一種診斷類風濕關節炎的microRNA分子標志物及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于診斷類風濕關節炎的9種microRNA(miRNA)分子標記物組合及其在檢測試劑盒中的應用，利用這類miRNA分子標記物在類風濕關節炎患者血液中呈現異常表達來診斷類風濕關節炎，該miRNA標志物組合靈敏度和特異性高，取材方便，安全無創，為疾病早期診斷和監測病程提供重要依據。本發明還提供了用于診斷類風濕關節炎的試劑盒以及miRNA標志物在診斷試劑盒中的用途，其特征在于所述試劑盒包含用于檢測血漿中9種miRNA組合以及檢測這9種miRNA的試劑。
【專利說明】—種診斷類風濕關節炎的microRNA分子標志物及其檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術診斷領域，涉及用于診斷類風濕關節炎的9種microRNA分子標記物組合及其應用。
【背景技術】
[0002]類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis ；RA)是一類慢性,系統性的自身免疫性疾病，其主要病理改變為關節滑膜明顯增厚并有大量炎癥細胞浸潤，血管翳形成以及軟骨組織的侵蝕與破壞。一直以來，類風濕因子和抗環瓜氨酸蛋白抗體是美國風濕病協會診斷標準中的血清學指標，但敏感性和特異性均不高。目前仍不能闡明RA的發病機制及對疾病進行預測，因此找出疾病早期診斷和監測病程的生物標志物顯得十分重要。
[0003]miRNA是一類長度約為22個核苷酸，參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA,具有高度保守性、時序性和組織特異性。由于miRNA參與機體的各種重要的生理和病理過程，近年來倍受關注。miRNA的出現讓人們在對哺乳動物基因組的表達和功能的認識上發生巨大的改變。目前通過不同的實驗方法和計算機檢測已經證實了在193個物種中存在25141 個成熟 miRNA (miRBase database, versionl9.0, August, 2012)，到目前為止,在數據庫中已經有1223個人類miRN。據估計，一個miRNA可能調控幾百到幾千個靶基因，因此大約30% -90%的人類基因受到miRNA的調節。miRNA的表達和功能對于不同生理系統的發育和細胞穩態以及機體功能的維持具有重要的作用，尋找疾病診斷的標志物對其準確診斷一直是醫學研究領域的重點。miRNA可被分泌釋放到細胞外，參與多種炎性和自身免疫性疾病的發病過程。組織細胞內外的miRNA表達圖譜的差異使miRNA作為疾病診斷的潛在性生物標志。
【發明內容】
`
[0004]本發明的目的在于介紹一種用于檢測RA的miRNA標志物組合，通過在miRNA的3’端加上一特異性的莖環引物，通過逆轉錄和熒光定量PCR的方法檢測被檢樣本血漿中這些miRNA的含量，并與正常人血漿中相應miRNA的水平比較來診斷RA。
[0005]為實現上述目的，本發明的技術方案是:一組用于檢測RA的miRNA標志物組合，為:miR-9-5p (Sj -ucuuugguuaucuagcuguauga-3>, SEQ ID N0.1)、miR-122_3p (5’ -aacgccauuaucacacuaaaua-3>,SEQ ID N0.2)、miR-219-2_3p(5’ -agaauuguggcuggacaucugu-3>,SEQID N0.3)、miR_4634(5’ -cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQ ID N0.4)、miR_181d(5’ -aacauucauuguugucggugggu-S’，SEQ ID N0.5)、miR-342_3p (5’ -ucucacacagaaaucgcacccgu-3>, SEQID N0.6)、miR-4764_5p (5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQ ID N0.7)、miR_3926 (5’_uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQ ID N0.8) > miR-3925-3p(Sj -acuccaguuuuaguucucuug-3>,SEQ ID N0.9)。
[0006]本發明的優點是:篩查出的miRNA的標志物組合用于診斷RA的特異性和靈敏度聞ο
[0007]miRNA標志物組合通過以下步驟得到:
[0008]第一步:芯片篩選:選取臨床確診的初發活動期的RA患者5例，健康體檢者5例各采集血漿Iml以上使用miRCURY? LNAArray (versionl8.0)進行表達譜芯片篩選，得出在RA患者血漿中差異性表達的33種miRNA，其中22種miRNA升高，11種miRNA降低。
[0009]第二步:定量PCR初篩:選取臨床確診的RA患者18例，健康體檢者14例，通過逆轉錄和熒光定量PCR的方法檢測芯片篩選得出的33種差異性表達的miRNA，經過第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初篩得出22種miRNA。
[0010]第三步:定量PCR驗證:選取臨床確診RA患者57例，健康體檢者56例，使用上述相同的檢測方法，通過差異性分析找出9種在RA患者血漿中差異性表達的miRNA。這九種miRNA的組合在診斷RA的特異性和靈敏度高。
[0011]本發明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的檢測試劑盒
[0012]技術方案是:一種類風濕關節炎的診斷試劑盒，包括以下成分:
[0013](l)miRNA標志物組合:9種用于診斷類風濕關節炎的miRNA標志物，其序列見SEQID N0.1-9 ；
[0014](2)提取 RNA 試劑:mirVanaTM PARIS kit(Ambion, AM1556);另外還包括cel-miR-39 和 cel-miR-238 的控制外參，序列分別為:5’-ucaccggguguaaaucagcuug_3’ (SEQ ID N0.10)和 5，-uuuguacuccgaugccauucaga-3，(SEQ ID N0.11);。
[0015](3)逆轉錄試劑:5 X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNas`e Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特異性逆轉錄莖環引物。
[0016](4)熒光定量PCR試劑:SYBR Green Mix、miRNA特異性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
[0017]本發明的另一目的是基于上述miRNA標志物組合診斷試劑盒的檢測方法。
[0018]技術方案是:莖環結構的逆轉錄引物約42-50個核苷酸，其5’端的36_40個核苷酸序列固定，形成一個莖環結構，其3’端的6-8個核苷酸與miRNA互補。熒光定量PCR的特異性前向引物長約25-32個核苷酸，在3’端有11-18核苷酸與對應的miRNA互補，后向通用引物約23nt，其中15-18個核苷酸對應特異的莖環結構。在miRNA的3’尾端加上莖環結構，通過逆轉錄及熒光定量PCR的方法來檢測被檢測者血漿中miRNA的含量并與正常人血漿中miRNA含量比較來診斷類風濕關節炎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1芯片篩選RA患者血漿中差異性表達的miRNA。
[0020]圖2:miRNA標志物組合的診斷價值。
[0021]Logit(P)=0.964+0.045*miR-9_5p-0.367*miR-122_3p-0.191*miR-219-2_3p+0.083*miR-4634+l.146*miR-181d_3.572*342_3p+0.033*miR-4764_5p-0.313*miR-3926_0.6-16*miR-3925-3p
【具體實施方式】[0022]下面結合附圖對上述技術方案做【具體實施方式】的說明。
[0023]總體實驗方案如下:
[0024]收集就診于江蘇大學附屬醫院并經臨床確診的80例RA患者和75例正常健康體檢者外周血2ml于EDTA-K2抗凝管，室溫3000r/min離心IOmin,將上層血漿轉移潔凈1.5ml離心管，再以40C 16000Xg離心lOmin，吸取上層血漿于潔凈1.5ml離心管，_80°C凍存備用。
[0025]1.芯片篩選組:選取臨床確診的5例初發活動期的RA患者，5例健康體檢者各采集血漿Iml以上送往上海康成生物使用Exiqon公司使用miRCURY? LNAArray(versionl8.0)進行表達譜芯片篩選，經過聚類分析按照Fold Change > 1.5且P-value ( 0.05 篩選出 33 種候選 miRNA (22 種 miRNA 上升，11 種 miRNA 下降)。
[0026]2.定量PCR初篩組:選取臨床確診的RA患者18例，健康體檢者14例，使用mirVana? PARIS kit (美國Ambion公司)提取RNA ;通過逆轉錄使用反轉錄試劑(美國Promega公司)進行逆轉錄；再使用SYBR Green (日本TaKaRa公司)進行突光定量PCR的方法檢測33種候選miRNA。所有的miRNAs引物組合(miRNA特異性逆轉錄莖環引物、miRNA特異性前向引物和miRNA后向通用引物)購于中國廣州RiboBio公司；剔除Ct≤35的miRNA,經過定量PCR初篩得出22種候選miRNA。
[0027]3.定量PCR驗證組:選取臨床確診RA患57例，健康體檢者56例，用相同的檢測方法，通過差異性分析進一步篩選出9種在RA患者血漿中差異性表達的miRNA。
[0028]具體的實驗方法和結果如下:
[0029]一:芯片篩選組
[0030]1.Exiqon microRNA 芯片篩選
[0031]1.1 樣本 RNA 提取:使用 TRI reagent BD (MRCgene, TB-126), PolyacrylCarrier(MRCgene cat.n0.PC152), Acetic acid, Chloroform, Isopropanol, Ethanol,Nuclease-free water, Microcentrifuge (Termo)提取 RNA (RNA 質量報告見表 I)
[0032]表1.芯片篩選標本提取RNA質量(使用NanoDrop ND-1000檢測)
[0033]
【權利要求】
1.一組用于診斷類風濕關節炎的miRNA標志物，其特征在于其序列如SEQ ID N0.1-9所示。
2.miRNA標志物組合的檢測試劑盒,包括以下成分: (1)miRNA標志物組合:9種用于診斷類風濕關節炎的miRNA標志物，其序列見SEQ IDN0.1-9 ； (2)提取RNA試劑:包括cel-miR-39和cel-miR-238的控制外參，序列分別如SEQIDN0.10 和 SEQ ID N0.11 所示； (3)逆轉錄試劑:5X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNase Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特異性逆轉錄莖環引物； (4)熒光定量PCR試劑:SYBRGreen Mix、miRNA特異性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
【文檔編號】C12N15/113GK103805696SQ201310686940
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】焦志軍, 王文紅, 張瑩瑩, 朱波 申請人:焦志軍, 王文紅, 張瑩瑩