以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法
【專利摘要】本發明以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法，涉及甘露醇的制備方法，將榨得的甘蔗汁經離心與過濾，添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液，再經冷滅菌制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液作為培養基待用；將活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液培養基中，再經培養制得發酵液和分離純化制得甘露醇。本發明方法降低了培養基的成本，從而克服了微生物發酵法生產甘露醇的瓶頸問題。
【專利說明】以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明的技術方案涉及甘露醇的制備方法，具體地說是以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法。
【背景技術】
[0002]甘露醇被廣泛的應用于醫藥、食品、化工和電子等行業。全球甘露醇消費量約占多元醇總量的11%，每年約為15萬噸。美國是甘露醇的最大消費國。其它如歐洲國家，用于生產口香糖、口含片和嘴嚼片的用量均較大。我國目前甘露醇消費主要是直接用于生產甘露醇注射液、藥品輔助添加劑和無糖型食品添加劑等。由于食品行業尤其是口香糖對甘露醇需求量快速增加，甘露醇市場容量迅速擴大。甘露醇在醫藥行業用量較大，目前我國僅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500噸，2003年醫藥行業消費甘露醇5600噸。近年來我國肥胖和糖尿病較為嚴重，而且有越來越嚴重的趨勢，因此對無糖并具有營養的甜味劑甘露醇需求潛力巨大，2004年我國食品及其添加劑領域對甘露醇的需求量約3000噸。
[0003]現有技術生產甘露醇的方法主要有四種:
(1)海帶提取法:提取I噸甘露醇約需13-15噸干海帶，生產過程產生大量廢水，能耗高，污染嚴重，收率低；
(2)催化加氫法:以蔗糖或葡萄糖為原料的鎳(Ni)催化高溫高壓加氫具有原料來源穩定，生產期限不受限制，成本低，但是其產率較低，且伴生的山梨醇不易分離； (3)酶轉化法:酶法氫化需要在體系中加入價格昂貴的輔酶(NADH)，不經濟；
(4)微生物發酵法:自然界中能合成甘露醇的微生物種類較多，細菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有產甘露醇的能力。其中，用乳酸細菌發酵轉化甘露醇，以甘露醇為主要產物，同時產乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不產生其它多元醇等副產物，因而所得甘露醇產物易于分離純化及精制，并且工藝條件溫和，轉化率較高。同時乳酸細菌是美國FDA認可的GRAS菌，是一種相對安全的菌種，因而用乳酸細菌來生產甘露醇的研發有著明顯的優勢。乳酸細菌又分為同型乳酸發酵細菌和異型乳酸發酵細菌，采用同型乳酸發酵細菌可以只能將葡萄糖經6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、1-磷酸甘露醇等中間化合物轉化為甘露醇，并且產量低于異型乳酸發酵細菌；采用異型乳酸發酵細菌中的明串珠菌則可以將果糖或蔗糖中的果糖部分直接轉化為甘露醇，例如，CN201310537851.5公開的以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法和CN 201410065372.2披露的一株明串珠菌突變菌株及其構建方法和應用方法，這些方法不但產量高于同型乳酸發酵細菌，而且因為明串珠菌的染色體基因組大小只有2Mb左右，故發酵周期短。然而CN201310537851.5和CN 201410065372.2仍然存在培養基成本較高的缺陷，這些缺陷成為微生物發酵法生產甘露醇的瓶頸問題。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是:提供以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法，是一種以甘蔗汁為原料的制備培養基和腸膜明串珠菌應用該培養基發酵產甘露醇的方法，降低了培養基的成本，從而克服了微生物發酵法生產甘露醇的瓶頸問題。
[0005]本發明解決該技術問題所采用的技術方案是:以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法，步驟如下:
第一步，以甘蔗汁-紅糖為原料制備培養基:
(1.1)準備用具:
將夾有0.2 μ m濾膜的濾器A用牛皮紙包裝好，然后與封口的IOOmL三角瓶一起放入高壓滅菌鍋內，于121°C滅菌20分鐘，準備好滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A和滅菌的IOOmL二角瓶；
(1.2)榨甘蔗汁:
稱取3350克甘蔗，去皮后切成條狀，放入果汁機中榨取甘蔗汁；
(1.3)甘蔗汁的離心與過濾:
取上一步(1.2)制得的1050mL甘蔗汁液用轉速為13000轉/分的離心機離心30分鐘，取得甘蔗汁上清液A IOlOmL ;再把甘蔗汁上清液A用夾有0.2μπι濾膜的濾器B過濾而獲得甘鹿汁濾液B 1005mL ；
(1.4)添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液:
往上述甘蔗汁濾液B 1005mL中加入紅糖2.5克并攪拌使其完全溶解，從而獲得甘蔗汁-紅糖濾液C ；
(1.5)冷滅菌:
在超凈工作臺的酒精燈附近將上述步驟(1.4)制得的甘蔗汁-紅糖濾液C用上述步驟
(1.1)準備好的滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A過濾，制備得到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 1000mL,在上述步驟(1.1)準備好的滅菌的IOOmL三角瓶中加入剛制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL后封口，作為下一步的培養基待用；
第二步，用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇:
(2.1)活化腸膜明串珠菌菌種:
將腸膜明串珠菌以1%接菌量加入到已經置于50mL的三角瓶內的IOmLMRS培養基中，振蕩培養12~16小時；
(2.2)接腸膜明串珠菌:
在超凈工作臺的酒精燈附近將上述步驟(2.1)活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到上述步驟(1.5)經冷滅菌制得的置于IOOmL三角瓶內的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL中；
(2.3)培養制得發酵液:
將上述步驟(2.2)接腸膜明串珠菌后的三角瓶置于搖床中，在30°C下以120轉/分的速度振蕩培養24小時，制得發酵液40mL ；
(2.4)分離純化:
將上述步驟(2.3)培養制得的發酵液40mL用轉速為10000轉/分的離心機離心10分鐘，去除菌體沉淀得發酵上清液A 37mL ;在發酵上清液A 37mL中加入等量體積的乙醇，用轉速為12000轉/分的離心機離心15分鐘，去除葡聚糖沉淀得發酵上清液B 74mL，將發酵上清液B 74mL在4°C結晶即制得甘露醇1.16克。
[0006] 上述以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法，所用的腸膜明串珠菌的分類命名為腸膜明串珠菌，拉丁文學名是Leuconostoc mesenteroides,該微生物(株)已于2009年11月由保藏中心收到，并登記入冊，保藏日期為2009年12月31日，保藏單位全稱是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號=CGMCCl.10327。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心于2013年09月12日發出存活性報告書。
[0007]本發明的有益效果是:與現有技術相比，本發明方法的顯著進步如下:
(I)本發明是屬于用乳酸細菌來生產甘露醇的方法，與現有的海藻提取法、催化加氫法和酶轉化法相比，不僅能耗低和收率高，更主要的是生產過程中沒有污染，是環境友好的，符合產業發展方向。
[0008](2)與現有技術CN20131053785L 5、CN 201410065372.2和其它現有技術相比，本
發明方法的培養基的成本大幅度降低。下表列出了本發明方法與現有技術的培養基的成本對比，可見本發明方法的經濟效益十分突出。
【權利要求】
1.以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其特征在于步驟如下: 第一步，以甘蔗汁-紅糖為原料制備培養基: (1.1)準備用具: 將夾有0.2 μ m濾膜的濾器A用牛皮紙包裝好，然后與封口的IOOmL三角瓶一起放入高壓滅菌鍋內，于121°C滅菌20分鐘，準備好滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A和滅菌的IOOmL二角瓶； (1.2)榨甘蔗汁: 稱取3350克甘蔗，去皮后切成條狀，放入果汁機中榨取甘蔗汁； (1.3)甘蔗汁的離心與過濾: 取上一步(1.2)制得的1050mL甘蔗汁液用轉速為13000轉/分的離心機離心30分鐘，取得甘蔗汁上清液A IOlOmL ;再把甘蔗汁上清液A用夾有0.2μπι濾膜的濾器B過濾而獲得甘鹿汁濾液B 1005mL ； (1.4)添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液: 往上述甘蔗汁濾液B 1005mL中加入紅糖2.5克并攪拌使其完全溶解，從而獲得甘蔗汁-紅糖濾液C ； (1.5)冷滅菌: 在超凈工作臺的酒精燈附近將上述步驟(1.4)制得的甘蔗汁-紅糖濾液C用上述步驟(1.1)準備好的滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A過濾，制備得到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 1000mL,在上述步驟(1.1)準備好的滅菌的IOOmL三角瓶中加入剛制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL后封口，作為下一步的培養基待用； 第二步，用腸膜明串珠菌發酵產甘露醇: (2.1)活化腸膜明串珠菌菌種: 將腸膜明串珠菌以1%接菌量加入到已經置于50mL的三角瓶內的IOmLMRS培養基中，振蕩培養12~16小時； (2.2)接腸膜明串珠菌: 在超凈工作臺的酒精燈附近將上述步驟(2.1)活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到上述步驟(1.5)經冷滅菌制得的置于IOOmL三角瓶內的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL中； (2.3)培養制得發酵液: 將上述步驟(2.2)接腸膜明串珠菌后的三角瓶置于搖床中，在30°C下以120轉/分的速度振蕩培養24小時，制得發酵液40mL ； (2.4)分離純化: 將上述步驟(2.3)培養制得的發酵液40mL用轉速為10000轉/分的離心機離心10分鐘，去除菌體沉淀得發酵上清液A 37mL ;在發酵上清液A 37mL中加入等量體積的乙醇，用轉速為12000轉/分的離心機離心15分鐘，去除葡聚糖沉淀得發酵上清液B 74mL，將發酵上清液B 74mL在4°C結晶即制得甘露醇1.16克。
【文檔編號】C12R1/01GK104017831SQ201410254455
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】金紅星, 成文玉, 李海超 申請人:河北工業大學