豬肉質性狀相關glp2r基因片段的分子克隆及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于家畜分子生物學【技術領域】，具體涉及一種豬肉質性狀相關GLP2R基因片段的分子克隆及應用，是以人的GLP2R基因序列為種子序列，在GenBank中利用BLASTN，參照其同源性在80％以上的豬EST設計特異引物，利用RACE克隆出豬GLP2R基因cDNA全長，該豬GLP2R基因片段的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。GLP2R基因的多態性是利用比較基因組學方法根據人的GLP2R基因序列設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用測序篩選SNP，并利用PCR-RFLP進行基因分型，發現第244bp處有一個A/G的堿基突變，導致PCR-RFLP-BstEⅡ多態性，為豬標記輔助選擇提供了新的分子標記，可利用該標記檢測中外豬種的情況。
【專利說明】豬肉質性狀相關GLP2R基因片段的分子克隆及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于家畜分子生物學【技術領域】，具體涉及一種包含如SEQ ID NO:1所示豬基因核苷酸的核酸分子。本發明還涉及如SEQ ID N0:1所示的GLP2R基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的單核苷酸多態性位點以及檢測所述單核苷酸多態性位點的方法。
【背景技術】
[0002]豬肉是動物性蛋白的主要來源，隨著人們對肉需要量的增加，對肉質的要求也相應提高。影響豬肉質的因素有遺傳和非遺傳的，豬肌內脂肪含量對肉質性狀有很大的影響，一般來說，肌內脂肪含量越高，豬肉質越嫩，從而肉質越好。肉質性狀大多屬于數量性狀，由微效多基因控制。許多肉質性狀只能在動物屠宰后才能測定，所以常規選育只能進行同胞或半同胞測定，這樣必加大選育成本，且遺傳進展緩慢。豬基因組草圖的構建，使得尋找影響肉質性狀的主基因或與其緊連鎖的分子標記成為可能，這些分子標記一經確認，就可進行標記輔助選擇育種。利用分子標記進行輔助選擇(MAS)進行肉質性狀改良是一種有效的途徑。
[0003]胰高血糖素樣肽2 (Glucagon-like peptide-2, GLP2)是近年來發現的一種腸上皮特異生長因子，有助于腸道生長發育，能促進修復腸道粘膜的病理損傷，提高腸屏障功能，抑制腸細胞凋亡，加快腸腔營養物質的轉運，增強腸道對營養物質的吸收。此外，有報道指出，血清中GLP-2含量與2型糖尿相關。
[0004]膜高血糖素樣妝2 受體(Glucagon-like peptide_2recepter, GLP2R)屬于 G 蛋白偶聯受體家族，與胰高血糖素樣肽-1 (Glucagon-like peptide-1, GLP1)、胰高血糖素(Glucagon, GCG)和葡萄糖依賴性促膜島素多妝(Glucose-dependent insulinotropicpolypeptide, GIP)的受體高度同源。GLP2R作為GLP2的特異性受體，GLP2與其結合調節腸粘膜細胞增殖、分化和修復等。此外，Luo等(2012)以大白豬和東北民豬構建F2代資源家系，F2代有455頭豬，所用基因芯片為PorcineSNP60K，測定了背最長肌的肌內脂肪含量、大理石紋、肉色等，全基因組關聯分析(Genome-Wide of Analysis of Study, GWAS)研究表明，豬的GLP2R基因與肌內脂肪含量顯著相關。GLP2R位于豬12號染色體、小鼠11號染色體、人17號染色體。目前，GLP2R已經在大鼠、人和小鼠等中克隆表達出來，但是，國內外對豬GLP2R基因的研究鮮見報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是:針對上述現有技術的不足，提供一種豬肉質性狀相關的GLP2R基因片段的分子克隆及應用，通過克隆豬GLP2R基因cDNA分子，尋找GLP2R基因的突變位點，并檢測GLP2R基因的多態性，為豬肉質性狀標記輔助選擇提供有用的分子標記。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:一種與豬肉質性狀相關的GLP2R基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，該SEQ ID NO:1序列的243bp處有I個G/A的堿基突變，導致PCR-RFLP-BstE II多態性。
[0007]本發明以人的GLP2R基因序列(GenBank收錄號為NM_004246.1)為種子序列，在 GenBank 中利用 BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide),參照其同源性在80 %以上的豬EST (Expression Sequence Tags)設計特異引物，利用RACE (RapidAmplification of cDNA End)，克隆出豬 GLP2R 基因 cDNA 全長，該豬 GLP2R 基因的 DNA序列如SEQ ID N0:1所示，見圖3。GLP2R基因的多態性是利用比較基因組學方法根據人的GLP2R基因序列設計引物，正向引物為U -CGGGAACTCCTGTTGTGC-3 '，反向引物為5 ! -TGAAGCGGTGAGAATGGTA-3 !;再以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用測序篩選SNP，并利用PCR-RFLP進行基因分型技術，發現第244bp處有一個A/G的堿基突變，導致PCR-RFLP-BstE II多態性，經分析A/G位點存在3種基因型，AA基因型(746bp)、AG型(746bp、506bp、240bp)和 GG 型(506bp、240bp)。
[0008]可利用上述制備的豬分子標記檢測外來豬種和中國地方品種，為標記輔助選擇(MAS)奠定堅實的基礎，提高了養豬生產經濟效益，為指導豬的育種實踐提供理論依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1是本發明的GLP2R基因片段的PCR擴增產物的電泳結果圖。
[0010]圖中:M:100bp DNA Ladder Marker, 1_6表示第I至第6泳道,分別代表大白豬第I至6號樣品。
[0011]圖2是本發明的GLP2R基因A/G位點的BstE II酶切電泳結果。 [0012]圖中:泳道1-3:GG基因型；泳道4、5、8、10:AA基因型；泳道6、7、9:AG基因型；M:1OObp DNA Ladder Marker。
[0013]圖3是本發明豬GLP2R基因的DNA序列，其中顯示了突變位置。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發明作進一步地解釋，但具體實施并不對本發明做任何限定。
[0015]GLP2R基因的克隆:
[0016]以人的GLP2R基因序列(GenBank收錄號為ΝΜ_004246.I)為種子序列，在GenBank中利用BLASTN,參照其同源性在80%以上的豬EST (Expressed Sequence Tags)設計特異引物，利用RACE技術克隆出豬GLP2R基因cDNA全長。
[0017]試驗材料:25日齡沙子嶺豬由湖南省湘潭市沙子嶺豬資源場提供，取背最長肌-80°C保存，3' -RACE SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購于Clontech公司。
[0018]總RNA提取與cDNA第I鏈的合成:用SUPERSCRIPT II RT酶和特異性引物3’445-1對總RNA進行基因第一鏈cDNA的合成，使用RNase Mix對合成的cDNA進行去RNA處理，最后對cDNA進行純化。
[0019]引物設計:據GenBank人的GLP2R基因(登錄號:ΝΜ_004246.I)序列保守區設計引物，引物設計的軟件為Primer Premier5.0，引物設計的原則是特異性引物長度在23-28個核苷酸，GC含量在50% -70%，退火溫度在65-70°C，使用巢式PCR進行擴增。[0020]編碼序列PCR擴增:以合成的豬cDNA為模板，在保守區設計引物經過克隆測序，獲得該基因部分⑶S(coding domain sequence)序列。
[0021 ] 3' -RACE 擴增:用 3' 445-1 弓丨物和 UPM (Universal Primer A Mix)(見表 I)，及上述合成的cDNA為模板進行PCR第一輪擴增；將PCR第一輪擴增產物稀釋50倍后，進行巢式PCR第二輪擴增，將擴增產物進行電泳并對目的條帶切膠回收純化；最后將純化后的PCR產物與pMD18-T載體進行連接，轉化后挑取陽性克隆測序。
[0022]表1引物序列
[0023]
【權利要求】
1.一種與豬肉質性狀相關的GLP2R基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，該SEQ ID NO:1序列的243bp處有I個G/A的堿基突變，導致PCR-RFLP-BstE II多態性。
2.檢測權利要求1所述的與豬肉質性狀相關的GLP2R基因片段的堿基突變的引物對，其特征在于，該引物對的序列如下: 正向引物:5' -CGGGAACTCCTGTTGTGC-3'， 反向引物:5' -TGAAGCGGTGAGAATGGTA-3'。
3.權利要求1所述的GLP2R基因片段在與豬肉質性狀相關的分子標記輔助選擇中的應用。
4.權利要求 1所述的引物對在豬肉質性狀相關的分子標記輔助選擇中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK103966231SQ201410237979
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】馬海明, 柴玉蘭, 王玲玉, 楊虎 申請人:湖南農業大學