.45 μ m的濾膜過濾后，濾液用N1-NTA柱進行親和層析純化。
[0025]具體純化過程為:用1.5 mL平衡緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300mM NaCl,and 10 mM imidazole)平衡N1-NTA柱5次；吸取1.5 mL濾液上樣，待完全流出N1-NTA柱后，1.5 mL 清洗緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 20 mM imidazole)清洗五遍；最后用 I mL 洗脫緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 250 mMimidazole)洗脫2次。含有目的蛋白的洗脫液置于透析液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，0.1mM EDTA, and 10% glycerol)透析12 h后，用于SDS-PAGE電泳和測定酶活。
[0026]32酶活測定
谷氨酰胺合成酶酶活測定反應液組分為:100 mM Tris-HCl (pH 7.5)，20 mM ATP, 10mM L-glutamate, 30 mM hydroxylamine, 20 mM MgCl20 190 Μ.1 反應液 35。C 預熱分鐘后，加入10 μL酶液開始反應，反應30 min后，加入200 μL顯色液(55 g/L FeCl3.6H20,20 g/L三氯乙酸，2.1%濃鹽酸)終止反應。測定在540nM的光吸收值。酶活定義為每分鐘釋放出I Mmol Y-谷氨酰羥肟酸所需要的酶量。
[0027]3.3抑制常數&測定
在含不同濃度的草丁膦(0、20、50、100 μΜ)的測活體系中，改變底物L-glutamate的濃度(2、4、8、12、16、32、50 mM),測定不同底物下的酶促反應速度，通過Lineweaver - Burk雙倒數作圖，分別計算草丁膦對水稻野生型谷氨酰胺合成酶和突變體的抑制常數，結果祥見圖4。
[0028]4.突變體在釀酒酵母中的功能驗證4.1釀酒酵母表達載體的構建和轉化
將上述突變體連接入酵母表達載體pYF1274(此載體為大腸桿菌一釀酒酵母的穿梭載體，帶有大腸桿菌的colEl復制起點和氨芐(Ap)抗生素篩選標記；同時帶有酵母復制起點(centromere，CEN)，和編碼TRP合成酶的標記基因，因此在不含色氨酸的培養基上篩選酵母轉化子。PYF1274酵母表達載體帶有酵母PGK強啟動子和ADCl基因終止子，在啟動子下游插入了 630 bp的Cm抗性基因，可以替換成其他的外源基因，實現外源基因在釀酒酵母中的高效表達)，連接后得到的質粒分別用于釀酒酵母EGY48 (MATa, his3, trpl,ura3-52, leu::pLeu2_LexAop6)的轉化。
[0029]釀酒酵母轉化選用醋酸鋰法。5 ml釀酒酵母于30°C過夜培養至0D600為0.5左右，擴大培養至50ml，再生長4個小時后，5000rpm/分離心8分鐘收集細胞。以20ml無菌水洗，然而把離心收集的酵母以1ml現配的TE/LiAc (100 mM LiAc in TE)洗一次。7000轉/分離心8分鐘后,最終將酵母懸于0.5ml的TE/LiAc中。50 μ I的酵母懸液中加入Iyg的質粒DNA、50 μ g的鮭魚精DNA及300 μ I含40%PEG3350的TE/LiAc溶液，充分混勻后于30°C保溫30分鐘。接著于42°C熱激15分鐘。離心收集的酵母重懸于TE溶液中，并涂于不含色氨酸的酵母選擇培養基。
[0030]4.2功能驗證
挑取在不含色氨酸的酵母選擇培養基生長正常的克隆，接種到SD液體培養基中，28 ° C培養過夜，收集菌樣，分別稀釋到相同的濃度，取50 μ L轉接到含有不同濃度草丁膦的I mlSD-Trp液體培養基中。28 ° C振蕩培養36 h后觀察生長情況。結果表明這三個基因中的表達能提高釀酒酵母對草丁膦的耐受性(從10通提高到100 mM以上)(圖5)，因釀酒酵母和植物的表達模式類似，表明三個突變體在培育抗草丁膦植物方面有很好的應用潛力。
[0031]以上描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
【權利要求】
1.三個對草丁膦抗性顯著提高的水稻谷氨酰胺合成酶突變體，其特征在于，其由如SEQID No USEQ ID No3, SEQ ID No 5所示的核苷酸酸序列編碼。
2.權利要求1所述突變體，其特征在于，其氨基酸序列分別如SEQID No 2,SEQ ID No4、SEQ ID No 6 所示。
3.含有權利要求 1所述突變基因的酵母和植物表達載體及其應用。
【文檔編號】C12N15/81GK104164441SQ201410207844
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月17日 優先權日:2014年5月17日
【發明者】趙偉, 姚泉洪, 彭日荷 申請人:上海市農業科學院