結合半乳糖的凝集素及其診斷類風濕性關節炎的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了結合半乳糖的凝集素，其編碼基因、載體、細胞和制備方法等。該凝集素可以結合半乳糖并可以凝集胸腺細胞。另外，本發明還提供了利用該凝集素在制備診斷類風濕性關節炎的試劑盒中的應用等。
【專利說明】結合半乳糖的凝集素及其診斷類風濕性關節炎的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學【技術領域】，具體而言，本發明提供了結合半乳糖的凝集素及其在制備早期診斷類風濕性關節炎的試劑盒中的應用等。
【背景技術】
[0002]類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是以關節進展性破壞為主、并累及其他多種臟器的常見病，其發病率可高達5%。RA的病情特點為反復發作，呈進展性加重，如從關節晨僵、紅腫到關節破壞，及使病人喪失活動能力等。類風濕關節炎被稱為“不死的癌癥”，它給病人帶來了極大的身心痛苦和經濟負擔。類風濕關節炎如能在早期予以正確診斷并合理治療，病情將可得到緩解或趨于穩定。
[0003]目前類風濕關節炎現常用的診斷方法有實驗室檢測和X-光片方法等。其中實驗室檢測方法主要包括IgG、類風濕因子(RF)、血沉、C-反應蛋白測定等。但是這些方法各有不足之處=IgG測定是病人血中總IgG水平的測定，不同人IgG水平變化范圍較大，且免疫功能低下的病人并不伴有IgG升高；血沉和C-反應蛋白是反映病情活動期的一個指標,在多種疾病可有不同程度的升高，如結核、血液病和炎癥等；類風濕因子出現較晚，并且僅有30-40%的病人為陽性，并同時受總IgG水平的影響；X-光片診斷是依據骨關節密度等診斷類風濕關節炎的指標，當類風濕關節炎病人出現骨改變時有意義，它也只能是一個較晚期出現的指標。
[0004]然而，本發明人在長期研究RA診斷的過程中，令人意外地發現了一種具有結合半乳糖能力的凝集素，其不但具有更強的促胸腺細胞凝集的作用，能夠與游離的半乳糖更完全地結合，而且能夠與糖蛋白(如人IgG)的糖鏈中暴露出來的半乳糖等非游離的半乳糖結合，特別適合在ELISA (酶聯免疫吸附測定)診斷類風濕性關節炎的方法中應用。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題在于提供新的凝集素，其具有結合半乳糖的能力，其中半乳糖無論是游離的，還是處于諸如糖蛋白的糖鏈中的，和/或，其具有凝集胸腺細胞的能力。另外，本發明還提供了該凝集素的編碼核酸、載體、細胞和制備方法以及其應用，包括制備凝集胸腺細胞或者結合半乳糖的試劑的應用和制備用于診斷類風濕性關節炎的方法的試劑盒的應用等。
[0006]具體而言，在第一個方面，本發明提供了凝集素，其具有的氨基酸序列:
(1)如SEQ ID NO:1 所示；或，
(2)是在如SEQID NO:1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一個或幾個氨基酸而獲得的氨基酸序列，而且其具有結合半乳糖的能力或者仍舊具有凝集胸腺細胞的能力。
[0007]本發明的第一個方面的凝集素的氨基酸序列可以是在如SEQ ID NO:1所示的序列的基礎上添加、缺失和/或取代一個或幾個(優選一個至五個，更優選一個至三個)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且仍舊具有結合半乳糖的能力，如結合游離的半乳糖和/或結合糖蛋白的糖鏈中的半乳糖，或者仍舊具有凝集胸腺細胞的能力。本領域技術人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導入表達載體，可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實驗指南》(北京:科學出版社，2002年)等本領域公知的文獻中。在取代的氨基酸殘基中，優選取代為與原氨基酸殘基側鏈性質相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側鏈性質相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、1、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、1、P)、含羥基側鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團側鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。在本發明的第一個方面中，優選所述凝集素的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0008]在第二個方面，本發明提供了編碼本發明第一個方面所述的凝集素的核酸。本發明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規技術，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領域技術人員可以很容易獲得本發明的核酸或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分尚得到大量的核酸分子。優選本發明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。該優選序列優化了在大腸桿菌的表達，使得在大腸桿菌BL21 (DE3)中的表達比例可以占到總蛋白的20%。
[0009]在第三個方面，本發明提供了包含本發明第二個方面所述的核酸的載體。常用的載體包括細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。本文中的載體優選是重組表達載體(簡稱為表達載體)，包括但不限于:在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。優選的表達載體通常包含選擇標記基因，如細菌的氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因,酵母菌的缺陷選擇標記(如His, Leu, Trp缺陷選擇標記)等；真核細胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標記基因等。
[0010]在第四個方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本發明第三個方面所述的載體，或者其用本發明第二個方面所述的核酸轉化或轉染。宿主細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉化或轉染含本發明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構成工程化細胞或細胞株，可用于生產所需融合蛋白。本領域技術人員能夠恰當地選擇適當的載體、宿主細胞，并熟知如何將載體高效地轉化或轉染入宿主細胞中，所用方法包括但不限于:氯化鈣法、電穿孔法用于細菌細胞，電穿孔法和原生質體融合法用于酵母細胞，脂質體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動物細胞等真核細胞。優選本發明的宿主細胞是原核細胞，更優選是大腸桿菌，最優選是大腸桿菌BL21(DE3)。該最優選的宿主細胞與序列I所示的核苷酸序列配合，能高效表達本發明的凝集素。
[0011]在第五個方面，本發明提供了制備本發明第一個方面所述的凝集素的方法:
(1)在適合蛋白質表達的條件下，培養本發明第四個方面所述的宿主細胞；和，
(2)從步驟(1)獲得的培養產物中分離出本發明第一個方面所述的凝集素。優選本發明的制備方法，包括將獲得的宿主細胞的包涵體裂解，依次經Q-S印harose層析柱和Sephedex G_25層析柱純化,然后用腸激酶酶切，再依次經NTA層析柱和Q-Sepharose層析柱純化。這樣獲得的凝集素純度高、重復性好。
[0012]在第六個方面，本發明提供了凝集胸腺細胞的方法，其包括將本發明第一個方面所述的凝集素與胸腺細胞混合的過程。本發明優選的凝集素對小鼠胸腺細胞的凝集作用顯著強于目前市售的凝集素，因此特別適合用于凝集胸腺細胞，尤其是特別適合用于體外凝集胸腺細胞。所以，優選本發明第六個方面所述的方法是體外方法，即體外凝集胸腺細胞的方法。相應地，本發明提供了本發明第一個方面所述的凝集素在制備凝集胸腺細胞的試劑中的應用。
[0013]在第七個方面，本發明提供了結合半乳糖的方法，其包括將本發明第一個方面所述的凝集素與含半乳糖的物質混合的過程。本發明優選的凝集素對游離的和在糖蛋白糖鏈中的半乳糖都有結合作用，而且比目前市售的凝集素結合地更為完全，因此特別適合用于結合半乳糖，尤其是特別適合用于體外結合半乳糖。所以，優選本發明第七個方面所述的方法是體外方法，即體外結合半乳糖的方法。相應地，本發明提供了本發明第一個方面所述的凝集素在制備結合半乳糖的試劑中的應用。
[0014]在第八個方面，本發明提供了本發明第一個方面所述的凝集素在制備用于診斷類風濕性關節炎的方法的試劑盒中的應用。本發明的凝集素可以用于ELISA檢測免疫球蛋白中的包被試劑，從而可以構成試劑盒，即優選本發明第八個方面的應用中的診斷類風濕性關節炎的方法包括ELISA檢測樣品結合在用本發明第一個方面所述的凝集素包被的酶標板上的免疫球蛋白的量(可以直接經過計算的量，也可以是未經計算的間接量，如吸光值(記為值A)，更優選是450nm處的吸光值)。該ELISA方法已經能在較高準確度上診斷是否患有類風濕性關節炎，因此可以單獨使用，但是由于對健康人群的診斷準確率為約60%，有著40%左右的誤診率，因此優選試劑盒還包括蘑菇凝集素作為包被試劑，即優選本發明第八個方面的應用中的診斷類風濕性關節炎的方法進一步包括ELISA檢測樣品結合在用蘑菇凝集素包被的酶標板上的免疫球蛋白的吸光值(優選是405nm處的吸光值)，得到值B，計算A/B的比值。通過A/B的比值，可以使得診斷準確率達到95%以上。優選在本發明第八個方面的應用中，得到值A的ELISA方法和得到值B的ELISA方法并行實施。
[0015]本發明取得的有益效果有:獲得了新的凝集素，給市場提供更多選擇；凝集素可以結合游離的和糖蛋白糖鏈的半乳糖，也可以凝集胸腺細胞，用途范圍廣，包括可以用于診斷類風濕性關節炎，不但可以用于更為方便的單一的ELISA中用于診斷類風濕性關節炎，而且可以用于更為準確的組合的ELISA中用于診斷類風濕性關節炎；制備方法表達量高，純度高，均一性好。
[0016]為了便于理解，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，其全文內容均納入本文進行參考。以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。
【具體實施方式】
[0017]以下通過實施例進一步說明本發明的內容。如未詳盡之處，可以按照《分子克隆實驗指南》(2002年，第三版，科學出版社)、《細胞實驗指南》(2001年，科學出版社)等實驗手冊所述的方法進行，或者根據藥物監管部門(如，SFDA)的相關規定以及實驗中所用到的試劑、儀器的廠商所提供的說明書或手冊來進行。
[0018]實施例1凝集素的構建和克隆
根據我們新發現的凝集素，設計了在大腸桿菌中優化表達的凝集素基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，并通過商業渠道委托合成。在得到該購買的合成的基因序列后，我們通過上游引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和下游引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)進行PCR擴增，從而在以上合成的序列兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點以及腸激酶酶切位點。其中，PCR擴增條件為:H20 34μL，10ΧΡ0^^4^5μL，25πιΜMgSO4 2yL,2mM dNTP 5 μ L，上游引物(50uM) I μ L，下游引物(50uM) I μ L，合成的聚谷氨酸基因(稀釋成10ng/uL濃度)I μ L，KOD PLUS DNA聚合酶(Toyoba) I μ L，總體積50 μ L ；94°C變性3分鐘，然后94°C 30秒、50°C 30秒、69°C 30秒，共30個循環，最后69°C 5分鐘。
[0019]PCR擴增后，在瓊脂糖凝膠上電泳PCR擴增產物，割膠回收約700bp大小的核酸片段。用EcoRI和XhoI分別雙酶切該回收的PCR產物和pET28a+質粒(Invitrogen)，將酶切后的PCR產物和pET28a質粒用T4連接酶連接，構建成表達載體pET28-lectin，然后轉化大腸桿菌DH5a細胞。取轉化的大腸桿菌DH5 a細胞抽提質粒，經測序檢測質粒上克隆有如序列2所示的正確序列后，將該質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，由此得到凝集素表達菌。
實施例2凝集素的表達和純化
取實施例1獲得的表達菌，接種到10mL LB液體培養基中，在37°C振蕩培養6小時，然后加入1uL的lmol/L IPTG，于37°C繼續誘導培養4小時。誘導前后培養的少量菌液經SDS-PAGE電泳檢測比對，確認誘導后產生約25kDa的凝集素表達條帶，約占菌體總蛋白量的 20%ο
[0020]將上述誘導培養后的菌液于4°C以5000rpm離心5分鐘，棄上清，取I克軍體(濕重)，用1mL 50mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液重懸，冰上超聲破碎菌體。菌體破碎液于4°C以1000rpm離心15分鐘，棄上清，收集沉淀并用30mL 2M尿素裂解液洗滌，然后于4°C以1000rpm離心15分鐘，棄上清，收集沉淀并用30mL 8M尿素裂解液溶解，然后于4°C以1000rpm離心15分鐘,棄去沉淀。將上清液(即，包涵體裂解液)用Q-Sepharose FastFlow 柱(GE 公司)純化，先后用 A 液(配方:8 mol/L 尿素、25 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)、I mmo/T, EDTA 和 I mmol/L DTT)和 B 液(配方:0.5 mol/L NaCl>8 mol/L 尿素、25 mmoI /L、Tris-HCl (pH 9.0)、1 mmol/L EDTA 和 I mmol/L DTT)進行梯度洗脫，280 nm 紫外監測，洗脫至不再出峰，分步收集洗脫液，取少量洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測，合并收集含有25kD蛋白的洗脫液。然后將收集的洗脫液過S印hedex G_25柱(GE公司)脫去洗脫液中的小分子鹽離子。然后，根據廠商說明書的指導，將包含25kDa蛋白的洗脫液在20°C、20mMTris-HCl(pH7.6),100mM NaCl的條件下，用1μ I的rEK (重組腸激酶，購自上海生工公司)反應8小時。然后，將反應液流經鰲合有Ni的NTA柱(Merck公司)以去除未酶切完全的帶有標記的蛋白，取流出液Iml上樣于Q-Sepharose Fast Flow柱,用含O至lmol/L NaCl的50mM Tris-HCl (pH7.0)緩沖液梯度洗脫，收集含25kD蛋白的洗脫峰，冷凍干燥后得到凝集素。
[0021]取上述三個批次制備的凝集素，經SDS-PAGE電泳檢測，純度均在95%以上，而且分子量均一性好，結果重復性佳。
[0022]實施例3凝集素對半乳糖結合能力的研究
取本發明實施例2純化獲得的凝集素進行研究，具體而言，根據鄭新民等(上海免疫學雜志，3 (2):65-70)報道的方法，研究其對小鼠胸腺細胞的凝集能力以及被半乳糖抑制(結合)的能力，同時以目前市售的花生凝集素(Medicago AB公司)作為對比。結果如表1所示，本發明的凝集素對小鼠胸腺細胞的凝集作用顯著強于目前市售的花生凝集素，大約提升5%左右；本發明和對比的凝集素對小鼠胸腺細胞的凝集作用都能夠為外加的半乳糖所抑制(結合)，尤其是本發明的凝集素被抑制(結合)得更為完全。
[0023]表1本發明和對比的凝集素對小鼠胸腺細胞的凝集作用及半乳糖的抑制影響實施例4糖蛋白糖鏈的半乳糖的檢測
由于本發明人發現該凝集素不但可以結合游離的半乳糖，還可以結合糖蛋白(如免疫球蛋白G)糖鏈的半乳糖，所以可以用于如下人IgG的檢測方法中:取本發明實施例2純化獲得的凝集素溶于包被緩沖液(配方:1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO3，用蒸餾水定容至100mL)中，配制成0.5 μ g/ml的凝集素溶液，加于酶標板上,每孔加300 μ L，于4°C放置10小時，使得凝集素包被在酶標板上。用PBST緩沖液(10 XPBST緩沖液(pH7.4)購自Amresco公司)洗滌3次，每次洗滌是向酶標板上的每個包被凝集素的孔加400 μ L PBST緩沖液，輕輕震蕩酶標板5分鐘，然后棄去。洗滌后每孔加含3%(W/W)小牛血清的PBST緩沖液400 μ L，于4°C放置10小時。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加入待測樣品或者標準品100 μ L，于37°C溫育10分鐘。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加200μ I以1:500稀釋度稀釋的用辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG抗體(Sigma公司)，于37°C溫育10分鐘。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加200 μ I顯色底物四甲基聯苯胺(Sigma公司)，避光保存15分鐘用以顯色。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加40 μ I 2mol/L H2SO4終止反應，在酶標儀上檢測450nm處的吸光值。經檢測，當用含1ng人免疫球蛋白標準品(桂林英美特生物技術有限公司)的時候，吸光值穩定于0.70左右。
[0024]實施例5類風濕性關節炎的診斷
對58名確診患有類風濕性關節炎的患者和92名健康人群(診斷未患類風濕性關節炎)取血清或者關節滑膜液樣本100 μ L，分別采用實施例4的方法進行檢測，發現對58名患者檢測的吸光值均為0.15^0.55，顯著小于0.70 ;大部分(55名)健康人檢測的吸光值在0.60以上，但是有37名健康人檢測的吸光值在0.60以下，難以與類風濕性關節炎患者區分，即對健康人群的檢測，實施例4預計僅有60%的準確率。
[0025]為此，我們結合對受試者樣品與蘑菇凝集素結合性能的檢測，來進一步提供診斷的準確率。具體而言，取蘑菇凝集素(南京德寶生化器材有限公司)溶于包被緩沖液(配方:1.59克Na2COjP 2.93克NaHCO3，用蒸餾水定容至100mL)中，配制成20 μ g/ml的凝集素溶液，加于酶標板上，每孔加300 μ L，于4°C放置10小時，使得凝集素包被在酶標板上。用PBST緩沖液(10XPBST緩沖液(pH7.4)購自Amresco公司)洗滌3次，每次洗滌是向酶標板上的每個包被凝集素的孔加400 μ L PBST緩沖液，輕輕震蕩酶標板5分鐘，然后棄去。洗滌后每孔加含1% (W/W)小牛血清的I3BST緩沖液400 μ L，于4°C放置10小時。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加入待測樣品或者標準品100 μ L，于37°C溫育10分鐘。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加200μ I以1:2000稀釋度稀釋的用堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgG抗體(Sigma公司)，于37°C溫育10分鐘。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加300 μ I顯色底物對-硝基苯磷酸酯(Sigma公司)，避光保存15分鐘用以顯色。再按上述洗滌方法用PBST緩沖液洗滌3次。然后，向每孔中加50μ1 lmol/L NaOH溶液終止反應，在酶標儀上檢測405nm處的吸光值。經檢測，當用含1ng人免疫球蛋白標準品(桂林英美特生物技術有限公司)的時候，吸光值穩定于0.25左右。對上述患者和健康人群檢測，患者的吸光值基本處于0.4(Tl.0,而健康人群0.20-0.50，也有交集，無法直接準確檢測。但是用實施例4的方法獲得的吸光值處以該方法獲得的吸光值的比值，除兩名健康人的比值小于2以外，其他人的比值均處于2~4之間；所有患者的比值均小于2，而且50名患者的比值處于0.3^0.9之間。
[0026]所以，用本發明的凝集素和蘑菇凝集素分別對樣品測得的比值來診斷類風濕性關節炎，準確率預計至少在95%以上。而且，無論是實施例4的方法，還是本實施例額外的方法，步驟都是對應的，因此可以并行實施，甚至在同一塊酶標板的不同孔中并行實施，因此基本上不增加檢測的時間，同時易于用自動化設備(包括自動加樣儀)來實施。
【權利要求】
1.凝集素，其具有的氨基酸序列: (1)如SEQ ID NO:1 所示；或， (2)是在如SEQID NO:1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一個或幾個氨基酸而獲得的氨基酸序列，而且其具有結合半乳糖的能力或者仍舊具有凝集胸腺細胞的能力。
2.編碼權利要求1所述的凝集素的核酸，優 選其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.包含權利要求2所述的核酸的載體,優選是表達載體。
4.宿主細胞，其包含權利要求3所述的載體，或者其用權利要求2所述的核酸轉化或轉染，優選其是原核細胞。
5.制備權利要求1所述的凝集素的方法，其包括: (1)在適合蛋白質表達的條件下，培養權利要求4所述的細胞；和， (2)從步驟(1)獲得的培養產物中分離出權利要求1所述的凝集素。
6.凝集胸腺細胞或者結合半乳糖的方法(優選是體外方法)，其包括將權利要求1所述的凝集素與胸腺細胞或者含半乳糖的物質混合的過程。
7.權利要求1所述的凝集素在制備凝集胸腺細胞或者結合半乳糖的試劑中的應用。
8.權利要求1所述的凝集素在制備用于診斷類風濕性關節炎的方法的試劑盒中的應用。
9.權利要求8所述的應用，其中診斷類風濕性關節炎的方法包括ELISA檢測樣品結合在用權利要求1所述的凝集素包被的酶標板上的免疫球蛋白的吸光值，得到值A。
10.權利要求9所述的應用，其中診斷類風濕性關節炎的方法進一步包括ELISA檢測樣品結合在用蘑菇凝集素包被的酶標板上的免疫球蛋白的吸光值，得到值B，計算A/B的比值。
【文檔編號】C12N15/12GK104130323SQ201410334550
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】燕秋, 富力, 張文利, 李盛, 馬悅 申請人:大連醫科大學