專利名稱：表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，能表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒重組體(rAAV-asPLB)的構建和制備方法，更具體地說涉及人類受磷蛋白基因的克隆及含反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒重組體的包裝制備方法，和所述的重組腺相關病毒重組體的藥學用途。
背景技術：
受磷蛋白(phospholamban，簡稱PLB)是一種分子量較小的蛋白質，由52個氨基酸殘基構成，主要存在于心肌和平滑肌(J Biol Chem，2496174-6180(1974))。體外研究提示PLB可被不同的蛋白激酶磷酸化，而磷酸化的PLB解除了其對SERCA2a的抑制效應，引起磷酸化介導的刺激作用(J Biol Chem，26113333-13341(1986)；Biochem J，252269-273(1988))。因此，在正常心肌，PLB是肌漿網鈣ATPase(SERCA2a)的抑制劑。研究發現心衰時收縮功能異常與PLB磷酸化減少及PLB/SERCA2a比值的升高有關(Circulation Research，791059-1063(1996))。因此通過降低PLB的水平或增加PLB的磷酸化，減少其對SERCA2a的抑制，間接提高SERCA2a水平是基因治療心衰的一個重要策略。
在PLB基因敲除或過表達的大鼠，研究表明PLB/SERCA2a的比值是改善心肌舒張功能的一個潛在靶點。用腺病毒載體導入反義phospholamban(Ad.asPL)基因可提高大鼠心肌細胞SERCA2a的鈣敏感性，調節鈣的自身平衡。Monte等亦用腺病毒載體將反義phospholamban(Ad.asPL)基因及SERCA2a基因分別轉染終末期心衰患者的游離心肌細胞，發現Ad.asPL基因起到與SERCA2a基因相同的改善心肌細胞功能的作用(J Mol Cell Cardiol，31479-91(1999))。但腺病毒載體表達時間短、對機體有免疫原性，不適合將來的臨床應用。
在各種情況下，有重要的原因開發和制備表達人類受磷蛋白反義基因的重組腺相關病毒重組體，因為它可以用作治療各種原因尤其是原發性心肌病等所致心力衰竭，改善心肌的收縮和舒張功能的潛在藥物。
發明內容
本發明的第一個目的是提供含有反義人受磷蛋白基因的重組腺相關病毒；本發明的第二個目的是提供含有反義人受磷蛋白基因的重組腺相關病毒的包裝和制備過程；本發明的第三個目的是提供利用含有反義人受磷蛋白基因的重組腺相關病毒治療心力衰竭的動物實驗方法和結果。
為了實現本發明的上述目的，本發明人已經成功從人心肌細胞中克隆出PLB基因，并成功將PLB cDNA反向插入真核表達載體pXXUF1中構成重組質粒pXXUF1-asPLB。之后，將pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB用鈣磷共轉染法轉入293細胞包裝制備能表達人反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒，采用肝素柱純化，斑點雜交法測定滴度。另外，將包裝制備的重組腺相關病毒經靜脈導入心肌梗塞大鼠發現大鼠心肌組織中PLB蛋白質的表達長期受到明顯抑制，說明重組腺相關病毒能介導反義PLB基因長期有效表達，從而抑制心肌PLB蛋白質的表達。并且發現心肌梗塞大鼠心肌的收縮和舒張功能得到明顯的改善，主動脈對血管舒縮因子的反應能力增強。
為了獲得人PLB基因，本發明人首先設計了擴增PLB cDNA片段的特異性引物，利用從人心肌細胞分離的總RNA作為模板進行RT-PCR。作為結果，獲得了顯示陽性反應的PLB cDNA，將獲得的片斷插入克隆載體，在寄主細胞(大腸桿菌)中導入這樣獲得的載體。另外為了獲得含人反義PLB基因的重組腺相關病毒，本發明人又將PLB cDNA反向插入真核表達載體pXXUF1，構成重組質粒pXXUF1-asPLB，同樣導入寄主細胞即大腸桿菌，獲得陽性克隆。
本發明一種表達人類受磷蛋白反義基因的重組腺相關病毒，該重組腺相關病毒由天然狀態的腺相關病毒和腺病毒經分子生物學方法人工剪切、修飾和加工而成，該載體系統包括包裝質粒pXX2，輔助質粒pXX6，真核表達載體pXXUF1和pXXUF3，并在真核表達載體pXXUF1內反向插入了人類受磷蛋白基因編碼序列，1)包裝質粒pXX2它含有編碼腺相關病毒Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列，并在上游和下游各插入一個p5啟動子，使表達效率可以提高15倍；2)輔助質粒pXX6其刪除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它們表達的蛋白質可發揮輔助作用以刺激AAV基因的轉錄和翻譯，保證AAV的產量；3)真核表達載體pXXUF1所用的是CMV啟動子，有較強的表達效率，其含有Not I多克隆位點，可以連接不同的目的基因，pXXUF1反向連接人受磷蛋白基因，該載體含有rAAV轉基因表達所必須的末端ITRs重復序列，負責病毒的復制和病毒外殼的包被并攜帶目的基因，本發明一種藥物組合物，它包括有效量的權利要求1所述的表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒和藥學上所接受的載體或賦形劑。
本發明一種制備表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒的方法，1)提供腺相關病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列——pXX2質粒，和刺激腺相關病毒復制和轉錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因——pXX6質粒；2)提供含腺相關病毒基因組的真核表達載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區，并反向插入人類受磷蛋白基因，形成重組質粒pXXUF1-asPLB；3)將步驟1)中的pXX2、pXX6和pXXUF1-asPLB步驟2)共轉染293細胞，適時回收，并純化、檢測其病毒滴度；4)將步驟3)中回收純化的病毒經尾靜脈注射入心力衰竭動物體內，檢測其生物學活性。
本發明在步驟3)中共轉染的方法是鈣磷DNA共沉淀轉染法，真核表達載體pXXUF1所含啟動子為CMV啟動子，純化是用氯化銫梯度離心法，而檢測滴度是用斑點雜交法。
本發明一種表達人類受磷蛋白反義基因的重組腺相關病毒，已保藏于武漢大學內中國典型培養物保護中心，保藏日期2003年7月9日，保藏編號V200308分類命名反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒antiphospholamban/AAV本發明的優越性在于它克服了其他基因表達載體所難以克服的缺點，它可以攜帶目的基因轉染分裂期和非分裂期細胞(即具有廣泛的轉基因范圍)、無副作用(無免疫源性)、感染效率高、能驅動目的基因在體內長期表達，而且成功地解決了無腺病毒污染的體外大量復制問題，從而成為基因治療最有前途的載體。為了能使心力衰竭的基因治療真正實現，我們將人類受磷蛋白cDNA與重組腺相關病毒載體重組構建，并經檢測已獲得了可以滿足治療要求的高滴度，在動物實驗中也已證實了其可以有效改善心臟收縮和舒張功能，從而有希望真正滿足臨床治療的需要。
另一方面，研究了我們包裝制備的含人反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒對心急梗死大鼠心功能及心肌重塑的影響，證明rAAV-asPLB經靜脈轉染心肌梗塞大鼠模型后，能有效阻斷大鼠心肌組織PLB的表達，明顯改善左室血流動力學各項指標，提高LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP及-dp/dtmax，并增強主動脈環對血管活性物質(去甲腎上腺素)的收縮反應性，減輕心肌膠原沉積、改善心肌的重塑。
顯示上面提到的本發明的表達人反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒制備方法成功，所制備的重組腺相關病毒滴度高，能驅動目的基因長期有效的表達，可以用于心梗及其他相關性疾病所致心力衰竭的治療。
圖1顯示了PLB的序列(取自GENEBANK)，圖2是顯示pXXUF1-asPLB的質粒構成，圖3顯示了腺相關病毒的核苷酸序列及具體分區，圖4是顯示腺相關病毒的基因組構造圖，圖5是顯示腺相關病毒的ITR序列及二級結構圖，圖6是顯示腺相關病毒的轉錄和翻譯(一)，圖7是顯示腺相關病毒的轉錄和翻譯(二)，圖8是顯示pXX2、pXX6質粒圖譜構成，圖9是顯示pXXUF1質粒構成(注該質粒構成圖只顯示質粒的主要部分，實際上這兩種質粒已加工為5000-7000bp的環狀結構，其余部分無重要性，故不寫入)，圖10是顯示斑點雜交測定病毒滴度結果。
具體實施例方式
在下面的實施例中進一步說明了本發明，這并不限制本發明的范圍。
PLB cDNA的克隆為了克隆人PLB cDNA根據圖1公開的PLB基因序列首先設計了可擴增PLB cDNA的PCR引物即5，-ATTGGATCCGCTGGTATCATGGAG-3的正向引物和5，-ATCCTCGAGTCAGAGAAGCATCAC-3的反向引物。然后用自胎兒心肌細胞中提取的總RNA作為模板，進行RT-PCR。逆轉錄反應在20μl的反應體系中進行，該體系含有10×緩沖液2μl，25nMMgCl2 4μl，10mmol/L dNTPs 2μl，25U/μl的逆轉錄酶1μl(GibcoBRL)，5μg由胎兒心肌細胞經Trizole試劑提取的總RNA，50pmol/Lrandom 9mers 1μl，30℃10min，55℃30min，99℃5min，5℃5min，該RT產物用作PCR模板。
PCR反應在50μl的反應體系中進行，上述RT產物10μl，10×PCR緩沖液4μl，終濃度為0.3μmol/L的上、下游引物各1μl，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PCR熱循環儀中，94℃預變性4min，然后94℃45s，55℃45s，72℃1min，35個循環，最后72℃延伸7min，電泳后回收1080bp目的片段。以限制性內切酶BamH I和Xho I酶切后的PLB及載體pBluscript KS+(pBS)片段經T4 DNA連接酶連接。5μl DNA連接產物轉化DH5α感受態細菌，挑取克隆接種于5ml含氨芐青霉素(70μg/ml)的LB培養基中，培養16h后小量提取質粒DNA，酶切鑒定DNA目的片段正確構建于pBS載體中(pBS·PLB)，并經大連寶生物公司測序證實。
pXXUF1·asPLB重組質粒的制備將實施例1中獲得的PLB基因產物與pXXUF1相連。測序正確的重組體pBS·PLB經酶切位點的轉導，最終使得目的基因PLB兩端均含有Not I位點，以限制性內切酶Not I分別對PLB及載體pXXUF1進行單酶切后瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收所要片段，按上述方法制備重組質粒pXXUF1·asPLB。PLB cDNA將pXXUF1中的gfp基因取代，質粒圖如圖2。
rAAV-asPLB重組病毒的包裝、回收與純化一、天然腺相關病毒(AAV)及重組腺相關病毒(rAAV)載體的特點腺相關病毒是一種動物單鏈DNA病毒，它屬于細小病毒科，細小病毒亞科，依賴病毒屬，自然缺陷、無包被和無致病原性。
1、AAV基因組是一個線性、單鏈(ssDNA)分子，含4680個核苷酸(序列如圖一)，其特點在于1)其基因組由4個開放閱讀寬讀框(ORF)組成，分稱rep區、lip區、inf區和cap區(見圖1、圖2)。位于基因組DNA左端的一個大ORF由于移碼突變或缺失會阻止DNA復制，因而被稱為rep區，。右端的一個大ORF(cap)編碼合成3種外殼蛋白。另有兩個小ORF位于基因組DNA的中央區，即inf區和lip區，具體功能尚不清；2)在分子單鏈每個末端含有一個145個堿基末端重復序列(ITR)(見圖1)。ITR序列折疊成發卡結構作為DNA復制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件(見圖3)。
3)腺相關病毒的復制和轉錄調節相當復雜，按有無輔助病毒的共轉染分，有增殖性和潛伏性兩種表達方式(如圖4)。
在AAV的增殖性表達中，可轉錄生成6種mRNA，分別由啟動子P5、P19、P40啟動合成(如圖5)。在腺病毒(Ad)共轉染的情況下，Ad的E1A基因負責AAV基因表達的反式激活；Ad E2A基因編碼單鏈DNA結合蛋白，可刺激AAV啟動子所啟動的轉錄，還可促進AAV轉錄后從胞核向胞質轉運；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能夠正調節和負調節自身基因和輔助病毒基因的表達。AAV的rep基因能夠正調節和負調節P5、P19、P40啟動子所啟動的轉錄，在有Ad的情況下，rep基因產物行使正調節功能，這是AAV基因大量合成所必須的；而在無輔助病毒共轉染的情況下，rep基因產物則起負調節作用。
在無輔助病毒的情況下，AAV DNA以雙鏈形式整合到宿主細胞基因組中，在那里以潛伏狀態持續存在，形成AAV的潛伏感染。AAV整合的特異位點是在人染色體的19q13.3-19q ter上。Rep基因產物除了負調節作用外，還可識別和結合特異的整合位點，即GGTC序列，并介導了ITR與整合位點的重組。而腺病毒的感染可使其進入增殖感染狀態。
2、AAV作為基因克隆的載體。
AAV是目前已知的唯一能夠在宿主基因組特異染色體位點整合的真核細胞病毒。這個發現使基因治療產生了新的希望，AAV基因治療載體不僅僅能夠和非整合載體(如腺病毒為基礎的載體)相比更持續穩定地表達轉基因，而且能夠減少理論上的由于轉基因的隨機整合導致的插入突變幾率。我們使用的這一套載體系統是將天然腺相關病毒和腺病毒用分子生物學方法經一系列剪切和修飾而成，它們保留了腺相關病毒復制和轉錄所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因輔助成份，其他多余的部分均已刪除，既能實現病毒長期穩定的潛伏感染，又能避免腺病毒的致病危險，而且腺病毒晚期基因的表達可以保證被克隆基因的表達效率。這一載體系統的構成如下pXX2(如圖6)保留了AAV的cap基因和rep基因(此時得到pACG-2)，并在下游區域又插入了一個p5啟動子(在原來區域用XbaI和PstI切下，再連接到pACG-2的適當位置)。另外我們對照組所使用的報告基因(lacZ)也連在pXX2的下游。方法是先在pXX2下游造一個ClaI的切口，再在其切口上加一個Sse8387I的接頭(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把兩端為Pst I切口的lacZ片段連接于其上。
PXX6(如圖6)在腺病毒改造質粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包裝信號)上用PmeI和SgfI切下一個8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6則是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，僅僅留下E2A、E4和VA編碼區。
pXXUF1(如圖7)rAAV包裝所用的質粒pXXUF1含有CMV啟動子(箭頭)所驅動的人gfp基因，它是將腺相關病毒的編碼基因全部刪除后再由NotI位點導入的。
二、rAAV-asPLB重組病毒的包裝與回收pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB質粒的大量提取，所用大提試劑盒購自Promega公司。方法依產品說明書所述。
將293細胞(人腎母胚胎腫瘤細胞系)傳入數個150mm培養板中，傳代培養需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培養基、新生小牛血清(購自Gibco公司)。待細胞生長到60％到70％聚集度時，按85μg DNA/150mm培養盤的總量，按摩爾比1∶1∶1(質量比為1.7∶3.8∶1)用鈣磷轉染法轉入293細胞。分別將pXX2、pXX6、pXXUF1-asPLB質粒加入一無菌的250ml培養瓶中，然后依次加入2.5MCaCl2溶液(160μl/盤)和無菌去離子水，最后加入2×BBS(pH6.95，1.6ml/盤)，逐滴加入振搖混合液，以形成較小的鈣磷顆粒。之后室溫下孵育30min。隨即吸棄293細胞培養盤中的培養基，加入3ml DNA-鈣磷混合液，于35℃、3％CO2培養16～24小時后換液，轉入37℃，5％CO2繼續培養36～48小時。轉染后48-72小時吸棄所有培養基，加入少量PBS緩沖液，刮取盤中293細胞，后-80℃凍存。
為祛除細胞中的異型蛋白，須用肝素柱純化，方法如下將收集的含病毒的293細胞反復凍溶三次，加入0.1mg的DNase I及0.1mg的RNase A酶，37℃撫育2小時；再加入0.5％的脫氧膽酸，37℃撫育30分鐘；離心數分鐘，上清分別經5μm和0.8μm的濾膜過濾；取8ml肝素瓊脂糖混懸液加入一直徑為2.5cm裝有閥門的玻璃柱中；待瓊脂糖混懸液流盡后，在形成的瓊脂床上放置一濾膜，用25mlPBS(PH7.4)平衡瓊脂床；關閉閥門，將上述經過過濾的病毒原液加入玻璃柱中，打開閥門，控制病毒以1滴/秒的速度滴下；待病毒液滴完后，用25mlPBS(PH7.4)+0.1M NaCl洗兩次；用15mlPBS(PH7.4)+0.4MNaCl洗脫病毒；用Millipore Biomax-100k NMWL過濾裝置(UFV2BHK40)濃縮病毒液至3～5ml。
rAAV-asPLB病毒滴度的測定一斑點雜交a)PLB cDNA探針的標記和純化同位素標記的核苷酸α-P32購自北京雅輝公司。用Not I切下pXXUF1-PLB-AS中的PLB片段做為已知序列的探針。隨機引物法標記PLB片段并純化(試劑盒購自QIAGEN公司，方法如說明書)。
b)回收物和定量標準的準備回收物經適量DNAse I和RNAse消化，消化細胞基因組的DNA、RNA。反應終止后再加Proteinase K，消化病毒的蛋白質外殼(以上試劑均購自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中為病毒中的DNA。將上清按體積比對倍稀釋。標準物采用目的基因片段，即PLB片段，測定濃度后按分子數對倍稀釋(具體計算方法略)。并作加熱和堿變性處理。
c)雜交與放射自顯影配好斑點雜交裝置，并按裝置大小安置一塊0.45μm的尼龍膜，將待測病毒樣品和標準樣品按體積梯度和分子梯度分別上樣，上樣后將膜80℃干烤2小時，后42℃預雜交1小時(預雜交液購自INTERGEN公司)。再加加熱處理的標記探針，45℃雜交12-16小時。洗膜后-80℃放射自顯影2-3天。結果如圖十此結果說明我們制備的rAAV具備足夠的滴度(1×1011pfu/L)，可以用于動物實驗和臨床治療。
rAAV-asPLB對心梗心力衰竭大鼠心功能的影響和其他效應1)心肌梗塞大鼠模型的復制雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，180-220克，用20％的烏拉坦，按40mg/kg腹腔注射麻醉動物，經口氣管插管，接小動物人工呼吸機，調整有效通氣量為1.0ml/g.min。連接標準II導聯，用MS-302多媒體生物信號采集分析系統監測大鼠心電圖，左胸前備皮，碘復消毒皮膚2次，于第3-4肋間作橫切口，依次分離各層組織，暴露心臟，剪開心包，用無損傷縫針穿過左旋支下方的心肌表層，結扎左旋支。結扎成功后心電圖ST-T立即呈弓背向上抬高。手術成功率約為80％，術后6周存活率月為70％。
2)成功結扎左旋支后2周，實驗組經尾靜脈注入rAAV-asPLB，對照組給予rAAV-LacZ。觀測基因轉染后對大鼠心臟血流動力學的影響及主動脈環對血管活性物質反應性的改變，同時通過病理切片的研究觀察其對心肌結構的影響。證明rAAV-asPLB經靜脈轉染心肌梗塞大鼠模型后，能有效阻斷PLB的表達，明顯改善左室血流動力學各項指標，提高LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP及-dp/dtmax，并增強主動脈環對血管活性物質(去甲腎上腺素)的收縮反應性，減輕心肌膠原沉積、改善心肌的重塑。
權利要求
1.一種表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒，該重組腺相關病毒由天然狀態的腺相關病毒和腺病毒經分子生物學方法人工剪切、修飾和加工而成，該載體系統包括包裝質粒pXX2，輔助質粒pXX6，真核表達載體pXXUF1和pXXUF3，并在真核表達載體pXXUF1內反向插入了人類受磷蛋白基因編碼序列，1)包裝質粒pXX2它含有編碼腺相關病毒Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列，并在上游和下游各插入一個p5啟動子，使表達效率可以提高15倍；2)輔助質粒pXX6其刪除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它們表達的蛋白質可發揮輔助作用以刺激AAV基因的轉錄和翻譯，保證AAV的產量；3)真核表達載體pXXUF1所用的是CMV啟動子，有較強的表達效率，其含有Not I多克隆位點，可以連接不同的目的基因，pXXUF1反向連接人受磷蛋白基因，該載體含有rAAV轉基因表達所必須的末端ITRs重復序列，負責病毒的復制和病毒外殼的包被并攜帶目的基因。
2.一種藥物組合物，它包括有效量的權利要求1所述的表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒和藥學上所接受的載體或賦形劑。
3.一種制備表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒的方法，1)提供腺相關病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列——pXX2質粒，和刺激腺相關病毒復制和轉錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因——pXX6質粒；2)提供含腺相關病毒基因組的真核表達載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區，并反向插入人類受磷蛋白基因，形成重組質粒pXXUF1-asPLB；3)將步驟1)中的pXX2、pXX6和pXXUF1-asPLB步驟2)共轉染293細胞，適時回收，并純化、檢測其病毒滴度；4)將步驟3)中回收純化的病毒經尾靜脈注射入心力衰竭動物體內，檢測其生物學活性。
4.根據權利要求書3所述的方法，在步驟3)中共轉染的方法是鈣磷DNA共沉淀轉染法，真核表達載體pXXUF1所含啟動子為CMV啟動子，純化是用氯化銫梯度離心法，而檢測滴度是用斑點雜交法。
5.根據權利要求1所述的一種表達人類受磷蛋白反義基因的重組腺相關病毒，已保藏于武漢大學內中國典型培養物保護中心，保藏口期2003年7月9日，保藏編號V200308，分類命名反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒antiphospholamban/AAV。
全文摘要
本發明涉及一種表達人類反義受磷蛋白基因的重組腺相關病毒及其制備方法，屬于生物工程技術領域，用于心力衰竭及其他相關疾病的基因治療。該重組腺相關病毒由天然狀態的腺相關病毒和腺病毒經分子生物學方法人工剪切、修飾和加工而成，該載體系統包括包裝質粒pXX
文檔編號C12N15/66GK1657631SQ20041006123
公開日2005年8月24日 申請日期2004年11月30日 優先權日2004年11月30日
發明者汪道文, 肖嘯, 趙春霞, 汪培華 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院