一種杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法
【專利摘要】本發明公開了一種杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，包括：利用由序列表中序列1設計合成序列表中序列2和序列3所示的引物，以序列2和序列3對鑒別樣品的基因組DNA進行一次PCR反應；PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行：PCR反應產物經凝膠電泳后凝膠成像系統紫外觀察，在400bp處出現條帶的即為杜仲藥材或原植物，未出現條帶則為非杜仲藥材或原植物；或者在PCR反應產物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸熒光染料，混勻后在365nm紫外光下觀察，產生綠色熒光則為杜仲藥材或原植物，否則為非杜仲藥材或原植物。本發明可快速、準確的鑒別出杜仲藥材或原植物，操作簡捷、實用性好。
【專利說明】一種杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種中藥材或原植物的真偽鑒別方法，尤其是一種杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法。
【背景技術】
[0002]杜仲Eucommia ulmoides Oliv.為中國特有樹種，早在一千年前已為民間栽培入藥使用，具有補肝腎、強筋骨的作用，現代臨床用于治療高血壓病，療效良好。另外，杜仲的樹干、枝、葉、果中含有大量橡膠，也是一種優良的經濟樹木。
[0003]杜仲的種質資源遺傳多樣性比較豐富，不同產地或生境的杜仲原植物，其葉、芽、花、果等方面會表現出不同的特點，樹皮也存在多個變異類型，如深縱裂型、淺縱裂型、龜裂型和光皮型，這就導致以樹皮入藥的杜仲藥材易于產生摻假現象，如以斷面有白色橡膠絲的紅杜仲藤 Urceola quintaretii (Pierre)D.J.Middleton、紫花絡石 TrachelospermumaxilIare Hook.f.、白杜Euonymus maackii Rupr.等植物的莖皮混充杜仲藥材銷售，而這些植物樹皮在藥理、藥效及臨床應用上與杜仲藥材有很大的差別，有的甚至會產生毒副作用。
[0004]目前，杜仲研究大都以樹皮、葉片等形態差異和解剖學特征為基礎進行鑒別，有時也結合理化分析來鑒別，但是這種鑒別方法不僅費時費力，而且鑒別的準確性也較差。另外，雖然也有關于使用DNA分子測序技術分析rDNA-1TS2、matK片段的核酸序列來鑒定杜仲原植物真偽的報道，但是該方法操作復雜、成本高、耗時費力，且適用性差，不能大范圍推廣應用，也不能滿足大規模樣品鑒定的需求。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供可快速、準確的鑒別杜仲藥材或原植物的一段特異性DNA片段及一組引物；
[0006]本發明的另外一個目的是提供一種杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案:杜仲藥材或原植物快速分子鑒別的特異性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
[0008]杜仲藥材或原植物快速分子鑒別的一組引物，該組引物由序列表中序列I所示序列設計合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
[0009]前述的引物在杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別中的應用。
[0010]包括前述引物的試劑盒。
[0011]杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，包括以下步驟:利用序列為序列2和序列3所示的引物對鑒別樣品進行PCR反應；再采用以下兩種方法之一進行鑒別:將PCR反應產物加入含溴化乙錠(即EB)的瓊脂糖凝膠中，電泳后在紫外凝膠成像系統下觀察，在400bp處出現條帶的樣品即為杜仲藥材或原植物；或者在PCR反應產物中加入SYBR GreenI核酸熒光染料，混勻后在紫外光下觀察，PCR反應產物產生綠色熒光的樣品即為杜仲藥材或原植物。
[0012]本發明中所述的對鑒別樣品進行PCR反應包括:提取鑒別樣品的基因組DNA，用該基因組DNA作為模板，利用序列為序列2和序列3所示的引物進行PCR反應。
[0013]具體的說，所述的提取鑒別樣品的基因組DNA具體包括以下步驟:取鑒別樣品2~5mg，用植物DNA提取試劑盒、CTAB提取法或堿裂解法提取基因組DNA。
[0014]前述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法中，所述的PCR反應體系為25 μ L，反應液組成為=Taq酶預混液5~11 μ L，上游和下游引物(所述的上游引物即引物序列表中序列2所示的引物，下游引物即引物序列表中序列3所示的引物)各為5~40pmol，DNA模板50~200ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:94~96°C預變性30~300s, 94~96°C變性2~30s，45~65°C退火2~30s，71~73°C延伸2~45s，變性、退火、延伸一共進行27~39次循環；最后71~73°C后延伸18~300s ;PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取4~7 μ L PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.0%~1.5%瓊脂糖凝膠中，65~100V穩壓電泳35~50min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中加入I~3μ LlOO X SYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在300~400nm紫外光下觀察。
[0015]優選的，所述的PCR反應體系為25 μ L，反應液組成為:Taq酶預混液6.5~9 μ L，上游和下游引物各為10~20pmol, DNA模板50~150ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:94~95°C預變性30~120s，94~95°C變性2~10s，60~65°C退火2~15s，72~73°C延伸2~15s，變性、退火、延伸一共進行29~33次循環；最后72~73°C后延伸20~60s ;PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取5~6μ L PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.1%~1.3% 瓊脂糖凝膠中，70~85V穩壓電泳35~45min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中加入2~3μ LlOO X SYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在340~380nm紫外光下觀察。
[0016]更優選的，所述的PCR反應體系為25 μ L，反應液組成為:Taq酶預混液7.5 μ L，上游和下游引物各為1pmol, DNA模板80~120ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:950C預變性45s，95°C變性5s，62°C退火5s，72°C延伸5s，變性、退火、延伸一共進行30次循環；最后72°C后延伸30s ；PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取5 μ L PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中，80V穩壓電泳40min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中加入2 μ LlOOXSYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在365nm紫外光下觀察。
[0017]發明人進行了一系列實驗，以選擇本發明提供的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法的鑒別條件等，證明本發明鑒別方法的有效性。具體如下:
[0018]一、序列的獲取與比對
[0019]在NCBI (美國國立生物技術信息中心，Nat1nal Center for B1technologyInformat1n)下載至Ij杜仲 Eucommia ulmoides Oliver、大果衛矛 Euonymus myrianthusHemsl.、冬青衛矛 E.japonicus Thunb.、粗糖樹 Ehretia macrophylla Wall.、毛杜仲藤 Parabarium huaitingii Chun&Tsiang、桅子皮 Itoa orientalis Hemsl.、紫花絡石Trachelospermum axilIare Hook.f.等植物的物種rDNA-1TS片段,共計34條序列，登錄號分別為 AY650004.1、AY650000.1、AY649994.1、AY649995.1、AY649998.1、AY649996.1、AY650005.UAY649992.UAY649993.UAY650006.UAY649997.UAY650001.UJF976307.1、JF976306.UJF755926.UKC999842.UKC904097.UJF755927.UKC999832.UHQ393721.1、KC999837.UKC999834.UKC999835.UKC999830.UKC999837.UKC999836.UKC999836.1、KC999839.UKC999839.UKC999840.UKC999831.UKC999838.UKC999841.UKC999833.1。發明人運用ClustalX2.1軟件對這些序列進行排序、比對、分析后發現:rDNA_ITS序列能較好地反映出杜仲及其混偽品之間的種間差異，基于該差異，發明人進一步比對分析獲得了具有穩定差異的杜仲特異性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
[0020]二、引物的設計與篩選
[0021]發明人使用Premier Primer5.0軟件對上述杜仲特異性DNA片段進行引物設計，調整參數使上游引物在杜仲的特異性片段內，長度為100~500bp，共設計了 3組引物，分別命名為 duzhong-lF/duzhong-lR、duzhong-2F/duzhong_2R、duzhong-3F/duzhong_3R,各引物序列見表1。由上海生工生物科技有限公司及北京博邁德生物有限公司合成。
[0022]根據引物序列duzhong-lF/duzhong-lR、duzhong-2F/duzhong_2R、duzhong_3F/duzhong-3R的Tm值(DNA熔解溫度)及擴增產物的長度，預先設置了特異性PCR擴增體系與擴增程序驗證此3組引物的特異性。其體系及擴增程序見表1。取5yL PCR擴增產物加入含EB的1.2%瓊脂糖凝膠中，80~85V穩定電壓電泳50min，紫外凝膠成像系統觀察，拍照保存。
[0023]表1弓丨物及PCR反應條件
[0024]
【權利要求】
1.杜仲藥材或原植物快速分子鑒別的特異性DNA片段，其序列如序列表中序列I所示。
2.杜仲藥材或原植物快速分子鑒別的一組引物，該組引物由序列表中序列I所示序列設計合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。
3.權利要求2所述的引物在杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別中的應用。
4.包括權利要求2所述引物的試劑盒。
5.杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟:利用序列為序列2和序列3所示的引物對鑒別樣品進行PCR反應；再采用以下兩種方法之一進行鑒別:將PCR反應產物加入含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，電泳后在紫外凝膠成像系統下觀察，在400bp處出現條帶的樣品即為杜仲藥材或原植物；或者在PCR反應產物中加入SYBR GreenI核酸熒光染料，混勻后在紫外光下觀察，PCR反應產物產生綠色熒光的樣品即為杜仲藥材或原植物。
6.根據權利要求5所述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，所述的對鑒別樣品進行PCR反應包括:提取鑒別樣品的基因組DNA，用該基因組DNA作為模板，利用序列為序列2和序列3所示的引物進行PCR反應。
7.根據權利要求6所述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，所述的提取鑒別樣品的基因組DNA具體包括以下步驟:取鑒別樣品2~5mg，用植物DNA提取試劑盒、CTAB提取法或堿裂解法提取基因組DNA。
8.根據權利要求5~7任一所述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，所述的PCR反應體系為 25 μ L,反應液組成為:Taq酶預混液5~11 μ L,上游和下游引物各為5~40pmol,DNA模板50~200ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:94~96°C預變性30~300s，94~96°C變性2~30s，45~65°C退火2~30s，71~73°C延伸2~45s，變性、退火、延伸一共進行27~39次循環；最后71~73°C后延伸18~300s ;PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取4~7 μ L PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.0%~1.5%瓊脂糖凝膠中，65~100V穩壓電泳35~50min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中加入I~3μ LlOOXSYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在300~400nm紫外光下觀察。
9.根據權利要求8所述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，所述的PCR反應體系為25 μ L,反應液組成為:Taq酶預混液6.5~9 μ L,上游和下游引物各為10~20pmol,DNA模板50~150ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:94~95°C預變性30~120s，94~95°C變性2~10s，60~65°C退火2~15s，72~73°C延伸2~15s，變性、退火、延伸一共進行29~33次循環；最后72~73°C后延伸20~60s ；PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取5~6μ L PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.1%~1.3%瓊脂糖凝膠中，70~85V穩壓電泳35~45min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中加入2~3μ LlOO X SYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在340~380nm紫外光下觀察。
10.根據權利要求9所述的杜仲藥材或原植物的快速分子鑒別方法，其特征在于，所述的PCR反應體系為25 μ L,反應液組成為:Taq酶預混液7.5 μ L,上游和下游引物各為1pmol, DNA模板80~120ng,滅菌重蒸水加至25 μ L ;反應程序為:95°C預變性45s, 95°C變性5s，62°C退火5s，72°C延伸5s，變性、退火、延伸一共進行30次循環；最后72°C后延伸30s ;PCR反應產物的檢測，采用以下兩種方法之一進行:取5yL PCR反應產物加入含溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中，80V穩壓電泳40min后，在紫外凝膠成像系統下觀察；或者在PCR反應產物中 加入2 μ LlOO X SYBR Green I核酸熒光染料，混勻后在365nm紫外光下觀察。
【文檔編號】C12N15/11GK104073560SQ201410304972
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】周濤, 趙丹, 江維克 申請人:貴陽中醫學院