一種用牡丹籽餅粕制備牡丹小肽的方法及牡丹小肽的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用牡丹籽餅粕制備牡丹小肽的方法，該方法為以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽餅粕為原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶以及堿性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶進行混合水解制成牡丹功能小肽。所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的重量比為1:0.8-1.2:0.8-1.2：0-1.2:0-1.2。本發明提供的方法快速、簡便，條件溫和，制備得到的牡丹小肽最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高營養、易吸收，克服了植物蛋白難以消化吸收的問題，且抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性顯著。
【專利說明】一種用牡丹籽餅粕制備牡丹小肽的方法及牡丹小肽的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于農副產品加工與再利用【技術領域】，具體涉及一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法及牡丹小肽的應用。
【背景技術】
[0002]牡丹籽油含有多種不飽和脂肪酸，尤其是罕見的奇數脂肪酸，是一種具有重要開發價值的食用油脂來源。2011年3月22日，中華人民共和國衛生部批準自丹鳳牡丹(faeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(Paeoriia rockii)的籽仁經過經壓榨、脫色、脫臭等工藝制成的牡丹籽油作為新資源食品可以生產及食用【中華人民共和國衛生部公告，2011年第9號:衛生部關于批準元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告】。這將為牡丹籽油的生產和使用起到非常大的促進作用。由于牡丹籽油的高營養價值，我國油用牡丹的種植量在逐漸增多，油用牡丹籽的產量也逐年增加。按照目前的產量，油用牡丹籽產量為3萬噸，按照出油率為30%計算，榨油后將會產生大約I萬噸的牡丹籽餅柏，這些牡丹籽餅柏的開發利用將會是一個非常重要且任務艱巨的研究課題。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，該方法快速、簡便，條件溫和，制備得到的牡丹小肽最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高營養、易吸收，克服了植物蛋白難以消化吸收的問題，且抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性顯著。
[0004]本發明實現上述目的采用的技術方案是:一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽餅柏為原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶以及堿性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶進行混合水解制成牡丹功能小肽。
[0005]所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase 蛋白酶的重量比為 1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2。
[0006]所述的用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，具體步驟如下:
1)取油用牡丹籽原材料，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用堿水浸泡除雜，再用清水洗滌3-4次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏，備用；
2)將步驟I)得到的牡丹籽餅柏粉碎過60-100目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量4-8倍的水在溫度為50-70°C下攪拌15-20min，調節pH值為6.4-7.5，得到原料液，備用；
3)將步驟2)得到的原料液升溫至110-120°C，保溫15-30min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至40-50°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為1.0-8.0%，混合蛋白酶由重量比為1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合組成，控制溫度為40-50 V，攪拌速度為100-200 r/min，在無菌空氣條件下水解48-96h，水解結束后升溫至110_120°C進行高溫滅活，過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
[0007]將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的1/4-1/3，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉。
[0008]所述的步驟I)除雜用的堿水的pH值為8.5-9.5。
[0009]所述的步驟2)調節pH值用的是20%氫氧化鈉溶液。
[0010]所述的步驟3)采用板框過濾或膜過濾進行過濾。
[0011]所述的用牡丹籽餅柏制備的牡丹小肽在抗氧化、抗腫瘤及抗菌方面的應用。
[0012]本發明的有益效果
其一、本發明提供的制備方法快速、簡便，條件溫和，操作方便，適合規模化制備牡丹功能小肽，充分利用復合蛋白酶來水解牡丹籽餅柏蛋白，制備得到的牡丹小肽分子量較小，分布均勻，最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高營養、易吸收，克服了植物蛋白難以消化吸收的問題，且抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性顯著。
[0013]其二、本發明充分利用牡丹籽榨油后的廢棄物，將牡丹籽餅柏研究開發及再利用，對于牡丹籽餅柏的研究開發利用將會起到一定的促進作用，對牡丹相關深加工產品的研究開發具有借鑒意義。
【具體實施方式】
[0014]一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽餅柏為原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶以及堿性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶進行混合水解制成牡丹功能小肽。
[0015]所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase 蛋白酶的重量比為 1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2。
[0016]所述的用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，具體步驟如下:
1)取油用牡丹籽原材料，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用堿水浸泡除雜，再用清水洗滌3-4次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏，備用；
2)將步驟1) 得到的牡丹籽餅柏粉碎過60-100目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量4-8倍的水在溫度為50-70°C下攪拌15-20min，調節pH值為6.4-7.5，得到原料液，備用；
3)將步驟2)得到的原料液升溫至110-120°C，保溫15-30min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至40-50°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為1.0-8.0%，混合蛋白酶由重量比為1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合組成，控制溫度為40_50°C，攪拌速度為100-200 r/min，在無菌空氣條件下水解48-96h，水解結束后升溫至110_120°C進行高溫滅活，過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
[0017]將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的1/4-1/3，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉。
[0018]所述的步驟I)除雜用的堿水的pH值為8.5-9.5。
[0019]所述的步驟2)調節pH值用的是20%氫氧化鈉溶液。
[0020]所述的步驟3)采用板框過濾或膜過濾進行過濾。[0021]所述的用牡丹籽餅柏制備的牡丹小肽在抗氧化、抗腫瘤及抗菌方面的應用。
[0022]以下結合具體實施例對本發明做進一步說明:
實施例1:
一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，具體步驟如下:
1)取鳳丹牡丹籽原材料20kg，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用pH值為9.5堿水浸泡除雜，再用清水洗滌4次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏8.7 kg，備用；
2)取步驟I)得到的牡丹籽餅柏Ikg，粉碎過100目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量8倍的水在溫度為70°C下攪拌20min，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值為6.4-7.5，得到原料液，備用；
3)將步驟2)得到的原料液升溫至120°C，保溫30min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至50°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為8.0%，混合蛋白酶由重量比為1:1.2: 1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶混合組成，控制溫度為50°C，攪拌速度為200 r/min，在無菌空氣條件下水解96h，水解結束后升溫至11 0-120°C進行高溫滅活，采用板框過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
[0023]將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的1/3，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉 120g。
[0024]實施例2:
一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，具體步驟如下:
1)取紫斑牡丹籽原材料10kg，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用pH值為8.5堿水浸泡除雜，再用清水洗滌3次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏3.6 kg，備用；
2)取步驟I)得到的牡丹籽餅柏Ikg，粉碎過60目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量4倍的水在溫度為50°C下攪拌15min，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值為7.0,得到原料液，備用；
3)將步驟2)得到的原料液升溫至110°C，保溫15min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至40°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為1.0%，混合蛋白酶由重量比為1:1.2: 1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合組成，控制溫度為40°C，攪拌速度為100 r/min，在無菌空氣條件下水解48h，水解結束后升溫至110°C進行高溫滅活，采用膜過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
[0025]將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的1/4，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉 108g。
[0026]實施例3:
一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，具體步驟如下:
I)取以任意比例混合的鳳丹牡丹和紫斑牡丹籽原材料15 kg，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用PH值為9.0的堿水浸泡除雜，再用清水洗滌4次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏11.6 kg，備用；2)取步驟I)得到的牡丹籽餅柏Ikg，粉碎過80目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量6倍的水在溫度為60°C下攪拌18min，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值為6.4，得到原料液，備用；
3)將步驟2)得到的原料液升溫至115°C，保溫22min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至45°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為4.5%，混合蛋白酶由重量比為1:1:1:1:1的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合組成,控制溫度為45°C,攪拌速度為150 r/min,在無菌空氣條件下水解80h，水解結束后升溫至115°C進行高溫滅活，采用板框過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
[0027]將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的3/10，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉107g。
[0028]活性測試試驗
1.抗腫瘤活性研究 1)試驗材料
胎牛血清，96孔培養板，恒溫箱，RPM1640培養液。
[0029]2)方法
對上述實施例中得到的牡丹小肽進行細胞毒活性測試，采用的方法為MTT法。
[0030]3)試驗步驟
(I)取對數生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培養液，制成單細胞懸液5 X IO4個/mL,將該懸液加到96孔培養板中，每孔加入I X IO4個細胞。培養24 h后,加入受試小肽濃度分別為30 μ g/mL、10 μ g/mL。
[0031](2)將平板在37 °C，含5%C02空氣及100%濕度的恒溫箱中孵育3天，去除培養液。
[0032](3) MTT用無血清的RPM1640培養液配成I mg/mL溶液，每孔加100 μ L，37°C溫育4 h，使MTT還原為甲臢。
[0033](4)吸出上層清液，加入150 μ L DMSO使甲臢溶解，于ELISA儀570 nm處測OD值。
[0034]4)試驗結果
表1牡丹小肽細胞毒活性實驗數據(n=3):-nzr?--
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2.抗氧化活性研究I)試驗材料
牡丹功能小肽粉末(制備方法見實施例1)。
[0035]亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、1，1- 二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸鹽(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、無水乙醇、雙氧水、2，6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、鹽酸(HCl)均為分析純，大豆卵磷脂(>90%)。
[0036]2)方法
(I)清除超氧陰離子自由基(0_2.)的測定方法
用PH8.0、濃度50mol/L的Tris-HCl緩沖液將牡丹小肽稀釋成不同的濃度梯度，各取
1.5mL不同濃度牡丹小肽溶液，然后依次加入0.5mL NBT (300 μ mol/L，以ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液配制),0.5mL NADH (468 μ mol/L,以 ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液配制),0.5mL PMS(60 μ mol/L,以ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液配制)，混勻后在25°C中水浴5分鐘，取出在波長560 nm處測定吸光度，空白對照組以緩沖液代替芪類溶液。
[0037]
【權利要求】
1.一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽餅柏為原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶以及堿性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶進行混合水解制成牡丹功能小肽。
2.如權利要求1所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的重量比為 1:0.8-1.2:0.8-1.2 :0-1.2:0-1.2。
3.如權利要求1所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:具體步驟如下: 1)取油用牡丹籽原材料，脫殼后得到牡丹籽仁，備用；將得到的牡丹籽仁用堿水浸泡除雜，再用清水洗滌3-4次，晾干水分后炒制，然后采用壓榨法壓榨去除油脂，得到牡丹籽餅柏，備用； 2)將步驟I)得到的牡丹籽餅柏粉碎過60-100目篩，然后加入到反應釜中，加入其重量4-8倍的水在溫度為50-70°C下攪拌15-20min，調節pH值為6.4-7.5，得到原料液，備用； 3)將步驟2)得到的原料液升溫至110-120°C，保溫15-30min進行滅菌，滅菌結束后冷卻至40-50°C，加入培養成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的質量百分數為1.0-8.0%，所述混合蛋白酶由重量比為1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合組成，控制溫度為40-50 V，攪拌速度為100-200 r/min，在無菌空氣條件下水解48-96h，水解結束后升溫至110_120°C進行高溫滅活，過濾除渣，得到的濾液即為含有牡丹小肽的營養液。
4.如權利要求3所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:將步驟3)得到的濾液減壓濃縮至體積為原體積的1/4-1/3，經噴霧干燥制得牡丹小肽粉。
5.如權利要求3所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步驟I)除雜用的堿液的PH值為8.5-9.5。
6.如權利要求3所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步驟2)調節pH值用的是20%氫氧化鈉溶液。
7.如權利要求3所述的一種用牡丹籽餅柏制備牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步驟3)采用板框過濾或膜過濾進行過濾。
8.如權利要求1或3所述的用牡丹籽餅柏制備的牡丹小肽在抗氧化方面的應用。
【文檔編號】C12P21/06GK104017850SQ201410294944
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】劉普, 鄧瑞雪, 易軍鵬, 尹衛平, 李小方, 高嘉嶼, 田軼, 段文錄, 曹輝 申請人:河南科技大學