一種綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法

一種綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法
【專利摘要】本發明涉及一種綿羊精原干細胞的分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法，包括制備各種溶液，然后從3-4月齡的綿羊睪丸中取2-3g曲細精管組織塊，經過兩步酶解消化制備單細胞懸液，進而用差別貼壁法分離純化精原干細胞，使用SSCM培養液實現綿羊精原干細胞的傳代長期培養，對傳代長期培養的綿羊精原干細胞進行凍存和復蘇的方法。本發明提供的技術方案實現了不需使用特定的綿羊精原干細胞抗體就能獲得純度較高的綿羊精原干細胞，建立了綿羊精原干細胞傳代長期培養體系、成功地建立了液氮冷凍法長期保存綿羊精原干細胞的方法。使用本發明提供的方法分離純化并且傳代的綿羊精原干細胞至少已經培養達40代以上，如果加上凍存時間，最長的培養期已達4年。
【專利說明】一種綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法【技術領域】
[0001]本發明涉及家畜種質資源保存和優良品種繁育、組織器官再生等生物【技術領域】，具體涉及一種綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法。
【背景技術】
[0002]精原干細胞(SSCs)是最重要的成體干細胞之一。精原干細胞不僅有傳宗接代的遺傳功能，近來研究顯示，精原干細胞很容易通過退分化產生多能干細胞，這使得精原干細胞操作技術得到生命科學、農業科學和醫學各路專家的垂青。自從精原干細胞移植技術建立以來，精原干細胞的研究開始加速，2000年后，建立了小鼠和大鼠精原干細胞的體外長期培養方法，精原干細胞基礎研究和應用研究都得到了迅速的發展。一方面，培養的精原干細胞經過遺傳修飾再移植到受體睪丸，通過精子發生過程產生轉基因的精子，進而繁殖出轉基因動物。另一方面，培養的精原干細胞通過退分化產生生殖多能干細胞，用于再生醫學研究，將能夠應用于損傷的組織器官的再生修復。因此精原干細胞在生殖生物學研究、轉基因動物技術研究、退分化誘導產生多能干細胞研究、動物種質資源保存研究及組織器官康復臨床醫療研究上具有重要意義。
[0003]在遺傳育種領域，父系的遺傳性狀是通過精原干細胞分化產生的精子通過受精傳給后代的。以前綿羊繁殖及綿羊品種改良的體外研究(或稱試管研究)集中在卵母細胞上。隨著近十多年來對精原干細胞研究的進展，綿羊精原干細胞增殖和分化研究在綿羊繁殖及綿羊品種改良研 究中的作用和意義越來越明顯。通過精原干細胞移植將為綿羊雜種遺傳優勢的利用提供新的技術路線。因為雜交育種技術的實際應用往往存在一些實際困難，比如必須首先形成和保留大量的各自獨立的種群(品種或品系)，這需要大量的工作和成本，但如果采用優良性狀突出的公綿羊的精原干細胞做為品種資源，那么就把問題簡化了。只要用這頭公綿羊睪丸制備精原干細胞，進行增殖并冷凍保存，這就是一個很好的綿羊品種。需要時就將它復蘇培養，再對受體公綿羊進行精原干細胞移植，就會產生出我們需要的優良綿羊的精子。只要保留優良公綿羊的精原干細胞，就保留了一個優良的綿羊品種，省去了耗時費力的保留大量種群的工作。另外，雜交育種工作的另一個難題是，本地品種和外來優良品種之間的自然條件或飼養條件相差很大，難以進行雜交育種，但是如果在本地綿羊品種中制備受體，用外來優良品種制備精原干細胞，然后將外來優良綿羊品種的精原干細胞注入本地綿羊受體睪丸，由本地受體公綿羊產生出外來優良品種的精子，用于與本地品種母綿羊進行雜交，預期能獲得性狀優良的綿羊雜種后代。
[0004]但是，綿羊精原干細胞的分離純化和長期培養至今仍然是世界難題。精原干細胞研究最著名的專家Brinster帶領的研究組2008年曾經發表論文說過大動物精原干細胞長期培養方法的建立還需要5至10年的研究。雖然鼠類的精原干細胞長期培養方法已經建立，由于種族差別、基因庫差別、市售抗體不能通用等多種因素的存在，綿羊精原干細胞的長期培養方法不能照搬鼠類的方法。鑒于綿羊精原干細胞長期培養技術意義重大，不僅具有理論價值，在農牧業和醫學上還具有經濟應用價值和社會價值，美、歐、日、澳、韓等國均有科研組織致力于綿羊精原干細胞長期培養的研究，曾有綿羊精原干細胞的純化、鑒定方面的報道，但是也存在分離純化技術復雜，分離到的精原干細胞少，純度不高的問題，特別是整套的綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的技術操作體系還沒有成功的報道。
[0005]另外，目前的精原干細胞分離純化方法主要有:隱睪手術富集法、酶解法、Percoll密度梯度離心法、流式細胞術分選法、免疫磁珠分選法、差異貼壁法等方法等。流式細胞術分選法和免疫磁珠分選法在鼠類精原干細胞中應用效果較好，但是兩種方法都需要有與所研究物種的精原干細胞表面抗原特異性很好結合的抗體，而目前適用于綿羊精原干細胞的抗體并不常見，因此在綿羊精原干細胞的研究中并不適于使用流式細胞術分選法和免疫磁珠分選法。而隱睪手術富集法和Percoll密度梯度離心法都不能得到高純度的精原干細胞，而且在實踐中發現Percoll密度梯度離心法對精原干細胞的活力有影響，至今為止在成功的精原干細胞培養技術中還沒有采用這兩種方法的報道。
[0006]目前已有本領域技術研究人員使用酶解法+差異貼壁法成功分離精原干細胞的報道，但是使用酶解法+差異貼壁法的關鍵在于制備的單細胞懸浮液中含有的精原干細胞要純度高、數量多、活性好，而不同動物睪丸生精上皮細胞的組織結構各有差異，使用酶解法消化周邊組織、釋放支持細胞和精原干細胞時，消化酶的種類和濃度、作用強度(轉速)、消化時間、緩沖液成分等都是影響消化程度的因素，任何一個因素不合適，都影響生精上皮的消化和釋放精原干細胞，導致單細胞懸浮液中的精原干細胞數量少質量差，最后通過差異貼壁法純化也不能獲得足夠數量的活力好的精原干細胞；就算制備了高質量的單細胞懸浮液，在純化精原干細胞的操作過程中，分離順序、分離時間、沖洗次數、沖洗力度等具體操作方法又都是影響最后收集的精原干細胞數量和質量的因素，掌握不好時照樣不能獲得高活力的精原干細胞。因此，雖然酶解法+差異貼壁法從原理上看比較簡單，使用的器械和試劑也都比較常用，但是由于物種不同、各個操作環節的要求不同、實驗人員的操作習慣不同，會直接影響精原干細胞的分離純化效果。可見每一步的操作細節都是很重要的，差之毫厘失之千里，細節決定成敗。正是因為沒有抓住細節，致使用酶解法+差異貼壁法成功分離純化綿羊精原干細胞的方法還沒有成功的報道。在目前國內外已報道的使用酶解法+差異貼壁法分離純化某個物種精原干細胞的科技文獻中，只強調酶解法和差異貼壁法的作用機理，而忽視各個操作細節，但是精原干細胞是有生物活性的細胞，任何外在因素都會對細胞的分離釋放、保持活性或者死亡等有直接影響，因此參考這些科技文獻，往往進行多次試驗，也很難成功地分離純化出精原干細胞。

【發明內容】

[0007]為解決上述問題，本發明提出一種細化的綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養、凍存及復蘇的方法，旨在提供一種不需要特定的綿羊精原干細胞抗體，使用酶解法+差異貼壁法分離純化綿羊精原干細胞的方法體系，從中獲得的精原干細胞純度高、數量多、活力好、易于培養，在這個基礎上對綿羊精原干細胞進行傳代長期培養、凍存及復蘇，從而建立起一整套操作技術體系。
[0008] 本發明的一種綿羊精原干細胞分離純化的方法，包括以下步驟:[0009]第一步:配制溶液:
[0010]I)將體積百分比為0.1%的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液A，兩周內使用；
[0011]2)將IV型膠原酶以20mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液中制成IV型膠原酶儲備液，_20°C保存；
[0012]3)將透明質酸酶以10mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液中制成透明質酸酶儲備液，_20°C保存；
[0013]4)將DnaseI以5mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液，再加入體積百分比為20%的甘油，制成DnaseI儲備液，_20°C保存；
[0014]5)將體積百分比為0.5%的Trypsin和濃度為2mM EDTA溶于PBS緩沖液中制成Trypsin/EDTA 儲備液，_20°C保存；
[0015]6)將體積百分比為10%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液C，兩周內使用；
[0016]7)將體 積百分比為5.5%的馬血清、2.4%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液B，兩周內使用；
[0017]8)將30 μ M的巰基乙醇加入培養液C中，過濾滅菌制成培養液D，現配現用；
[0018]9)將體積百分比為0.52%的牛血清白蛋白溶于PBS緩沖液中，過濾滅菌制成PBS-BSA溶液，現配現用；
[0019]第二步:利用綿羊睪丸組織制備單細胞懸浮液，無菌條件下操作步驟依次如下:
[0020]I)從3-4月齡的綿羊睪丸中取2_3g曲細精管組織塊，放入載有2.5ml培養液A的100mL培養皿中，用鑷子除去曲細精管組織塊上的睪丸白膜和較大的血管；
[0021]2)將所剩的組織塊放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持續剪3分鐘；
[0022]3)將剪碎的組織塊轉移到一個100mL帶蓋的大口瓶中，補加培養液A至7.5ml ；
[0023]4)進行第一步酶消化，具體操作如下:在上述100mL帶蓋的大口瓶中加入0.63ml的IV型膠原酶儲備液，置于37 °C水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩40min ;隨后加入0.825ml的透明質酸酶儲備液和0.125ml的DnaseI儲備液，繼續置于37°C水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩20min，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；此操作先用膠原酶消化40min，再加入透明質酸酶，兩種酶共同作用20min，能得到良好的消化效果，既能使曲細精管的膜蛋白得到較大限度的消化，又不會對管內細胞造成較大的損傷；
[0024]5)從水浴搖床中取出100mL帶蓋的大口瓶中，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；
[0025]6)將上述100mL帶蓋的大口瓶中的懸浮液轉入50ml離心管，以2000rpm的轉速離心6min,除去上清液；
[0026]7)在步驟6)所述離心管中加入12ml的PBS緩沖液，搖勻使沉淀物重新懸浮，以2000rpm的轉速離心6min,除去上清液；
[0027]8)重復步驟7的操作一次；
[0028]9)在步驟8)所述離心管中加入0.75ml的培養液A重新懸浮沉淀物，再加入1ml的Trypsin/EDTA儲備液和0.25ml的DNaseI儲備液，置于37°C水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩lOmin，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；Trypsin/EDTA可以消化細胞外粘附蛋白，DNaseI可以除去長鏈DNA分子，降低細胞懸浮液的粘度，這兩種溶液共同作用有利于形成單細胞懸浮液；
[0029]10)立即在步驟9)所述離心管中加入IOml的培養液C，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物直到明顯的塊狀物消失；培養液C中的胎牛血清可以終止酶消化反應，阻止細胞膜受損，維持生殖細胞活力；
[0030]11)將步驟10)所述離心管以2000rpm的轉速離心6min,除去上清液,然后用2ml
培養液C重懸細胞；確保消化反應徹底終止,保證生殖細胞活力；
[0031]12)先用200目然后用300目尼龍過濾器分別過濾步驟11)所述細胞懸浮液；除去沒有消化完全的組織碎片和細胞團；
[0032]13)將步驟12)所述的過濾后的細胞懸浮液用IOml移液管溫和地吸吹5_10次，進行細胞計數，然后加入培養液C調整細胞密度至1.25xl06細胞/ml，制成單細胞懸浮液；此時的單細胞懸浮液中主要是體細胞和生殖細胞；
[0033]第三步:從第二步所述分離培養的單細胞懸浮液中純化精原干細胞，操作步驟依次如下:
[0034]I)將IOml第二步步驟13)所述的單細胞懸浮液鋪于直徑為IOOmm的明膠包被培養皿，放在32.50C ,5.5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中，培養2天半到3天半； [0035]2)用5ml移液管從步驟I)中所述培養皿中溫和地移除所有培養液；
[0036]3)先用培養液A洗細胞:從培養皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的培養液A，溫和地來回晃動培養皿I次，然后用移液管移除培養液；此操作用于洗去培養皿中的死細胞；
[0037]4)再用PBS緩沖液洗細胞兩次:從培養皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的PBS緩沖液，溫和地來回晃動培養皿I次，立即用移液管移除上清液，再重復操作一次；此操作繼續洗去培養皿中的死細胞；此時體細胞被明膠吸附，而生殖細胞則吊在體細胞上；
[0038]5)加4ml培養液A至培養皿中，用移液管吸吹培養液A輕輕沖洗培養皿整個表面大約2遍；通過培養液A對生殖細胞的沖洗力，可以將吊在體細胞上的生殖細胞沖洗到沖洗液中，所以，此時體細胞仍被明膠吸附，而沖洗液里大部分是生殖細胞；
[0039]6)將步驟5)所述培養皿中的沖洗液轉移到無菌的50ml離心管中；
[0040]7)將步驟6)所述離心管于2000rpm離心6min，移去上清液，保留細胞沉淀；
[0041]8)在步驟7)所述離心管中加入4ml的培養液B重懸細胞；
[0042]9)在collagen I包被的培養皿中加入4ml培養液B，再鋪上步驟8)所述細胞懸浮液，然后將培養皿放進32.5°C、5.5 % CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育2小時；
[0043]10)從培養箱中取出培養皿，用5ml移液管溫和地在培養皿表面反復吸吹5-10次，使細胞混合，再將培養皿放回培養箱中繼續培養2小時；
[0044]11)從培養箱中取出培養皿后，用5ml移液管在培養皿中溫和地吸吹細胞懸浮液，直至沖洗過整個培養皿表面，再用5ml移液管從培養皿中收集collagen I不吸附的細胞懸浮液，全部轉移到50ml離心管中；這時被collagen I吸附的細胞大部分是分化的生殖細胞，細胞懸浮液中未被吸附的大部分是精原干細胞；
[0045]12)將步驟11)所述離心管在2000rpm下離心6min,沉淀細胞,除去上清液,用4ml培養液D懸浮細胞，然后吸取細胞懸浮液通過200目尼龍過濾器，用50ml試管收集濾液；培養液D中加入了 β_巰基乙醇，具有抗氧化作用，對精原干細胞有保護作用；[0046]13)迅速地將步驟12)得到的濾液用5ml移液管溫和的吸吹4_5次，然后將混合好的濾液按每孔Iml鋪入Laminin包被的12孔培養板，其中所述培養板預先準備好，臨用時先移除每個孔中的上清液，再加入1ml培養液A清洗，移除所有培養液A后才鋪入上述濾液；此步驟操作必須迅速才能更好地保護分離得到的精原干細胞；
[0047]14)將步驟13)所述培養板置于32.5°C，5.5 % CO2，飽和濕度的細胞培養箱中孵育20-40分鐘，然后取出，用Iml微量移液管非常溫和的吸吹所述培養板的培養孔表面一遍，使孔中的細胞懸浮液上下層混合，然后迅速放回培養箱中繼續孵育10-30分鐘；孵育時間非常關鍵，或長或短都會直接影響最后純化獲得的精原干細胞的數量和質量；
[0048]15)將步驟14)所述培養板取出，用Iml微量移液管吸吹一次，使孔中細胞懸浮液混合均勻，此時懸浮液中的細胞為Laminin不粘附細胞，將這些細胞懸浮液從培養孔中移走，然后，立即在培養孔中加入1ml新鮮配制的培養液D洗培養孔表面一遍，然后移走培養孔中的培養液D，立即再次向孔中加入1ml新鮮配制的培養液D。培養液D要溫和且均勻地滴加在孔的整個表面，孔中粘附的細胞為Laminin粘附細胞；此時Laminin粘附細胞就是精原干細胞，而移走的Laminin不粘附細胞為分化了的生殖細胞；
[0049]16)用Iml微量移液管從步驟15)所述培養孔中移走培養液D，然后立即向培養孔內加入1ml PBS-BSA溶液，然后將培養板放入32.5°C，5.5 % CO2,飽和濕度的細胞培養箱內，孵育3-6分鐘，同時在一個50ml的無菌試管中加入4ml培養液D備用；
[0050]17)將步驟16)所述培養板取出，立即用Iml移液管在培養孔中溫和的吹吸PBS-BSA溶液5-10次，使Laminin粘附細胞從培養孔上脫壁，收集含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液，將含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液轉移到含有培養液D的50ml離心管中；PBS-BSA溶液可以從Laminin平板上洗脫粘附的精原干細胞；
[0051]18)將步驟17)所述離心管在2000rpm轉速下離心6min,移除上清液,倒轉試管，溫和地除去剩余的液體；
[0052]19)在步驟18)所述離心管中加入1ml培養液D重新懸浮細胞，用細胞計數板測定細胞濃度；
[0053]20)通過免疫熒光細胞染色法鑒定步驟19)所述細胞懸浮液中的細胞就是綿羊精原干細胞。
[0054]只要嚴格按照上述綿羊精原干細胞分離純化方法進行操作，任何細胞實驗室的研究人員都能成功分離純化出精原干細胞，而且經過不同實驗室不同操作人員，包括教授及普通研究生的操作實踐表明，采用以上方法均能成功分離純化出綿羊精原干細胞，制備的綿羊精原干細胞純度可達90%以上。
[0055]對上述綿羊精原干細胞的傳代長期培養方法，包括以下步驟:
[0056]第一步:配制溶液:
[0057]I)將體積百分比為7%的胎牛血清加入DMEM/F12培養液中制成STO細胞培養液；
[0058]2)將體積百分比為20%的胎牛血清、10%的二甲基亞砜加入DMEM/F12培養液中制成STO細胞凍存液；
[0059] 3)在ImlSSCB溶液中，分別添加20ng/μ I的膠質細胞源性神經營養因子儲備液I μ 1-2μ l,20ng/y I的堿性成纖維細胞生長因子儲備液I μ IUOOng/μ I的膠質細胞系源性神經營養因子受體α I樣蛋白抗體儲存液I μ l、100kU/ml的青霉素儲存液I μ 1、100mg/ml的鏈霉素儲存液I μ 1、2.5mg/ml的抗真菌劑儲存液I μ 1，混合均勻制成SSCM培養液；SSCM是專門為家畜精原干細胞制備的培養液，長期實踐證明能有效培養精原干細胞；
[0060]其中所述I升SSCB溶液所包含的組分為:
[0061]
【權利要求】
1.一種綿羊精原干細胞分離純化的方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步:配制溶液: . 1)將體積百分比為0.1 %的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液A，兩周內使用； .2)將IV型膠原酶以20mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液中制成IV型膠原酶儲備液，-20°C保存； . 3)將透明質酸酶以10mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液中制成透明質酸酶儲備液，_20°C保存； .4)將DnaseI以5mg/ml的濃度加入DMEM低糖培養液，再加入體積百分比為20%的甘油，制成DNaseI儲備液，_20°C保存； . 5)將體積百分比為0.5 %的Trypsin和濃度為2mM EDTA溶于PBS緩沖液中制成Trypsin/EDTA 儲備液，_20°C保存； . 6)將體積百分比為10%的胎牛血清和0.1%的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液C，兩周內使用；. 7)將體積百分比為5.5%的馬血清、2.4%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌劑加入DMEM/F12培養液中制成培養液B，兩周內使用； 8)將30μ M的β-硫基乙醇加入培養液C中，過濾滅菌制成培養液D，現配現用； 9)將體積百分比為0.52%的牛血清白蛋白溶于PBS緩沖液中，過濾滅菌制成PBS-BSA溶液，現配現用； 第二步:應用兩步酶解法制備綿羊睪丸組織單細胞懸浮液，無菌條件下操作步驟依次如下: . 1)從3-4月齡的綿羊睪丸中取2-3g曲細精管組織塊，放入載有2.5ml培養液A的.100mL培養皿中，用鑷子除去曲細精管組織塊上的睪丸白膜和較大的血管； .2)將所剩的組織塊放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持續剪3分鐘； .3)將剪碎的組織塊轉移到一個100mL帶蓋的大口瓶中，補加培養液A至7.5ml ； . 4)進行第一步酶消化，具體操作如下:在上述100mL帶蓋的大口瓶中加入0.63ml的IV型膠原酶儲備液，置于37°C水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩40min ;然后加入0.825ml的透明質酸酶儲備液和0.125ml的DNaseI儲備液，繼續置于37°C水浴搖床中，以90rpm的轉速搖蕩20min。 . 5)從水浴搖床中取出100mL帶蓋的大口瓶，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次； . 6)將步驟5)所述100mL帶蓋的大口瓶中的懸浮液轉入50ml離心管，以2000rpm的轉速離心6min,除去上清液； . 7)在步驟6)所述離心管中加入12ml的PBS緩沖液，搖勻使沉淀物重新懸浮，以.2000rpm的轉速離心6min,除去上清液； .8)重復步驟7的操作一次； . 9)進行第二步酶解，在步驟8)所述離心管中加入0.75ml的培養液A重新懸浮沉淀物，再.加入1ml的Trypsin/EDTA儲備液和0.25ml的DNaseI儲備液，置于37°C水浴搖床中，以.90rpm的轉速搖蕩lOmin，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物5次；10)在步驟9)所述離心管中加入IOml的培養液C，用IOml移液管溫和地上下吸吹懸浮物直到明顯的塊狀物消失； 11)將步驟10)所述離心管以2000rpm的轉速離心6min,除去上清液,然后用2ml培養液C重懸細胞； 12)先用200目尼龍過濾器然后用300目尼龍過濾器分別過濾步驟11)所述細胞懸浮液； 13)將步驟12)所述的過濾后的細胞懸浮液用IOml移液管溫和地吸吹5-10次，進行細胞計數，然后加入培養液C調整細胞密度至1.25xl06細胞/ml，制成單細胞懸浮液； 第三步:從第二步所述單細胞懸浮液中純化精原干細胞，操作步驟依次如下: 1)將IOml第二步步驟13)所述的單細胞懸浮液鋪于直徑為IOOmm的明膠包被培養皿，放在32.50C ,5.5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中，培養2天半至3天半； 2)用5ml移液管從步驟I)中所述培養皿中溫和地移除所有培養液； 3)先用培養液A洗細胞 :從培養皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的培養液A，溫和地來回晃動培養皿I次，然后用移液管移除培養液； 4)再用PBS緩沖液洗細胞兩次:從培養皿的邊緣緩慢加入4ml預熱的PBS緩沖液，溫和地來回晃動培養皿I次，立即用移液管移除上清液，再重復操作一次； 5)加4ml培養液A至培養皿中，用移液管吸吹培養液A輕輕沖洗培養皿整個表面大約2遍； 6)將步驟5)所述培養皿中的沖洗液轉移到無菌的50ml離心管中； 7)將步驟6)所述離心管于2000rpm離心6min,移去上清液,保留細胞沉淀； 8)在步驟7)所述離心管中加入4ml的培養液B重懸細胞； 9)在collagenI包被的培養皿中加入4ml培養液B，再鋪上步驟8)所述細胞懸浮液，然后將培養皿放進32.5°C、5.5 % CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育2小時； 10)從培養箱中取出培養皿，用5ml移液管溫和地在培養皿表面反復吸吹5-10次，使細胞混合，再將培養皿放回培養箱中繼續培養2小時； 11)從培養箱中取出培養皿后，用5ml移液管在培養皿中溫和地吸吹細胞懸浮液，直至沖洗過整個培養皿表面，再用5ml移液管從培養皿中收集collagen I不吸附的細胞懸浮液，全部轉移到50ml離心管中； 12)將步驟11)所述離心管在2000rpm下離心6min,沉淀細胞,除去上清液,用4ml培養液D懸浮細胞，然后吸取細胞懸浮液通過200目尼龍過濾器，用50ml試管收集濾液； 13)迅速地將步驟12)得到的濾液用5ml移液管溫和的吸吹4_5次，然后將混合好的濾液按每孔Iml鋪入Laminin包被的12孔培養板，其中所述培養板預先準備好，臨用時先移除每個孔中的上清液，再加入1ml培養液A清洗，移除所有培養液A后才鋪入上述濾液； 14)將步驟13)所述培養板置于32.5°C,5.5 % CO2，飽和濕度的細胞培養箱中孵育20-40分鐘，然后取出，用Iml微量移液管非常溫和的吸吹所述培養板的培養孔表面一遍，使孔中的細胞懸浮液上下層混合，然后迅速放回培養箱中繼續孵育10-30分鐘； 15)將步驟14)所述培養板取出，用Iml微量移液管吸吹一次，使孔中細胞懸浮液混合均勻，此時懸浮液中的細胞為Laminin不粘附細胞，將這些細胞懸浮液從培養孔中移走，然后，立即在培養孔中加入1ml新鮮配制的培養液D，再用Iml微量移液管吸吹培養孔表面一遍，然后移走培養孔中的培養液D，立即再次向孔中加入1ml新鮮配制的培養液D。培養液D要溫和且均勻地滴加在孔的整個表面，孔中粘附的細胞為Laminin粘附細胞； 16)用Iml微量移液管從步驟15)所述培養孔中移走培養液D，然后立即向培養孔內加入Iml新鮮配制的PBS-BSA溶液，然后將培養板放入32.5°C，5.5 % CO2,飽和濕度的細胞培養箱內，孵育3-6分鐘，同時在一個50ml的無菌試管中加入4ml培養液D備用。 17)將步驟16)所述培養板取出，立即用Iml移液管在培養孔中溫和的吹吸PBS-BSA溶液5-10次，使Laminin粘附細胞從培養孔上脫壁，收集含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液，將含有Laminin粘附細胞的PBS-BSA溶液轉移到含有培養液D的50ml離心管中； 18)將步驟17)所述離心管在2000rpm轉速下離心6min,移除上清液,倒轉試管,溫和地除去剩余的液體； 19)在步驟18)所述離心管中加入1ml培養液D重新懸浮細胞，用細胞計數板測定細胞密度； 20)通過免疫熒光細胞染色法鑒定步驟19)所述細胞懸浮液中的細胞就是綿羊精原干細胞。
2.通過權利要求1所述綿羊精原干細胞分離純化方法制備的綿羊精原干細胞。
3.對權利要求2所述綿羊精原干細胞的傳代長期培養方法，包括以下步驟: 第一步:配制 溶液: 1)將體積百分比為7%的胎牛血清加入DMEM/F12培養液中制成STO細胞培養液； 2)將體積百分比為20%的胎牛血清、10%的二甲基亞砜加入DMEM/F12培養液中制成STO細胞凍存液； 3)在ImlSSCB溶液中，分別添加20ng/μ I的膠質細胞源性神經營養因子儲備液Iμ 1-2μ l,20ng/y I的堿性成纖維細胞生長因子儲備液I μ IUOOng/μ I的膠質細胞系源性神經營養因子受體α I樣蛋白抗體儲存液I μ l、100kU/ml的青霉素儲存液I μ 1、100mg/ml的鏈霉素儲存液I μ 1、2.5mg/ml的抗真菌劑儲存液I μ 1，混合均勻制成SSCM培養液； 第二步:制備滋養層細胞，依次如下操作: 1)滋養層細胞的預制:用STO細胞培養液培養STO細胞，細胞匯合度達到70%-80%時，按終濃度15μ g/ml加入絲裂霉素，放入細胞培養箱，在37°C、5% CO2、飽和濕度的條件下培養2小時，然后移走含有絲裂霉素的培養液，并用IOmlPBS洗三次，再用Iml權利要求1所述Trypsin/EDTA消化液使細胞脫壁，并用5ml權利要求1所述培養液C終止Trypsin的消化作用，收集消化后的細胞，2000rpm離心5min，取沉淀的細胞，按濃度為6 X IO5細胞/mL的濃度加入STO細胞凍存液，液氮保存； 2)制備滋養層細胞:將步驟I)所述絲裂霉素處理過的STO細胞，以2XIO5細胞/mL的終濃度將細胞接種在事先由明膠處理過的12孔細胞培養板中，在37°C，5% CO2，飽和濕度的條件下培養12-24小時； 第三步:傳代長期培養綿羊精原干細胞，操作步驟如下: I)精原干細胞的原代培養:移除第二步步驟2)所述12孔細胞培養板中STO滋養層中的含血清培養液,并用PBS緩沖液洗兩次，然后將權利要求2所述分離純化好的精原干細胞用SSCM培養液重懸，以2-5 X IO4細胞/mL的密度接種到鋪好STO滋養層的12孔細胞培養板中，然后將培養板放在37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中，第二天換一次SSCM培養液，以后每隔2天換一次SSCM培養液； 2)精原干細胞的傳代長期培養:將步驟I)所述原代培養的精原干細胞培養6-9天，取出培養板，移除SSCM培養液，除去漂浮的細胞，在培養孔內加入1ml新鮮配置的SSCM培養液，并用ImL移液管輕輕吹吸，使精原干細胞從滋養層細胞上脫離，將精原干細胞懸浮液轉移到50ml離心管，重復操作1-2次，將裝有精原干細胞懸浮液的離心管用2000rpm離心5min，棄上清，用SSCM培養液重懸細胞，接種到新的STO滋養層細胞上，在原代培養后的前三次傳代以1:1或者1: 1.5的比例進行，之后傳代以1:2-1:3的比例進行，每隔2天換一次SSCM培養液，培養好的精原干細胞根據需要進行凍存、利用或繼續傳代培養。
4.對權利要求3所述傳代長期培養的綿羊精原干細胞進行凍存的方法，包括以下步驟:將權利要求3所述傳代長期培養的精原干細胞，用ImL吸液管溫和地輕輕吹打，使精原干細胞從STO滋養層細胞上脫離，收集精原干細胞至50ml離心管，進行細胞計數，然后2000rpm離心5min，棄上清，用無血清細胞凍存液重懸細胞并調整濃度至5 X 104_2 X IO5細胞/ml，分裝到凍存管內，4°C放置30min，_80°C放置24h，之后轉入液氮罐中長期保存。
5.對權利要求4所述凍存的綿羊精原干細胞進行復蘇的方法，包括以下步驟:將權利要求4所述凍存管從液氮罐中取出，在37°C水浴中快速融化3分鐘，在超凈工作臺中將細胞轉入含有IOml SSCM培養液的50ml離心管中，2000rpm離心6分鐘，棄上清液，將沉淀物重懸于l_3mlSSCM培養液中，轉移到12孔培養板，每孔1ml，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中，隔2天換一次SSCM培養液，培養2-3天。
6.根據權利要求3所述綿羊精原干細胞的傳代長期培養方法，其特征在于，其中所述I升SSCB溶液所包含的組分為:
【文檔編號】C12N5/071GK104004708SQ201410265999
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】吳應積, 羅奮華, 張巖, 劉林洪, 薩初拉 申請人:內蒙古大學