水稻中胚軸伸長基因qML3的分子標記與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種水稻中胚軸伸長基因qML3的分子標記與應用，利用“沈農265”和“麗江新團黑谷”的重組自交系群體，對水和赤霉素溶液兩種培養條件下的中胚軸長度進行QTL定位，檢測到一個在兩種處理條件下都能夠控制中胚軸長度的主效QTL，命名為qML3。同時公開了qML3兩側的分子標記，所述分子標記與qML3不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離，因而適于直播水稻品種的分子輔助培育。
【專利說明】水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，屬于水稻育種中 的檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 胚軸是構成種子和幼苗及其形態建成過程中的重要部分，它連接著胚根、胚芽、子 葉和禾本科植物的胚芽鞘，通常分為上胚軸（子葉節或胚芽鞘節至胚芽的一段）、中胚軸 (禾本科植物盾片節至胚芽鞘節的一段）和下胚軸（子葉節或禾本科的盾片節至胚根的一 段）。在水稻中，上胚軸基本不活動，下胚軸的伸長也極其有限，主要靠中胚軸的伸長將胚芽 連同伸長的胚芽鞘送至土表附近，以便幼苗吸收空氣中氧氣而進行隨后的正常生長。所以， 水稻中胚軸的伸長對直播水稻萌發后的幼苗生長至關重要，選育具有中胚軸伸長特性的品 種是直播技術推廣的重要前提。關于長中胚軸水稻資源的篩選已有部分報道。林建榮等研 究表明，中胚軸伸長特性受2對隱性基因控制，并與株高存在一定的連鎖關系。隨著以分子 標記連鎖圖譜為基礎的QTL分析技術的發展，該技術已成為研究復雜性狀遺傳機理的主要 手段之一。
【發明內容】
[0003] 本發明解決的技術問題是設計和開發位于qML3兩側的特異性分子標 記，將這個分子標記命名為qML3_l和qML3_2,所述片段如序列表SEQ ID N0 : 1和SEQ ID NO :2所不。具體地，本發明設計開發的分子標記的核苷酸序列如 下：qML3-l 的上游弓丨物序列為：5, -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的 下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
[0004] 本發明采用以下技術方案：根據前期定位結果，分別測定了麗江新團黑谷和沈農 265的目標區域，并進行了比對分析，挑選出一對微衛星差異，并設計出該標記。將此標記 應用于麗江新團黑谷和沈農265進行驗證，發現具有qML3的沈農265在利用qML3_l檢測 時，能夠擴增出190bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。在利用 qML3_2檢測時，沈農265能夠擴增出210bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp 左右的條帶。并進一步對重組自交系進行驗證，發現這兩個該分子標記與qML3共分離。綜 上，此分子標記可以用于鑒定待測材料是否在qML3座位上含有沈農265的中胚軸的增效等 位基因。
[0005] -種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，應用下述步驟檢測待測材料 是否在qML3座位上含有沈農265的中胚軸增效等位基因，具體過程為：
[0006] (l)DNA提取，具體過程為：
[0007] (la)取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1. 5ml的微量離心管（EP)中。
[0008] (lb)力卩入預熱至 65 °C 的 CTAB 抽提液[2 % (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl， ρΗ8· 0 ;20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1.4mol/LNaCl]600μ L。
[0009] (lc)輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態，放于60°C的水浴30_60min，期間每 5min輕輕倒轉離心管使之分散均勻。
[0010] (Id)取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分 混勻，然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉入另一離心管中。
[0011] (le)重復3-4次，直至中間沒有蛋白層為止。
[0012] (If)將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以 上。
[0013] (lg)此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去 殘液，在超凈工作臺上吹干。
[0014] (lh)用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，pH8. 0)回溶待用。
[0015] (li)取 1.5yL用于 PCR擴增。
[0016] (2)進行PCR擴增，其條件為：PCR反應體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer, 5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶。應用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應程序為94°C預變性5min ;每個循環94°C預變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環；最后72°C延伸8min。
[0017] (3)PCR產物檢測，其條件為：擴增產物中加入上樣緩沖液，取8yL上樣于3. 5%的 瓊脂糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠 成像系統成像觀察。
[0018] 該發明的有益效果在于：本發明利用"沈農265"和"麗江新團黑谷"的重組自交系 群體，對水和赤霉素溶液兩種培養條件下的中胚軸長度進行QTL定位。與其他研究者的結 果比較發現，主效基因 qML3在不同群體、不同環境下重演性很好，可以作為基因克隆的首 選目標。本發明在兩個不同環境下檢測qML3的加性效應值分別為0. 29和0. 41，貢獻率分 別為24. 97%和33. 36%。本發明公開了兩個水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記，所述 分子標記與水稻中胚軸伸長基因 qML3不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離， 因而為篩選適于直播水稻品種和分子標記輔助育種提供了一條很好的途徑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明實施例中qML3_l分子標記的檢測結果示意圖。
[0020] 圖2是本發明實施例中qML3_2分子標記的檢測結果示意圖。
[0021] 圖中標記說明：M :分子標記標準；1 :沈農265 ;2 : _江新團黑谷；3_12 :長中胚軸 株系；13-22 :短中胚軸株系。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發 明。
[0023] 實施例
[0024] 本發明所采用的標記為，設計和開發位于qML3兩側的特異性分子標 記，將這個分子標記命名為qML3_l和qML3_2,所述片段如序列表SEQ ID N0 : 1和SEQ ID NO :2所不。具體地，本發明設計開發的分子標記的核苷酸序列如 下：qML3-l 的上游引物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的 下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
[0025] 根據定位結果，分別測定了麗江新團黑谷和沈農265的目標區域，并進行了比對 分析，挑選出一對微衛星差異，并設計出該標記。將此標記應用于麗江新團黑谷和沈農265 進行驗證，發現具有qML3的沈農265在利用qML3_l檢測時，能夠擴增出190bp左右的條帶， 而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。在利用qML3_2檢測時，沈農265能夠擴增 出210bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。并進一步對重組自 交系進行驗證，發現這兩個該分子標記與qML3共分離。綜上，此分子標記可以用于鑒定待 測材料是否在qML3座位上含有沈農265的中胚軸的增效等位基因。
[0026] 本發明實施例中的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，應用下述步驟 檢測待測材料是否在qML3座位上含有沈農265的中胚軸增效等位基因，具體過程為：
[0027] (l)DNA提取，具體過程為：
[0028] (la)取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1. 5ml的微量離心管（EP)中。
[0029] (lb)加入預熱至 65 °C 的 CTAB 抽提液[2 % (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl， ρΗ8· 0 ;20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1.4mol/LNaCl]600μ L。
[0030] (lc)輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態，放于60°C的水浴30-60min，期間每 5min輕輕倒轉離心管使之分散均勻。
[0031] (Id)取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分 混勻，然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉入另一離心管中。
[0032] (le)重復3-4次，直至中間沒有蛋白層為止。
[0033] (If)將上清液逐滴加入2倍體積的_20°C預冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以 上。
[0034] (lg)此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去 殘液，在超凈工作臺上吹干。
[0035] (lh)用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，pH8. 0)回溶待用。
[0036] (li)取 1.5yL用于 PCR擴增。
[0037] (2)進行PCR擴增，其條件為：PCR反應體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer, 5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶。應用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應程序為94°C預變性5min ;每個循環94°C預變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環；最后72°C延伸8min。
[0038] (3)PCR產物檢測，其條件為：擴增產物中加入上樣緩沖液，取8μ L上樣于3. 5%的 瓊脂糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠 成像系統成像觀察。如圖1所示為qML3_l分子標記的檢測結果，能夠擴增出190bP條帶的 株系具有qML3基因。如圖2所示為qML3-2分子標記的檢測結果，能夠擴增出210bP條帶 的株系具有qML3基因。
[0039] 以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員 來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為 本發明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，其特征在于：設計和開發 位于qML3兩側的特異性分子標記，將這個分子標記命名為qML3_l和qML3_2，所述 片段如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所設計開發的分子標記的核苷酸 序列如下：qML3-l 的上游引物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
2. 根據權利要求1所述的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，其特征在于： 采用上述分子標記，分別測定了麗江新團黑谷和沈農265的目標區域，并進行了比對分析， 挑選出一對微衛星差異，并設計出該標記；將此標記應用于麗江新團黑谷和沈農265進行 驗證，發現具有qML3的沈農265在利用qML3_l檢測時，能夠擴增出190bp的條帶，而麗江 新團黑谷能夠擴增出200bp的條帶；在利用qML3_2檢測時，沈農265能夠擴增出210bp的 條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp的條帶；并進一步對重組自交系進行驗證，發現這 兩個該分子標記與qML3共分離；此分子標記能用于鑒定待測材料是否在qML3座位上含有 沈農265的中胚軸的增效等位基因。
3. 根據權利要求2所述的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標記與應用，其特征在于： 采用下述步驟檢測待測材料是否在qML3座位上含有沈農265的中胚軸增效等位基因，具體 過程為： (l)DNA提取，具體過程為： (la) 取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置 于1. 5ml的微量離心管（EP)中； (lb) 加入預熱至 65°C 的 CTAB 抽提液[2% (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl，ρΗ8· 0 ; 20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1·4mol/LNaCl]600 μ L ; (lc) 輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態，放于60°C的水浴30-60min，期間每5min 輕輕倒轉離心管使之分散均勻； (ld) 取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分混勻， 然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉入另一離心管中； (le) 重復3-4次，直至中間沒有蛋白層為止； (lf) 將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以上； (lg) 此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液， 在超凈工作臺上吹干； (lh) 用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，ρΗ8· 0)回溶待用； (li) 取1.5yL用于PCR擴增； ⑵進行PCR擴增，其條件為：PCR反應體系為15μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer，5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶；應用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應程序為94°C預變性5min ;每個循環94°C預變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環；最后72°C延伸8min ; (3) PCR產物檢測，其條件為：擴增產物中加入上樣緩沖液，取8 μ L上樣于3. 5%的瓊脂 糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠成像 系統成像觀察。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152441SQ201410239095
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月25日 優先權日:2014年4月18日
【發明者】姜樹坤, 張鳳鳴, 白良明, 孫世臣, 劉丹, 張喜娟, 王嘉宇, 丁國華, 王彤彤, 姜輝 申請人:黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所