短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）JY2及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）JY2CGMCCNo.9150。通過從自吉爾吉斯共和國奧什賽馬場一處冬小麥田(N72°50’70.01”E40°26’51.73”)土樣中取樣，分離、篩選、生理生化鑒定，確定該菌種本發明提供的短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）JY2CGMCCNo.9150對抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌中獲得良好的應用效果,并在飼用微生態制劑中應用得到顯著的技術效果，在飼料添加劑產業方面具有廣泛的應用前景。
【專利說明】短小芽孢桿菌（心c/7/i/s pi//7//7i/s ) JY2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微生物菌種及其應用領域，具體的說，本發明涉及一種短小芽孢 桿菌及其應用的【技術領域】落。
【背景技術】
[0002] 作物秸桿是農作物生產系統中一項重要的生物資源，也是當今世界上僅次于煤 炭、石油和天然氣的第四大能源。據不完全估計，全世界每年可產生近20?30 X 108t秸桿， 而我國農作物秸桿年產量達5. 560X 108t，居世界之首，并以玉米、小麥和稻谷秸桿為主，占 總秸桿產量的80%。由于含有植物光合作用所積累的一半以上的能量，秸桿富含粗糖、粗蛋 白質等有利于家畜家禽所需的成分，作為非競爭性的飼料資源，只要能夠進行合理的加工 調制，提高其消化能的攝人量，用來飼喂畜禽，特別是用來飼喂牛、羊等反芻家畜，將成為優 質的飼料資源。但目前用作飼料的秸桿不足10%，絕大部分仍直接還田或作燃料用，不但造 成了資源的浪費，也使大量煙塵散發于空氣之中，嚴重污染空氣環境。同時，我國又是一個 飼料，尤其是蛋白質飼料嚴重短缺的大國，每年需進口大量的魚粉以彌補蛋白質飼料的不 足。能否將秸桿纖維轉化為動物可利用且營養價值高的蛋白質飼料，以解決飼料需求的嚴 重不足，就顯得尤為重要。
[0003] 微生物目前已廣泛應用于飼料的生產中，通過微生物發酵，可增加飼料中蛋白質 的含量，降解霉菌毒素，提高營養物質的消化吸收率；有益微生物在動物腸道內定植，又能 維持動物腸道的微生態平衡、提高其免疫力。有益微生物在飼料生產及養殖業中具有廣泛 的應用前景。
[0004] 在飼料生產的原料中，往往含有一定量的木質素、纖維素、半纖維素、淀粉、蛋白 質、脂肪等大分子物質，這些物質進入動物消化道后，必須經過一系列酶的分解作用，才可 被機體吸收利用。雖然動物的消化系統能夠分泌淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂酶、蔗糖酶、乳糖 酶、麥芽糖酶等，但是僅依靠這些內源性酶，動物對飼料的利用能力是有限的。特別是對于 幼齡畜禽，內源消化酶分泌不足，直接阻滯其正常的生長發育。而微生物酶作為外源酶可對 動物消化道酶的不足或缺失給予合理補充，由此促進動物對養分的消化、吸收，提高飼料的 利用率。絕大多數飼料用酶可由某些細菌、曲霉菌和其它酵母菌分泌產生，因而許多學者建 議在畜牧業中將外源性酶添加到飼料中，以擴大可利用飼料資源范圍，改善養殖生態環境。
[0005] 有研究表明，仔豬胃腸道的消化酶活性隨著年齡增長而增長，但斷奶對消化酶的 活性增長趨勢有倒退的影響，在第4周至斷奶后1周內各種消化酶活性降低到斷奶前水平 的1/3。這時的腸道消化生理功能不適應高淀粉、高蛋白的飼料日糧，引起胃腸機能紊亂，易 誘發腹瀉發生，同時脂肪酶活性低也是誘發腹瀉原因之一，如果在仔豬飼料日糧中加入外 源性淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶來補充內源性酶分泌不足，可以改善消化，減輕腹瀉。其中蛋白 酶的作用是將組成蛋白的大分子多肽水解成寡肽或氨基酸，淀粉酶的作用是將大分子淀粉 水解成寡糖、極限糊漿和葡萄糖。酯酶、脂肪酶可將天然油脂分解，最終產物為單酸苷油脂、 脂肪酸。
[0006] 非淀粉多糖在目前常用的原料中是比重非常大的組分，并且其木聚糖、阿拉伯聚 糖、葡聚糖、乳糖和甘露聚糖半纖維組分是非淀粉多糖具有很多抗營養作用的主要原因。纖 維素酶能破除植物細胞壁，使細胞內容物充分釋放出來，從而被單胃動物腸道吸收。木聚糖 酶能水解水溶性木聚糖，可有效降低動物腸道中食糜粘度，有利于內源消化液充分和食糜 混合，充分消化，利于營養物的吸收提高飼料的利用率及能量，降低料重比。甘露聚糖酶能 有效地分解飼料中的甘露聚糖生成甘露寡糖等物質，雖然甘露寡糖不能直接被動物機體吸 收，但可參與機體的神經內分泌，影響代謝。因此非淀粉多糖酶的添加不僅能提高飼料的能 量利用率，還可有效阻斷細菌和寄生蟲對腸道的侵襲，提高動物健康水平，從而增加養殖業 的經濟效益。
[0007] 由于飼料成分復雜，飼用微生物酶制劑的研制首先要注意選用的微生物應不產生 毒素、激素或其它有害物質，還要注意添加復合酶效果比單一酶好，即盡量采用集多種酶于 一身的微生物進行生產。目前，我國秸桿利用率還很低，開發研究潛力很大，隨著微生物在 飼料工業中得到越來越廣泛的重視和應用，微生物發酵秸桿技術將對進一步提高畜牧業的 生產水平，推動綠色食品生產技術的發展具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 針對目前國內外現有技術中短小芽孢桿菌作為飼用微生態制劑和酶制劑的應用 現狀，本發明旨在提供一種新的短小芽孢桿菌及其作為飼用微生態制劑和酶制劑的應用， 所述的短小芽孢桿菌對致病性大腸桿菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用，將其接種到玉米 秸桿飼料中進行發酵，可顯著增加飼料中蛋白和粗脂肪含量，降低其中粗纖維含量，通過代 謝表達，表明所提供的短小芽孢桿菌在蛋白酶、纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生產領 域具有廣泛的應用前景，這些特性明顯區別于已公開報道的其他短小芽孢桿菌有效種，具 有廣泛的應用價值。
[0009] 本發明采用的主要技術方案： 本發明從吉爾吉斯共和國奧什賽馬場一處冬小麥田中取樣（N 72° 50' 70.0Γ'Ε 40° 26' 51. 73"），分離篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優選出一株編號為JY2的 菌株，參照《伯杰氏細菌分類鑒定手冊》（7th edition)和東秀株編著的《常見細菌分類鑒 定手冊》中的方法進行溫度和pH值、發酵類型、代謝底物、營養依賴型等方面對JY2菌株進 行形態學，生理生化鑒定，進一步依據分子生物學分類規則，將這種新型的JY2菌株命名為 短小芽孢桿菌)。該菌株于申請日前已保藏于布達佩斯條約微生物國際 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期是2014年 05月13日，保藏號是CGMCC No. 9150;該菌株革蘭氏陽性，桿狀、不運動、兼性好氧且產棒 狀孢子，擁有比較寬的酸堿耐受范圍（PH4.0 - 11.0)，生長溫度范圍為10-50°C，最適溫度 是37°C，生長不需NaCl，對鹽耐受最高可達10%，凝膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗，接觸酶 和氧化酶試驗均呈現陽性，可利用L-阿拉伯糖、D -甘露醇、D -木糖，水解淀粉試驗、VP試 驗、吲哚產生試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、甲基紅試驗均呈陰性，不發生硝酸和亞硝酸還原， 不降解D-葡萄糖。
[0010] 本發明通過總DNA的提取、16S rRNA基因的PCR擴增和測序，根據測序結果，用 Blast搜索軟件從本領域常見等數據庫中調出相似性較高的相關芽孢桿菌 菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL X進行多序列比對，并采用和Afei的鄰接 法(AfeigAAor 用MEGA 5. 0軟件進行系統進化樹的構建和同源性比較。經測定， 短小芽孢桿菌UaciBiAs 應JY2 CGMCC No.9150 的 16s rRNA 基因序列為 1485bp， 其序列與本領域常見的短小芽孢桿菌(^3CiT7w5· 存在差異。
[0011] 通過對上述菌種短小芽孢桿菌(ifeciJ7w5· /7--27?5·) JY2生理生化分析及16SrRNA 同源分析、系統發育分析結果，將純化的菌株JY2進行系統進化樹的構建及多樣性分析，與 短小芽孢桿菌同源性最高，將菌種編號為JY2的菌株鑒定為短小芽孢 If lif {Bad 11 us pumilus ) 〇
[0012] 本發明進而提供短小芽孢桿菌/7--27?5·)】Υ2 CGMCC No. 9150的分離和 培養方法。
[0013] 1.分離培養基采用LB培養基：蛋白胨10g，酵母膏/粉5g，NaCl 10g，瓊脂 17g，蒸饋水lOOOmL pH自然。
[0014] 2.分離和篩選條件： (1)樣品采集：土壤樣品采自吉爾吉斯共和國奧什賽馬場一處冬小麥田（N 72° 50' 70. 0Γ? 40° 26' 51. 73"），隨機選取多處深度為3 cm-20cm的土壤樣品，混勻后 裝入無菌容器內，車載冰箱運至實驗室，4° C保存備用。
[0015] (2)菌種篩選，純化及生理生化特性 依據梯度稀釋法，稱取l〇g 土壤樣品于90mL無菌生理鹽水中，37° C活化30min后進 行梯度稀釋，選取10' 10' ΚΓ4稀釋液分別涂布于LB培養基，每個處理3個重復，置37° C 培養；待長出菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應的平板，直至 無雜菌落。
[0016] 經培養篩選確定的短小芽孢桿菌UaciBm /7謂27狀）幾2 CGMCC No. 9150存在 不透明型和半透明型兩種不同的菌落形態，不透明菌落呈淺黃色，扁平，邊緣整齊無褶皺， 在傳代過程中可產生少許的半透明菌落，且在后續轉接過程中半透明型菌落可消失。該 菌株革蘭氏陽性，桿狀、不運動、兼性好氧且產棒狀孢子，擁有比較寬的酸堿pH耐受范圍 (pH4. 0 - 11. 0)，生長溫度范圍為10-50°C，最適溫度是37°C，生長不需NaCl，對鹽耐受最高 可達10%，凝膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、卵磷脂酶試驗、接觸酶和氧化酶試驗均呈現陽 性，可利用L-阿拉伯糖、D -甘露醇、D -木糖，水解淀粉試驗、VP試驗、吲哚產生試驗、苯丙 氨酸脫氨酶試驗、甲基紅試驗均呈陰性，不發生硝酸和亞硝酸還原，不降解D-葡萄糖。
[0017] 通過體外抑菌性能檢測，所述的短小芽孢桿菌(ifeciBws JY2 CGMCC No. 9150對致病性大腸桿菌和沙門氏菌都有明顯的抑制作用。表明本發明提供的的短小芽 孢桿菌(^3^7^/>5/7?^7^5)幾2 061〇：此.9150在對抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌中獲 得良好的應用效果。
[0018] 將短小芽抱桿菌(ifeciBws 腫27w5〇JY2 CGMCC No. 9150接種到玉米結桿飼料中 進行發酵，結果表明飼料中蛋白和粗脂肪含量顯著增加，粗纖維含量顯著降低。表明本發明 的提供的短小芽孢桿菌(及^27^/ >5/7腫27^5)幾2 061〇：此.9150在飼用微生態制劑中應用 得到顯著的技術效果。
[0019] 同時，本發明提供的短小芽孢桿菌應27?5·) JY2 CGMCC No. 9150在蛋 白酶、纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶方面具有良好的代謝表達，可廣泛用于蛋白酶、 纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生產領域，該菌種生長迅速、發酵周期短的特點，在飼 料添加劑產業方面具有廣泛的應用前景。
[0020] 通過實施本發明具體的技術指標，實現本
【發明內容】
，可以達到以下有益效果： 本發明提供的短小芽孢桿菌CGMCC No. 9150對致病性大腸桿 菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用；將其接種到玉米秸桿飼料中進行發酵，可顯著增加飼 料中蛋白和粗脂肪含量，降低其中粗纖維含量；具有蛋白酶、纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露 聚糖酶陽性，木聚糖酶、α-淀粉酶陰性，可廣泛用于蛋白酶、纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露 聚糖酶生產領域，可見，短小芽孢桿菌腫CGMCC No. 9150在飼料添加 劑領域具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1所示為短小芽孢桿菌UaciBm JY2 CGMCC No. 9150在LB培養基 上的菌落形態圖。
[0022] 圖2所示為短小芽孢桿菌/7_27狀)幾2 CGMCC No. 9150系統發育樹狀 圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例進一步闡明本發明，當然，這些實施例僅用于說明本發明，而 不用于限制本發明要求保護的范圍。
[0024] 本發明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備： 培養基選用：蛋白胨l〇g，酵母膏/粉5g，NaCl 10g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL pH 自然。
[0025] 主要儀器與試劑：MSSPX-250型生化培養箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-1F B型單人雙面凈化工作臺，E360K離心機，恒溫搖床HWY-KKLPCR儀Eppendorf No:5345,電 泳儀 Bio-Rad Mode 200/2.0,凝膠成像儀 United-Bio, GK-330C plus，PCR 預混液（TaKaRa Biotechnology)，其余試劑均為分析純。
[0026] 本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實 施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0027] 實施例一：短小芽孢桿菌(ifeciBws JY2 CGMCC No. 9150的分離、篩選 1.分離：本發明所述的短小芽孢桿菌JY2分離于吉爾吉斯斯坦共和國奧什賽馬場一處 冬小麥田（Ν72° 50'70·01"Ε40° 26'51.73"），隨機選取農田中多處深度為3〇11-20〇11 的土壤樣品，混勻后裝入無菌容器內，車載冰箱運至實驗室，采用平板稀釋涂布法，分離獲 得一株短小芽孢桿菌，編號為JY2。
[0028] 分離步驟：依據梯度稀釋法，稱取10g 土壤樣品于90mL無菌生理鹽水中，30° C活 化30min后進行梯度稀釋，選取1(Γ2、10' ΚΓ4稀釋液涂布于LB瓊脂培養基平板，每個處理 3個重復，置37° C培養。待長出菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種 于新的分離培養基直至無雜菌落。將純化后的菌株一部分采用凍干物安瓿管、甘油管和液 氮等方式保藏，一部分保存于4° C直接用于后續研究。
[0029] 2.培養條件：培養基：LB瓊脂培養基采用為，蛋白胨lOg，酵母膏/粉5g，NaCl l〇g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL pH自然，12Γ C滅菌20分鐘。
[0030] 3.繁殖；用接種針取少量菌絲于LB瓊脂培養基，37°C培養18h后形成中等大小 菌落，JY2菌種存在不透明型和半透明型兩種不同的菌落形態，不透明菌落呈淺黃色，扁平， 邊緣整齊無褶皺，在傳代過程中可產生少許的半透明菌落，且在后續轉接過程中半透明型 菌落可消失。
[0031] 4.菌種生理生化表型：本發明所述的該菌株革蘭氏陽性，桿狀、不運動、兼性好氧 且產棒狀孢子，擁有比較寬的酸堿耐受范圍（PH4.0 - 11.0)，生長溫度范圍為10-50°C，最 適溫度是37°C，生長不需NaCl，對鹽耐受最高可達10%，凝膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、 卵磷脂酶試驗、接觸酶和氧化酶試驗均呈現陽性，可利用L-阿拉伯糖、D -甘露醇、D -木 糖，水解淀粉試驗、VP試驗、吲哚產生試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、甲基紅試驗均呈陰性，不 發生硝酸和亞硝酸還原，不降解D-葡萄糖。短小芽孢桿菌/7?^7狀）幾 2 CGMCC No. 9150與菌株短小芽孢桿菌/7ωΜ7?Λ5)ΚΤ 1012的生理生化特性比較結果見 表1. 表1 :短小芽孢桿菌JY2的生理生化表型
【權利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述的短小芽孢桿菌 /?/射7狀）JY2 保藏編號為 CGMCC No. 9150。
2. 如權利要求1所述的短小芽孢桿菌UaciBm JY2 CGMCC No. 9150 在飼用微生態制劑中應用。
3. 如權利要求1所述的短小芽孢桿菌UaciBm JY2 CGMCC No. 9150 在對抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌中的應用。
4. 如權利要求1所述的短小芽孢桿菌UaciBm /7腫27狀）幾2 CGMCC No. 9150在蛋 白酶、纖維素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、α-淀粉酶方面中的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK104087529SQ201410305020
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月29日 優先權日:2014年6月29日
【發明者】王寧, 包慧芳, 侯敏, 崔衛東, 王煒 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所