一種攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝細胞株及其構建方法
【專利摘要】本發明提供了一種可回復永生化肝細胞株的構建方法，從胚胎期12.5～14.5d天的小鼠肝臟中分離肝臟祖細胞，導入含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆轉錄病毒，篩選具有肝祖細胞標志及向成熟肝細胞分化功能的單克隆細胞株，再導入含有CD基因的逆轉錄病毒獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化小鼠肝祖細胞。該細胞株能夠在體外不斷增殖又具有正常的肝細胞表型及功能，通過位點重組和藥物篩選等可控性方式實現了永生化細胞安全性的可調控，而且最大限度的保證了該細胞在體內應用的生物安全性，減少永生化肝細胞應用于體內的危險性，為生物人工肝技術提供一種可靠、安全、理想的肝細胞材料。
【專利說明】—種攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝細胞株及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞生物學領域，公開了一種攜帶雙自殺基因的永生化肝細胞株的構建方法以及構建的小鼠胚胎肝祖細胞株。
技術背景
[0002]肝功能衰竭^11111-6)是臨床最常見的死亡率極高的肝病癥候群,嚴重威脅著人類的健康。據統計顯示，我國每年因為重癥肝功能衰竭導致死亡的人數為30?50萬。治療肝衰竭最有效的方法是肝移植，然而由于供肝來源缺乏，僅有不到10%的患者能得到肝移植的機會。生物人工肝出丨似代丨打七“是以培養肝細胞為基礎的體外生物人工器官裝置，可暫時代替肝臟進行解毒、分泌、合成、轉化等功能，不僅能為肝衰竭患者等待肝移植爭取時間，而且可為肝再生恢復創造條件。目前生物人工肝的細胞來源包括:1)原代細胞:包括自體、同種異體或異種的成體肝細胞，由胚肝細胞、骨髓造血干細胞、肝卵圓細胞等分化而來的肝細胞；2)肝細胞株:肝腫瘤細胞株，永生化的肝細胞株等。腫瘤源性的細胞株來源充足，增殖能力強，且具有一定的合成功能，但目前只有03八細胞株有應用于臨床的報道，然而該細胞代謝解毒功能較弱，尚不具備完全的成熟肝細胞功能，并存在著潛在的致癌性和遺傳性狀的改變，顯然用現有的肝腫瘤細胞株來代替肝臟功能還存在著一定的局限性。用于生物人工肝的細胞需要在體外擴增至107數量級并具有成熟的合成代謝解毒功能，但是原代細胞的來源缺乏，而干細胞成肝分化能力有限，這使得如何促進成熟肝細胞的體外增殖分化成為目前研究的一個熱點。雖然肝細胞在體內有著強大的增殖潛能，能多次分裂增殖，但在體外分離培養過程中，由于失去了神經體液調節和細胞間的相互作用，生活在缺乏動態平衡的相對穩定環境中，細胞生存時間短，增殖能力有限，傳代困難且易發生變性，這極大地增加了其在生物人工肝應用中的難度和復雜性。因此，如何獲得體外增殖良好并具有正常功能的肝細胞，為生物人工肝提供穩定安全的細胞來源變得尤為重要。
[0003]研究發現將猿病毒40 大 I 抗原基因($111115111 ^11-11840181-^6 X 8111:18611 ^6116,^40”導入正常細胞，可調節細胞周期中的重要調控點，使細胞進入永生化的增殖狀態，成為能在體外長期傳代培養的永生化細胞系。3740是雙鏈環狀0嫩病毒，由5243個堿基對組成，其中早期轉錄區基因編碼的大I抗原為708個氨基酸的磷酸蛋白，具有多向效應:在宿主細胞內可結合？53和下調其阻止細胞增殖的作用；還能特異性干擾一個或多個細胞周期調節蛋白，使細胞逃逸11期，獲得額外的增殖力量，繼續分裂。李君等用嫩3.1(-)質粒將^401導入原代成人肝細胞，獲得了高分化的永生化人源肝細胞系，此細胞具有原代肝細胞的典型特征和生物學功能，能分泌白蛋白、八^81及10！！，表達肝臟豐富的功能標志。故用此方法能獲得大量功能成熟的肝細胞，可為生物人工肝提供充足的細胞來源。
[0004]^401畢竟是一個外源的病毒癌基因，與宿主細胞0嫩發生穩定整合后長期存在于細胞內，具有細胞惡性轉化的潛在危險性，并且細胞永生化后可能會因其增殖能力在體內發生癌變。同時，生物人工肝使用過程中外源細胞有可能進入到血液循環，增加了種植瘤形成的可能。近幾年來，國內外學者一直對37401永生化肝細胞的臨床應用安全性進行不斷的探索。常見方法有位點重組技術，即先將位點特異修飾的37401逆轉錄病毒導入原代肝細胞，獲得永生化細胞株，使其獲得體外增殖能力，然后再將06重組酶基因通過病毒載體導入細胞，經過特異性位點重組切除37401外源基因，使細胞回復到永生化前的狀態。另一種方法是把自殺基因整合到永生化肝細胞內，一旦發生惡性轉化，用前體藥物將其殺滅。
[0005]但是目前的這兩種永生化方案還是存在各自的缺陷。方案中對06重組酶活性及匕逆位點重組切除的效率無法控制，不能保證所有的細胞都去除永生化基因，由于永生化回復后細胞內殘留的永生化基因是否抑制細胞功能，是否存在導致腫瘤發生和細胞轉化危險性等問題有待進一步驗證。自殺基因方案雖然增加了細胞體內應用的安全性，但是導入體內的永生化細胞仍有^401基因存在，影響細胞在體內的分化及功能成熟。
【發明內容】
[0006]為了解決以上的問題，本發明提供了一種可回復永生化肝細胞株的構建方法，成功獲得了攜帶雙自殺基因且可誘導敲除^401永生化基因的可回復永生化小鼠胚胎肝祖細胞株。
[0007]本發明的目的是通過以下措施實現的:
[0008]一種可回復永生化肝細胞株的構建方法，從胚胎期12.5?14.5(1天的小鼠肝臟中分離肝祖細胞，逆轉錄病毒導入37401基因和基因，篩選具有肝祖細胞標志及向成熟肝細胞分化功能的單克隆細胞株，再用逆轉錄病毒導入⑶基因，獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化小鼠胚胎肝祖細胞。所述⑶(05^081116 (168111111886)為胞卩密唳脫氨酶基因、
((^61-^68訪齊丨也加的86)為單純皰疫病毒胸苷激酶基因。通過兩次轉染，解決了多基因轉入細胞無法有效表達的問題。
[0009]上述含有^401基因和基因的逆轉錄病毒載體的結構如圖1-1示，5’1丁尺-八八！^-37401-1^^？-他0-3’ I狀，依次相連形成環形。該載體為逆轉錄病毒載體，III？間的0嫩序列可插入至宿主細胞0嫩中實現穩定轉染。攜帶^40丁永生化基因、1137-11(自殺基因及潮霉素抗性基因，潮霉素抗性用于穩定細胞株的篩選，可在體外實現永生化的增殖。插入基因0嫩序列兩端有同向的[似？位點，06重組酶定點敲除^401永生化基因和1137-11(自殺基因，細胞回復到永生化前的狀態，未敲除的永生化細胞還有1137-11(自殺基因，將前體藥物更昔洛韋轉變為有毒性的三磷酸鹽，被選擇性殺滅，保證保證體內應用前細胞永生化基因的徹底清除。
[0010]上述含有03基因的逆轉錄病毒載體結構如圖1-2所示。該載體帶有稻瘟菌素(8818^101(1111, 880)基因和⑶自殺基因。穩定轉染⑶自殺基因的細胞能在含有830的培養基中存活。830的篩選是一個全或無的效應，整合了此基因的細胞存活，反之細胞死亡，能保證所有的抗性細胞都含有⑶自殺基因。在細胞用于生物人工肝進行血液凈化后，可能進入血液循環的外源細胞帶有03自殺基因，可將安全性好的前體藥物5-氟胞嘧啶(5-^11101-0071:081116, 5-^0)轉變為強毒性的 5 氟尿卩密唳(5-^11101-0111-8011, 5-^11)，被選擇性殺滅，進一步增加了該細胞株體內應用的安全性。
[0011]具體的，上述可回復永生化肝細胞株的構建方法，包括以下步驟:
[0012](1)攜帶37401永生化基因和自殺基因的小鼠肝祖細胞構建，單克隆篩選及生物學性狀鑒定:
[0013]①從胚胎期12.5?14.5(1的小鼠肝臟中分離出肝祖細胞；用攜帶37401永生化基因及！自殺基因的逆轉錄病毒感染肝祖細胞，經潮霉素抗性加壓篩選獲得的永生化細胞呈克隆樣生長；
[0014]②單克隆細胞篩選:以有限稀釋法接種細胞于96孔培養板，至每孔一個細胞為止，潮霉素半量維持；觀察96孔培養板中有單克隆細胞團形成的孔標記，待細胞融合度達80%時常規傳代，擴大培養，獲得多株單克隆細胞；
[0015]③單克隆細胞鑒定與篩選:以1X14(1成熟肝細胞及^1^1-6肝腫瘤細胞株為對照，篩選能高表達011 ？0^5？1肝干/祖細胞標志，低表達八--、^18? 0(18、0(19肝細胞特異基因的肝祖細胞；
[0016]④單克隆細胞的誘導分化鑒定(肝功能檢測):用0^/0130體外誘導肝祖細胞成熟分化，進行？八3染色及1(?攝取實驗篩選具有體外肝細胞成熟分化能力的細胞；
[0017]⑤可回復永生化的檢測:用腺病毒介導的06重組酶敲除兩個同向位點間的序列，481！后檢測到^40大I抗原被可逆敲除，并檢測細胞增殖速度，通過八(熒光素酶報告基因)檢測八⑶表達水平，1606111 610丨檢測細胞的體外誘導分化能力；
[0018]⑥單克隆細胞的安全性檢測:腺病毒介導？體內示蹤，將[11(3標記后的細胞皮下植入裸鼠，分別于植入后第1(1、^、^活體組織成像動態觀察植入細胞的生長情況。
[0019](2)導入⑶自殺基因，構建攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株及功能鑒定:
[0020]①的￡8-⑶載體的構建及鑒定:821111? 1/8^1 I酶切位點雙酶切帶有⑶自殺基因全長序列的？1即卜⑶質粒，獲得1300^左右的特異性條帶，膠回收后連接至同樣雙酶切的1)328-3？載體，經八即篩選，菌落獲得陽性克隆；提質粒，2001？ 1/8^1 I酶切獲得約2300^的特異性條帶，測序檢測1)328-0)質粒構建成功；
[0021]②導入⑶基因，構建攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株:1)328-⑶與隊卜八卹“包裝質粒共轉染冊〖293細胞，獲得逆轉錄病毒，每1111逆轉錄病毒加21118/1111的￠0171^61165 4 1，用0.45 9 0孔徑的濾器過濾，感染步驟(1)所得單克隆肝祖細胞1！！？14-19，過夜后換新鮮培養基，48卜后加入終濃度為3 ^ 8加1的830 ；880篩選10山保留存活細胞，維持篩選濃度，存活細胞開始恢復正常的生長速度及狀態，獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株；
[0022]③⑶基因的表達及活性檢測:1606111 1310^及免疫熒光檢測細胞中⑶基因的蛋白水平表達；采用100 ^ 8/1111的5-%作用于細胞株，7(1后進行結晶紫染色及III檢測細胞抑制率；
[0023]④攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株的體內⑶自殺基因活性檢測:將[11(3標記的雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株植入裸鼠皮下，體內給藥5-1^，于第0^5(1、10(1進行活體組織成像動態檢測細胞的存活情況；
[0024]⑤06-10逆重組效率及1137-11(自殺基因活性的檢測:采用3.3 ^ 的作用于細胞株檢測，01-6敲除37401及1137-11(基因后，在中存活細胞，87401表達完全消失。
[0025]有益效果
[0026]1.本發明創造性地將位點重組技術和自殺基因可控性表達有機結合，可以有效地實現對37401永生化基因的敲除以及對雙自殺基因的調控，用于優化現有永生化方案。簡化了操作步驟，減低了應用難度和風險。
[0027]2.本發明優化了轉錄載體，操作流程和方法，將37401永生化基因、⑶基因、
自殺基因通過恰當方式導入細胞，并能在細胞內穩定表達有效蛋白，實現相關功能。
采用的逆轉錄病毒系統和方法，能有效感染多種哺乳動物細胞，并有效整合到細胞基因組中且表達目的基因，從而建立穩定的細胞株。位點特異重組成功，經篩選，敲除效率幾乎可達到100%。
[0028]3.本發明得到了一種新型的可回復永生化肝細胞株，具有肝臟功能替代作用。該細胞株能夠在體外不斷增殖又具有正常的肝細胞表型及功能，并在細胞體內應用前將有導致細胞惡性轉化危險和影響細胞功能的永生化基因37401去除，細胞導入體內后還可利用藥物54(:的作用下選擇性殺滅，通過位點重組和藥物篩選等可控性方式實現了永生化細胞安全性的調控，而且最大限度的保證了該細胞在體內應用的生物安全性，減少永生化肝細胞應用于體內的危險性，為生物人工肝技術提供一種可靠、安全、理想的肝細胞材料。
[0029]4.本發明利用雙載體逆轉錄病毒系統將37401永生化基因及自殺基因導入小鼠胚胎肝祖細胞，篩選體外分化良好的永生化細胞株1！1？14-19，再將⑶自殺基因導入該細胞獲得寫到雙自殺基因的小鼠胚胎肝祖細胞，命名為該細胞具有肝祖細胞的表面標志，體外誘導能分化為有正常肝細胞功能的成熟肝細胞，移植入急性肝衰竭小鼠中能改善存活率及肝臟功能。該細胞的永生化基因37401能被可逆敲除，并用自殺基因純化永生化回復后的細胞，生物安全性好，另一個⑶自殺基因用于細胞體內移植后的自發清除。解決了原代肝細胞體外生存時間短，增殖能力有限，生物學性狀異變的缺點，可替代原代肝細胞用于肝細胞分化機制，肝癌病因學，耐藥劑量及藥物篩選的科學研究。
[0030]5..本發明構建的逆轉錄病毒載體，能有效感染多種哺乳動物細胞，為其他組織器官的永生化細胞體內應用的安全性提供一種新思路。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1-137401基因和基因的逆轉錄病毒載體的結構圖
[0032]圖1-2⑶基因的逆轉錄病毒載體結構圖
[0033]圖2攜帶1137-11(自殺基因的永生化肝細胞
[0034]圖3攜帶自殺基因的永生化肝細胞的單克隆細胞呈上皮樣細胞形態，不完全相同
[0035]圖狃631-“1116 ？邙檢測？0口5？1 (0(^4)①認、他？、從8、細08指標，篩選攜帶自殺基因的永生化肝祖細胞單克隆株
[0036]圖5攜帶自殺基因的永生化肝祖細胞單克隆株的形態學及標志物鑒定
[0037]圖6？八5染色及1(?攝取檢測誘導后攜帶1137-11(自殺基因的永生化肝祖細胞單克隆株的功能
[0038]圖7攜帶自殺基因的永生化肝祖細胞單克隆株的可回復永生化檢測
[0039]圖8 01-6敲除37401前后不同單克隆細胞及抱1^1-6裸鼠皮下成瘤試驗
[0040]圖9的四-⑶載體構建及鑒定
[0041]圖10攜帶⑶自殺基因的⑶細胞構建及⑶基因的表達檢測
[0042]圖11 對和1冊14-19-?:0細胞的細胞毒作用
[0043]圖12攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株的體內⑶自殺基因活性檢測，裸鼠左邊包塊(上下)為⑶組，裸鼠右邊包塊(上下)為組
[0044]圖13自殺基因活性及重組效率的檢測
[0045]圖14 87401基因與0)/1137-11(基因融合表達載體結構圖
[0046]圖15瞬時轉染102細胞中^401、⑶、的表達(1.102對照組么102轉染組:3.102轉染后經4(1-06感染4810
【具體實施方式】
[0047]下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是，以下實施例只用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述
【發明內容】
對本發明作出一些非本質的改進和調整。
[0048]實施例1
[0049]一種可回復永生化肝細胞株及其構建方法，包括以下步驟:
[0050]1.攜帶^401永生化基因和1137-11(自殺基因的肝祖細胞構建，單克隆篩選及生物學性狀鑒定
[0051]1)獲取肝祖細胞:從胚胎期12.5-14.5(1的小鼠肝臟中分離出肝祖細胞，分離后3天呈集落樣聚集生長，呈多邊形相嵌緊密，部分細胞可見雙核，傳代后細胞形態不均一(圓形、橢圓形、梭形、多邊形)，部分細胞扁平樣伸展，生長緩慢。用3部69逆轉錄病毒質粒(攜帶37401永生化基因及1137-11(自殺基因)包裝逆轉錄病毒，感染細胞，經潮霉素5 9 抗性加壓篩選。獲得的永生化細胞呈克隆樣生長，細胞增殖活躍，呈典型的上皮樣細胞形態，細胞漿豐富，胞核大而圓，有多核，核漿比例高。有些細胞能見到明顯的細胞分裂相(圖2)。
[0052]2)單克隆細胞篩選:以有限稀釋法接種細胞于96孔培養板，至每孔一個細胞為止，潮霉素改半量維持。觀察96孔培養板中有單克隆細胞團形成的孔標記，待細胞融合度達80%時常規傳代，擴大培養，獲得60余株單克隆細胞，形態不完全一致(圖3〉。
[0053]3)單克隆細胞鑒定:我們鑒定了其中30個克隆，發現與1X14(1成熟肝細胞及只6卯1-6肝腫瘤細胞株相比較，來自￡13.5(1的1！！？13-6、13-16、13-19及來自￡14.5(1的1^14-2,14-19能高表達01^、？0^5？1肝干/祖細胞標志，并且與其他的克隆比較，這5株克隆有八--、八等肝細胞特異基因的低表達，屬于低分化階段的肝祖細胞(圖4),,說明我們分離得到的單克隆細胞基因表達譜不一致，不同的單克隆細胞可能是不同階段的肝實質細胞或肝纖維細胞、竇狀上皮細胞、星狀細胞、如打61'’8細胞等其他非實質肝細胞。
[0054]對這5株細胞的后續鑒定發現，5株單克隆呈現上皮細胞樣形態，細胞漿豐富，胞核較大而圓，有多核，核漿比例高，細胞增殖速度有差異，其中13-6和14-19細胞形態比較均一，增殖速度較快，細胞在生長過程中有逐漸形成“肝板樣結構”的趨勢。而14-2細胞生長稍慢，細胞形態較不均一(圖5八^順?8、他？等基因的表達不完全一致，對061、0130誘導的反應也不盡相同。其中，14-19細胞形態均一，有肝特異性基因的高表達，成熟肝細胞標志的低表達，對061+0130誘導的反應最好(圖58，50。
[0055]4)單克隆細胞的誘導分化鑒定(肝功能檢測):用0^/0130體外誘導成熟肝細胞分化。肝臟是進行糖原合成及糖異生的器官，？八3試劑特異使碳水化合物著色，肝細胞中的己二醇基在過碘酸的作用下轉變為乙醛，3也1打試制使其變為紫紅色著色。靛青綠為暗綠色色素，靜脈注射后迅速與白蛋白結合，90%以上被肝細胞攝取，以原形從膽汁排出，此實驗主要反映肝細胞攝取色素的功能。功能實驗結果顯示:除了 13-6，其他單克隆在未誘導時具有少部分1化攝取功能，僅14-19在未誘導前具有少量？八3染色陽性細胞，誘導后，13-6、13-19、14-19表現出較強的糖原合成能力和1(?攝取的代謝功能(圖6)。獲得了具有體外成熟肝細胞分化能力的3個!I？克隆，進行后續實驗。
[0056]5)可回復永生化的檢測:結果可見永生化單克隆細胞株可表達37401抗原，說明外源性的37401導入成功，用腺病毒介導的06重組酶敲除兩個同向位點間的序列，481！后檢測到^401抗原被可逆敲除(圖7八)。永生化細胞增殖能力強，加入06重組酶處理后，細胞的增殖速度明顯減慢(圖78)。^18-61110是由八⑶啟動子啟動的熒光素酶報告基因，轉入細胞后，其活性間接反應了細胞中八⑶的表達水平，是判斷肝細胞成熟分化的重要檢測手段。永生化回復前后檢測八184111(3表達，結果可見:1)無論有無06重組酶處理，06^/0180均能誘導肝細胞的分化，表達上升。2)不論是否誘導，敲除37401永生化基因后，61110的表達均上升(圖70。168^61-11 結果證實細胞的體外誘導分化能力(圖了!))。因此，外源性37401可顯著促進肝祖細胞的增殖，但在一定程度上影響細胞的分化，其去除對于細胞的體內應用是有必要的。
[0057]6)三株單克隆細胞的安全性檢測:腺病毒介導？體內示蹤，分為對照組(八組)和實驗組(八組)(圖8八)，將標記后的細胞皮下植入裸鼠，分別于植入后第1(1、活體組織成像動態觀察植入細胞的生長情況。隨著時間的延長，植入細胞熒光素酶的表達降低，說明皮下存活的細胞數減少。與肝癌細胞株相比，皮下植入永生化細胞株熒光素酶的表達在^基本消失，沒有成瘤的趨勢(圖88)。而經06重組酶處理的永生化細胞株，熒光素酶的表達消失提前(圖8(:,80)，說明細胞體內增殖降低，存活時間縮短，也進一步證實了外源導入的^401抗原是能被可逆敲除的。
[0058]2.導入⑶自殺基因，構建攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株及功能鑒定
[0059]1)1)328-⑶載體的構建及鑒定:821111? 1/34 I酶切位點雙酶切帶有⑶自殺基因全長序列的？1即卜⑶質粒，獲得1300^左右的特異性條帶，膠回收后連接至同樣雙酶切的1)828-3載體，經八即篩選，菌落獲得9個陽性克隆。提質粒，1/8^1 I酶切獲得約2300恥的特異性條帶，測序結果顯示，克隆的目的片斷與中的大腸桿菌⑶基因完全一致，無突變，證明1)328-⑶質粒構建成功(圖9)。
[0060]2)導入⑶基因，構建攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株:1)328-⑶與隊卜八卹“包裝質粒共轉染冊〖293細胞，獲得逆轉錄病毒，每1111逆轉錄病毒加21118/1111的￠0171^61165 4 1，用0.45 9 III孔徑的濾器過濾，感染細胞，過夜后換新鮮培養基。48卜后加入終濃度為3 ^ 的830，同時設置對照。830篩選第4天，細胞開始明顯生長緩慢，失去細胞原有的多角形形態，細胞膜破裂，細胞崩解，并在轉代中不能貼壁，逐漸死亡。10(1左右，對照組細胞全部死亡，實驗組剩下僅5%細胞存活，維持篩選濃度，存活細胞開始恢復正常的生長速度及狀態(圖10幻。獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株⑶。
[0061]3)⑶基因的表達及活性檢測⑶細胞表達永生化基因37401及⑶、 雙自殺基因，168^61-11 610七及免疫熒光也證實細胞中⑶基因的蛋白水平表達(圖108)。⑶基因表達的胞嘧啶脫氨酶可將54(:轉變為有細胞毒性的⑴，帶有⑶基因的細胞可在有5-%的培養基中死亡。采用0、10、20、50、100、200、400^ 8加1的5-%作用于及⑶細胞，7(1后進行結晶紫染色及117檢測細胞抑制率，圖11結果顯示5-%對及⑶細胞均有明顯的細胞毒作用，隨著劑量增力口，作用逐漸增強，100 4 8加1濃度5-%對11^14-19-0)細胞的毒性作用為100%。5-%本身無毒性作用，對1^14-19細胞的抑制作用可能是由于配置5-%使用甲酸溶劑的因素，因此，真實的5-%濃度可能小于100 4 8加1。
[0062]4)攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株的體內⑶自殺基因活性檢測:腺病毒介導標記的和11^14-19-0)細胞分別植入裸鼠皮下，腹腔注射5-1^5001^/1?.山共10(1。于第0^5(1、10(1動態監測細胞的存活情況。在的作用下，⑶細胞的熒光值明顯弱于細胞(圖12),第10(1基本消失。#后取注射部位組織，均未見成瘤，細胞團塊消失。
[0063]5)自殺基因活性的檢測:采用(^0.010.033,0.1、
0.33,1,3.3,1011 的作用于11^14-19-0)細胞，自殺基因能誘導細胞在的環境中選擇性自殺，最適濃度為3.3 ^ 8/1111。06敲除^401及基因后，細胞能在6^中存活。的重組效率不是100%的，仍然有低水平37401及自殺基因的表達，經過篩選之后，^401表達消失(圖13),保證所有的細胞在體內應用之前去除永生化基因，增加了體內應用的安全性。
[0064]對照實驗組:將37401基因、⑶、基因及6即？示蹤基因整合入同一逆轉錄病毒載體(如圖14所示)中，采用一步法構建攜帶雙自殺基因的可回復永生化細胞，實驗結果如圖15所示，其存在以下問題，:
[0065]1、無法獲得穩定細胞株:測序顯示質粒構建成功，但轉染細胞的效率低下，單純質粒脂質體轉染后陽性細胞的表達僅為10?15%，且無法獲得高滴度的逆轉錄病毒，夕卜源基因不能有效整合入宿主細胞基因組0嫩中獲得穩定轉染細胞，稻瘟菌素篩選4次均失敗。
[0066]2、同時該方案不能有效表達重要的效應蛋白:瞬時表達后，能檢測到所有外源基因的1111？嫩水平表達，但是蛋白水平只能檢測到37401永生化基因，考慮⑶自殺基因與6即？融合表達，03蛋白的~端可能與抗體結合受阻，我們分別采用抗端和全長的03抗體，但是均不能檢測到⑶蛋白表達。位點特異重組成功但敲除效率不是100%，87401表達水平顯著降低，但仍能檢測到，⑶基因不能有效表達功能蛋白，不能清除掉未重組回復的永生化細胞。
[0067]3、的可控性表達無法實現:01~6~10^？重組前基因置于強啟動子證？1后面，可啟動1111？嫩水平表達，但⑶基因后面有終止密碼，只轉錄不翻譯。
重組之后，基因置于5-111？后面，5-1X1？的效率有限，無法啟動1137-11(基因的轉錄翻譯，由于0640逆的效率不是100%，仍然有一些細胞存在證？1啟動1137-11(,因此，的表達下降，但仍可檢測。
【權利要求】
1.一種可回復永生化肝細胞株的構建方法，從胚胎期12.5?14.5d天的小鼠肝臟中分離肝臟祖細胞，導入含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆轉錄病毒，篩選具有肝祖細胞標志及向成熟肝細胞分化功能的單克隆細胞株，再導入含有CD基因的逆轉錄病毒獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化小鼠肝祖細胞。
2.如權利要求1所述的可回復永生化肝細胞株的構建方法，所述含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆轉錄病毒結構如圖1-1所示。
3.如權利要求1或2所述的可回復永生化肝細胞株的構建方法，所述含有CD基因的逆轉錄病毒結構如圖1-2所示。
4.如權利要求1或2所述的可回復永生化肝細胞株的構建方法，包括以下步驟: (1)攜帶SV40T永生化基因和HSV-TK自殺基因的肝祖細胞構建，單克隆篩選及生物學性狀鑒定: ①從胚胎期12.5?14.5d的小鼠肝臟中分離出肝祖細胞；用攜帶SV40T永生化基因及HSV-TK自殺基因的逆轉錄病毒感染肝祖細胞，經潮霉素抗性加壓篩選獲得的永生化細胞呈克隆樣生長； ②單克隆細胞篩選:以有限稀釋法接種細胞于96孔培養板，至每孔一個細胞為止，潮霉素改半量維持；觀察96孔培養板中有單克隆細胞團形成的孔標記，待細胞融合度達80%時常規傳代，擴大培養，獲得多株單克隆細胞； ③單克隆細胞鑒定與篩選:以LC14d成熟肝細胞及Hepal-6肝腫瘤細胞株為對照，篩選能高表達DLK、POU5fl肝干/祖細胞標志，低表達AFP、ALB、CK18、CK19肝細胞特異基因的肝祖細胞； ④單克隆細胞的誘導分化鑒定:用Dex/DMSO體外誘導成熟肝細胞分化，進行PAS染色及ICG攝取篩選具有體外成熟肝細胞分化能力的細胞； ⑤可回復永生化的檢測:用腺病毒介導的Cre重組酶敲除兩個同向LoxP位點間的序列，48h后檢測到SV40大T抗原被可逆敲除，并檢測細胞增殖速度，通過熒光素酶報告基因檢測ALB表達水平，Western blot檢測細胞的體外誘導分化能力； ⑥單克隆細胞的安全性檢測:腺病毒介導fireflyIuciferase體內示蹤,將Luc標記后的細胞皮下植入裸鼠，分別于植入后第ld、lw、4w活體組織成像動態觀察植入細胞的生長情況； (2)導入CD自殺基因，構建攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株及功能鑒定: ①pSEB-⑶載體的構建及鑒定:及洲I/fe7 I酶切位點雙酶切帶有⑶自殺基因全長序列的PlRES-⑶質粒，獲得1300bp左右的特異性條帶，膠回收后連接至同樣雙酶切的PSEB-3F載體，經Amp篩選，菌落PCR獲得陽性克隆；提質粒，EcoR I /Sal I酶切獲得約2300bp的特異性條帶，測序檢測pSEB-CD質粒構建成功； ②導入⑶基因，構建攜帶雙自殺基因的肝祖細胞株:pSEB-⑶與pCL-Ampho包裝質粒共轉染HEK293細胞,獲得逆轉錄病毒，每ml逆轉錄病毒加2mg/ml的polybrene 5 μ 1，用.0.45 μ m孔徑的濾器過濾，感染步驟(I)所得單克隆肝祖細胞，過夜后換新鮮培養基，48h后加入終濃度為3 μ g/ml的BSD ；BSD篩選10d，保留存活細胞，維持篩選濃度，存活細胞開始恢復正常的生長速度及狀態，獲得攜帶雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株； ③CD基因的表達及活性檢測Westernblot及免疫熒光檢測細胞中CD基因的蛋白水平表達；采用100 μ g/ml的5-氟胞嘧啶作用于細胞株，7d后進行結晶紫染色及MTT檢測細胞抑制率； ④攜帶CD自殺基因的肝祖細胞株的體內安全性檢測:將Luc標記的雙自殺基因的可回復永生化肝祖細胞株植入裸鼠皮下，體內給藥5-FC，于植入后第O天、5天、10天檢測細胞的存活情況； ⑤Cre-LoxP重組效率及HSV-TK自殺基因活性的檢測:采用3.3 μ g/ml的GCV作用于細胞株檢測，CRE敲除SV40T及HSV-TK基因后，在GCV中存活細胞，SV40T表達完全消失。
【文檔編號】C12N15/867GK104450620SQ201410252305
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】畢楊, 何昀, 何通川, 唐霓, 黃佳祎 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院