一種人基因組dna26個基因座的復合擴增的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種同時分析人基因組DNA26個基因座的五色熒光標記復合擴增系統，同時檢測15個常染色體基因座，10個Y染色體基因座及一個性別鑒定基因座；本發明將26個基因座分為4組，共涉及5種顏色的熒光標記；本發明的熒光標記復合擴增系統的靈敏度高，在DNA模板量為0.12ng的條件下，可檢出全部26個基因座；適用于血濾紙、FTA卡采集樣本以及提取DNA樣本的直接擴增。
【專利說明】—種人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種26個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統，具體是涉及一種同時分析人基因組常染色體及Y染色體基因座的五色熒光標記復合擴增系統，該系統可以應用于個體識別和親子鑒定。
【背景技術】
[0002]短串聯重復序列基因座(STR)是目前普遍應用的遺傳標記。90年代初STR基因座多態性的發現，特別是STR基因座具有片段小容易擴增，適宜于檢驗微量和降解檢材，而且各基因座的擴增條件相似而能夠復合擴增，因而具有靈敏、準確、快速、信息量大等優點。尤其是在建立DNA數據庫方面，STR復合擴增技術具有極大的優越性。因此美國FBI選擇了 13個STR基因座用于建立DNA數據庫一CODIS(CombinedDNA Index System):CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TP0X、vWA。這些STR基因座通常被稱為13個核心基因座。
[0003]正因為STR所具備的優點和應用前景，法醫學界以及一些大的公司均投入大量的資金對其進行了開發性的研究。90年代中后期以美國AB公司為代表的研發商建立起熒光復合擴增體系。目前最具代表性的是ABI (Applied B1systems, USA)公司的Identifiler?和Promega(USA)公司的PowerPlex-16突光檢測試劑盒。這兩個試劑盒均包括上述13個核心基因座。
[0004]人類Y染色體是小的近端著絲粒染色體，它由長臂和微小的短臂兩部分組成。Y染色體，除擬常染色體 區外，在減數分裂中不發生交換重組，呈單倍型獨立向下傳遞，表現出父系遺傳特征，同時序列的變異完全由累積的突變所致，并非重組引起。由于Y染色體的這些特點，Y染色體STR基因座(簡稱Y-STR)遺傳標記作為一種工具已經被廣泛應用于法醫鑒定、親權鑒定、失蹤人員鑒定、人類遷移進化研究、歷史和家系進化研究等多個領域。已發現的Y-STR基因座已有400多個，常用來檢測的Y-STR基因座有9個歐洲最小單倍型基因座，包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/I1、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393 和 2 個美國 DNA分析方法技術工作組(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,簡稱 SWGDAM)推薦的基因座，包括DYS438、DYS439。
[0005]在法醫鑒定與親子鑒定領域，DNA分析主要依賴商業化的試劑盒進行。第一個Y-STR試劑盒是由ReliaGene Technologies在2001年研發的Y-PLEX?6，可復合擴增DYS19、DYS389I1、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b ；2002 年 ReliaGene Technologies又研發了可復合擴增 DYS3891、DYS389I1、DYS439、DYS438、DYS392 的 Y-PLEX?5，到 2003年 9 月 ReliaGene Technologies 推出了整合了 Y_PLEXTMf^P Y-PLEX?5 所有基因座在內的Y-PLEXtm120同年10月，Promega公司推出了 PowerPlex Y試劑盒，可復合擴增12個基因座，其中包括 DYS19、DYS385a/b、DYS3891、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。2004 年秋，Applied B1systems 公司(簡稱 AB 公司)發布了包含 17 個Y-STR基因座的YfiIer?試劑盒，其在PowerPlex Y的基礎上增加了另外5個具有高度多態性的 Y-STR 基因座，即 DYS456、DYS458、DYS635、Y GATAH4、DYS448。
[0006]隨著法醫DNA分型技術的發展，目前已經能對類似血痕、精斑、唾液斑、毛發、骨骼等進行DNA分型；同時，隨著PCR技術的發展，多重復擴體系可檢測的基因座數量也越來越多。專利201010282414.X公開了一種同時分析人基因組DNA的多個基因座的熒光標記復合擴增系統，用于檢測如下15個常染色體基因座:D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D6S1043、TPOX, TH01、D2S1338、CSF1P0、vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51。該專利提供了對15個常染色體基因座和一個性別基因座的分型結果，為五色熒光檢測系統。目前，在法醫檢測中，常染色體分型與Y染色體檢測一般都是分開的。最多在常染色體檢測中加入了 DYS391。因為DYS391多態性差，主要用于輔助性別判定。如果能同時檢測常染色體基因座及多態性更高的Y染色體基因座，既能用Y染色體基因座信息于嫌疑人的快速排查，又能根據常染色體基因座信息確定嫌疑人。
【發明內容】
[0007]發明201010282414.X提供了一個同時擴增15個常染色體基因座及I個性別基因座的方案。本發明在201010282414.X方案基礎上，將D6S1043基因座改為D19S433基因座，這樣使得基因座和ABI (Applied B1systems, USA)公司的Identifiler?試劑盒基因座一樣，同時加入了 10個Y染色體基因座，構成了一個26個基因座的復合擴增體系。滿足常規法醫檢測及嫌疑人的快速排查。
[0008]本發明的目的之一在于:提供一種通過復合擴增26個基因座來進行個體識別和親子鑒定的熒光標記STR復合擴增檢驗系統，同時檢測15個常染色體基因座、10個Y染色體基因座及一個性別基因座。涉及檢測人基因組中具有多態性的遺傳標記。本發明特別涉及用聚合酶鏈式反應 在一個體系中同時擴增多個短串聯重復基因座。
[0009]為了實現本發明的目的，采用如下技術方案:
[0010]一種人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，包括有用于擴增如下26個基因座的引物:Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、DYS635、DYS456、TP0X、TH01、D2S1338、CSFlP0、DYS385ab、DYS458、DYS391、vWA、D5S818、FGA、DYS392、DYS390、D8S1179、D21S11、D18S51、DYS393、DYS438。
[0011]上述26個基因座的引物及引物在擴增體系中的濃度優選如下:
[0012]表1各個基因座的引物及濃度
[0013]
【權利要求】
1.一種人基因組DNA 26個基因座的復合擴增的試劑盒，包括有用于擴增如下26個基因座的引物:Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、DYS635、DYS456、TP0X、TH01、D2S1338、CSFlP0、DYS385ab、DYS458、DYS391、vWA、D5S818、FGA、DYS392、DYS390、D8S1179、D21S11、D18S51、DYS393、DYS438。
2.根據權利要求1所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于，所述的引物的序列是:Amelogenin, SEQ ID N0.1 ~2、D3S1358, SEQ ID N0.3 ~4、D13S317, SEQ ID N0.5 ~6、D7S820，SEQ ID N0.7 ~8、D16S539，SEQ ID N0.9 ~10、D19S433，SEQ ID N0.11 ~12、DYS635，SEQ ID N0.13 ~14、DYS456，SEQ ID N0.15 ~16、TP0X，SEQ IDN0.17 ~18、TH01，SEQ ID N0.19 ~20、D2S1338，SEQ ID N0.21 ~22、CSF1P0，SEQ ID N0.23 ~24、DYS385ab, SEQ ID N0.25 ~26、DYS458, SEQ ID N0.27 ~28、DYS391, SEQ ID N0.29 ~30, vffA, SEQ ID N0.31 ~32、D5S818，SEQ ID N0.33 ~34、FGA，SEQ ID N0.35 ~36、DYS392，SEQ ID N0.37 ~38、DYS390，SEQ ID N0.39 ~40、D8S1179，SEQ ID N0.41 ~42、D21S11，SEQID N0.43 ~44、D18S51, SEQ ID N0.45 ~46、DYS393, SEQ ID N0.47 ~48、DYS438, SEQ IDN0.49 ~50。
3.根據權利要求1所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于，各個引物在擴增體系中的終濃度是:SEQ ID N0.1~2:0.5 μΜ ；SEQ ID N0.3~4:0.8 μ M ；SEQ ID N0.5 ~6: 0.66 μ M ；SEQ ID N0.7 ~8: 1.34 μ M ；SEQ ID N0.9 ~10:0.64μΜ ；SEQ ID N0.11 ~12:0.4 μ μΜ ；SEQ ID N0.13 ~14:1.74μΜ ；SEQ ID N0.15 ~16:0.84 μ M ；SEQ ID N0.17 ~18:0.54 μ M ；SEQ ID N0.19 ~20:0.76 μ M ；SEQ ID N0.21 ~22:0.7 μ M ；S EQ ID N0.23 ~24:0.88 μ M ；SEQ ID N0.25 ~26:0.88 μ M ；SEQ ID N0.27 ~28:1.94μΜ ；SEQ ID N0.29 ~30:1.56μΜ ；SEQ ID N0.31 ~32:2.ΙμΜ ；SEQ ID N0.33 ~34:1.16μΜ ；SEQ ID N0.35 ~36:L 34μΜ ；SEQ ID N0.37 ~38:7μΜ ；SEQ ID N0.39 ~40:4.7μΜ ；SEQ ID N0.41 ~42:1.34μΜ ；SEQ ID N0.43 ~44:1.6μΜ ；SEQ ID N0.45 ~46:1.ΙμΜ ；SEQ ID N0.47 ~48:5 μ M ；SEQ ID N0.49 ~50:0.5 μ M。
4.根據權利要求1所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于:所述的用于擴增每個基因座對應的引物中，至少有一個引物的5’端是經過標記的。
5.根據權利要求4所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于:所述的引物是通過熒光標記的。
6.根據權利要求5所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于:26 個基因座可以進行分組標記，Amel、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433 和DYS635 為第一組；DYS456、TPOX, THOU D2S1338、CSF1P0、DYS385ab 和 DYS458 為第二組；DYS391、vffA, D5S818、FGA、DYS392、DYS390 為第三組；D8S1179、D21S11、D18S51、DYS393、DYS438為第四組。
7.根據權利要求6所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于:每組使用6-FAM、HEX、TEMRA或ROX中的任一種進行標記，內標選用橙色熒光SIZ，而且各組之間的標記色都不相同。
8.根據權利要求1~7任一項所述的人基因組DNA26個基因座的復合擴增的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒的組成是=React1n Mix, 10.0 yL ;基因組DNA，0.1-10 μ I ;引物混合物，5.0 μ L ；Taq 酶，0.5 μ L ；sdH20,補足至 25.0 μ L ;所述的 React1n Mix 為 MgCl2.7.5mM, Tris-HCl buffer 125mM, KCl 125mM, dNTPs 7.5mM , BSA 2mg/mL。
9.根據權利要求1~7任一項所述的人基因組DNA 26個基因座的復合擴增的試劑盒在個體識別 或親子鑒定中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031989SQ201410208458
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】周懷谷, 鄭衛國, 李發院, 盧青, 葛海鵬, 郭育林, 葛斌文, 王於建, 胡琦 申請人:無錫中德美聯生物技術有限公司, 上海市刑事科學技術研究院