一種抗ros氧化脅迫高效分泌表達外源蛋白的基因工程菌及其構建方法
【專利摘要】一種能抗ROS氧化脅迫的高效分泌表達重組外源蛋白的基因工程菌及其構建方法，屬于基因工程【技術領域】。本發明通過自克隆表達畢赤酵母(Picha?pastoris)N-乙酰轉移酶基因mpr1來降低誘導過程中細胞所受到的氧化脅迫。本發明以P.pastoris總DNA為模板經過PCR的方法獲得N-乙酰轉移酶基因mpr1，用pPICZ或者pPIC3.5系列構建mpr1表達載體，轉化P.pastoris，從而實現了N-乙酰轉移酶Mpr1在細胞內的過表達，以提升酵母抗氧化脅迫的能力。以胞外分泌表達來源于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶P.pastoris對照菌為例，當在工業級發酵培養基中發酵培養時，胞內過表達mpr1基因的重組菌的ROS含量同對照相比降低了62％，細胞活性則提高了14％；同時，目的蛋白α-葡萄糖苷酶的降解也被抑制。本菌株對研究進一步提高P.pastoris重組表達異源蛋白的表達效率具有很好的利用價值。
【專利說明】一種抗ROS氧化脅迫高效分泌表達外源蛋白的基因工程菌及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種將來源于P.pastoris自身的N-乙酰轉移酶Mprl進行自克隆表達，在此基礎上進一步重組轉入所需表達的外源基因，從而實現重組菌具有高抗ROS氧化脅迫功能和高效分泌外源蛋白的功能，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]N-乙酰轉移酶Mpr是乙酰轉移酶的一種，目前研究最多的是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的Mprl,并且在許多酵母中已經發現了它的同源基因。來源于芽殖釀酒酵母細胞Σ 1278b的mprl基因，編碼的N-乙酰轉移酶Mprl使脯氨酸類似物氮雜環丁烷二羧酸鹽(AZC)乙酰化，變成乙酰化AZC，從而防止生物將AZC作為脯氨酸利用造成中毒；在釀酒酵母對乙醇耐受性研究中發現mprl的缺失突變體對乙醇脅迫高度敏感，而mprl在酵母細胞內的共表達表達可以使酵母細胞獲得高乙醇耐受性。當酵母細胞在熱激、凍融、甲醇誘導的過程中會造成ROS水平提高，降低細胞活性從而影響表達效率，容易對發酵過程造成嚴重干擾，mprl基因的表達能夠降低酵母胞內的ROS水平，保護細胞在各種脅迫環境下的活 性，提高抗逆生物功能，如抗氧化脅迫、熱脅迫、凍融等。
[0003]P.pastoris表達系統是一種應用廣泛的高效表達外源蛋白的真核表達系統,它不僅克服了 E.coli等原核表達系統不能表達結構復雜的蛋白質、易形成不溶性包涵體等缺陷，而且彌補了昆蟲細胞及哺乳類細胞等真核表達系統操作復雜、產業化生產成本昂貴的不足。在P.pastoris利用甲醇為碳源和誘導劑的代謝中，其生理特性在于，除了具有普通好氧生物中線立體需氧呼吸鏈會釋放R0S，細胞在過氧化物酶體中利用乙醇氧化酶(AOX)氧化甲醇時也會產生大量的ROS物質如H2O2,從而導致P.pastoris受到更加強烈的氧化脅迫。將mprl基因在P.pastoris中表達之后，可以胞內的活性氧的含量，保護細胞免受氧化損傷，提高酵母細胞的活性而避免蛋白酶的分泌；可降低重組蛋白質在發酵液中的降解，有利于提聞重組蛋白質的表達水平。
[0004]近年來，隨著P.pastoris的廣泛應用，該表達系統的一些局限性日益突出，因此迫切需要解決P.pastoris受到強烈的ROS氧化脅迫給細胞造成的生理和功能上受損的問題。通過鑒定發現P.pastoris的mprl基因具有強烈的抗ROS的功能，因而可通過過表達Mprl酶以有效提升細胞看氧化脅迫的能力，這對進一步提高P.pastoris重組表達異源蛋白的表達效率具有很好的利用價值。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種在自身體內過表達Mprl酶的P.pastoris基因工程菌，當Mprl酶過表達時可增強酵母抗代謝甲醇過程中產生的ROS功能，在此基礎上再導入外源基因進行表達，從而提升細胞的表達效率。具體過程為:由P.pastoris GS115總DNA為模板經過PCR的方法獲得N-乙酰轉移酶基因mprl，將mprl基因與載體連接，重組質粒經限制性內切酶酶切線性化后電轉至P.pastoris中，經抗性平板篩選后最終獲得mprl基因過表達的重組菌株。在此基礎上，繼續向過表達菌株中導入需要表達的外源基因，從而獲得抗ROS氧化脅迫高效分泌外源蛋白的基因工程菌。
[0006]以本實驗室前期采用P.pastoris胞外表達來源于黑曲霉Aspergillusniger的α-葡萄糖苷酶88111°1>基因為例，所構建的菌株為P.paStoriS/pPIC9K-aglu°P，可分泌表達 α _ 葡萄糖苷酶。詳見:Xu Liu, Dan Wu, Jing Wu, Jian Chen.0ptimization of theproduction ofAspergillus niger a -glucosidase expressed in Pichiapastoris.World J Microbiol Biotechnol, (2013)29:533-540。在 mprl 過表達基因工程菌中進一步導入α -葡萄糖苷酶aglu°P基因構建重組表達菌株P.pastoris/pPIC9K-aglu°7pPICZA-mprl,以P.pastoris/pPIC9K-aglu0P為對照，在3L罐進行對比發酵，觀察細胞活性和胞內活性氧含量變化。P.pastoris/pPIC9K-aglu°7pPICZA-mprl細胞活性比對照菌高出14%，活性氧含量降低了 62%，對發酵液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析發現，P.pastoris/pPIC9K-agIU0VpPICZA-mprI菌株表達的α -葡萄糖苷酶在發酵過程中的降解明顯減少，α -葡萄糖苷酶比活提高27 %。
[0007]本發明的優點在于:通過過表達mprl基因提升細胞抗ROS氧化脅迫功能，在超過100小時甲醇誘導過程中顯著降低了 R0S，從而避免了其對細胞器的損傷，提高了細胞活性。起到了延長細胞分泌表達時間和減少蛋白酶分泌的作用，從而提高細胞的表達效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1N-乙酰轉移酶基因mprl基因PCR產物核酸電泳圖。
[0009]M, DL2, 000DNA Marker ;1、2:目的基因 [0010]圖2重組大腸桿菌JM109胞內上清液SDS-PAGE圖。
[0011]圖3 重組菌 P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl 胞內上清液 SDS-PAGE 圖。
[0012]M，分子量標準蛋白；α對照，出發菌株；α 2、α 3、α 4，重組菌株；箭頭，Mprl酶
[0013]圖 4Ρ.pastoris/pPIC9K-aglu0P 菌株與 P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl菌株搖瓶培養158h，流式細胞儀檢測細胞活性和胞內ROS含量分析。
[0014]B12:P.pastoris/pPIC9K-aglu0P ；A12:Ρ.pastoris/pPIC9K-aglu°p/pPICZA-mprl。
[0015]圖 5Ρ.pastoris/pPIC9K_agluQp 菌株與 P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl菌株與3L罐發酵過程OD對比。
[0016]P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl ( )，Ρ.pastoris/pPIC9K-aglu0P(A)。
[0017]圖 6Ρ.pastoris/pPIC9K-aglu0P 菌株與 P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl菌株3L罐發酵過程蛋白電泳圖對比。
[0018]圖 6 左:P.pastoris/pPIC9K-agluOT,圖 4 右:P.pastoris/pPIC9K_aglu0P/pPICZA-mprI ο
[0019]M，分子量標準蛋白；A目的條帶，B降解條帶。
【具體實施方式】
[0020]實施例1:mprl轉乙酰功能鑒定
[0021 ] 1、根據NCBI上登錄的mprl的基因序列(Genbank號8198718)設計引物從P.pastoris GSl 15總DNA中經過PCR獲得N-乙酰轉移酶基因mprl，連接到T載體，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經37°C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8~IOh后提取質粒，將此質粒進行測序鑒定。結果表明此基因全長627個核苷酸，和NCBI上登錄的mprl的基因序列完全相同，電泳條帶大小如圖1。
[0022]2、從T載上進行PCR獲得mprl基因，和質粒pQE30經酶切連接構建大腸桿菌重組表達載體，將重組質粒轉化大腸桿菌JM109，經轉化、抗性平板篩選獲得重組表達菌株，在搖瓶中進行誘導表達。經ITPG誘導18h后轉乙酰酶活達到1.75U/mL，含空載的重組菌轉乙酰酶活為O。電泳條帶如圖2所示，后面3個泳道中24kd的條帶為Mprl酶條帶。由此鑒定P.pastoris中Mprl酶也具有類似S.cerevisiae中Mprl酶的轉乙酸活性。
[0023]實施例2:mprl過表達基因工程菌的構建
[0024]1、將pPICZA質粒和重組T載體分別進行BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶連接得到pPICZA-mprl，酶切驗證質粒片段大小正確。
[0025]2、重組表達載體pPICZA-mprl經Sac I單酶切線性化后電轉至P.pastoris KM71中，將重組菌涂布與含2mg/mL Zeocin抗性的YPD平板。挑取抗性平板上的單菌落接種于IOmL含Zeocin抗生素的YPD培養基(蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L)，30°C培養過夜，提取酵母基因組進行PCR鑒定菌株重組正確，命名為P.pastoris/pPICZA-mprl,接甘油管保藏。將過表達菌株進行搖瓶發酵培養，誘導96h后收集菌體，高壓破壁，破壁上清SDS-PAGE結果如圖3所示，可見約23KD左右的Mprl酶的蛋白條帶。
[0026]實施例3:本例說明mprl的過表達能顯著提高細胞抗ROS氧化脅迫功能并有利于提聞外源蛋白質的表達水平。
[0027]將來源于黑曲霉Aspergillus niger的α -葡萄糖苷酶aglu°P基因和pPIC9K質粒構建重組質粒并轉化mprl基因過表達菌株P.pastoris/pPICZA-mprl,經G418抗性平板篩選獲得重組菌株命名為P.pastoris/pPIC9K-aglu°p/pPICZA-mprl。將該菌株和對照菌P.pastoris/pPIC9K-aglu0P進行3L罐發酵培養實驗。
[0028]吸取200μ L的甘油管菌液接種于裝有50mL種子培養基的500mL三角瓶中，30°C、200r/min培養22~24h，將上述培養液以10%接種量接入裝液量為IL的3L發酵罐(B10FL0, America)，控制pH5，培養溫度30°C，通過與攪拌轉速偶聯和調節通氣量將溶氧維持在20% -30%，當溶氧迅速上升，開始指數流加甘油補料液，當菌體濃度達到一定值時，停止補料，溶氧再次反彈后，繼續保持基質匱乏狀態約Ih后，開始誘導階段，設置誘導溫度26°C，添加2%甲醇，溶氧開始下降后，通過甲醇電極(FC2002，華東理工大學)維持甲醇濃度0.5%，誘導α-葡萄糖苷酶表達。誘導發酵過程中取樣測細胞活性和胞內ROS含量，如圖4所示，對照菌株P.pastoris/pPIC9K-aglu0P細胞活性和ROS含量分別為78.5%和97.2%,過表達 mprl 菌株 P.pastoris/pPIC9K-aglu0P/pPICZA-mprl 細胞活性和 ROS 含量分別為89.6%和92.7%。相比之下，過表達Mprl酶可以有效提高細胞抗ROS能力和提升細胞活性。另外，P.pastoris/pPIC9K-aglu°p/pPICZA-mpr 10D長時間維持在300左右(圖5)，細胞OD顯著高于對照菌。取發酵上清液SDS-PAGE進行檢測，結果參見圖6，在誘導大致相同時間下，如在對照菌株誘導113小時降解條帶(圖6左圖B)要濃于目的條帶(圖6左圖A)，而在mprl過表達菌株中誘導123小時還沒有出現降解條帶(圖6右圖)，說明提高P.pastoris抗ROS氧化脅迫能力有利于抑制α -葡萄糖苷酶在發酵過程中的降解。通過計算各自的比活，mprl過表達菌株到123h時的比活還維持在1.21U/mg,而對照在113h時的比活僅 為0.95U/mg，顯示在過表達菌株發酵中的重組α -葡萄糖苷酶具有更好的穩定性。
【權利要求】
1.一種抗ROS氧化脅迫高效分泌表達外源蛋白的基因工程菌及其構建方法，所構建的菌株在抗ROS氧化脅迫能力上有明顯提升。將外源基因導入該基因工程菌中，有利于菌株聞效表達蛋白質。
2.根據權利要求1所述的抗ROS氧化脅迫的基因工程菌，其特征在于，所用的抗ROS氧化脅迫基因為畢赤酵母自帶的mprl基因，將此基因過表達以提高細胞抗ROS氧化脅迫功能，mprl基因序列的NCBI登陸號為8198718，基因序列如SEQ ID Nol所示。
3.根據權利要求2所述重組基因工程菌，其特征在于，所用于過表達的載體為pPICZ系列或者pPIC3.5系列，所用的菌株為P.pastoris。構建重組菌步驟如下: 1)提取畢赤酵母基因組，并以此為模板，PCR擴增獲得mprl基因； 2)構建含mprl基因的重組質粒，轉化至E.coli JM109中擴增； 3)將重組質粒經酶切線性化后電轉至P.pastoris中，于抗性平板上挑選轉化子。
【文檔編號】C12R1/84GK103981111SQ201410208206
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】吳敬, 朱海峰, 吳丹 申請人:江南大學