一種基于“睡美人”轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方法
【專利摘要】本發明公開一種基于“睡美人”轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方法，采用BglⅡ和NotⅠ酶切位點以及NotⅠ和EcoRⅠ酶切位點在pT/HB轉座子載體上加入長度為589bp的CMV啟動子和長度為720bp的EGFP（增強型綠色熒光蛋白）基因，構建為全長4849bp的pT-CMV-EGFP重組載體；利用脂質體轉染pT-CMV-EGFP轉座子及輔助轉座酶SB11，脂質體的用量為總DNA質量的3-4倍，轉座酶SB11與轉座子pT-CMV-EGFP質量比1:4體系轉染貼壁細胞3T3，懸浮細胞H22和原代培養DC細胞。本發明方法經36-48小時培養后，利用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測，篩選得到一個較通用的轉染體系，可高效穩定的轉染各種細胞系，并具有較好的適用性和可操作性。
【專利說明】一種基于"睡美人"轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方 法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術的基因工程領域，特別是一種基于"睡美人"轉座子系統制作 高效轉染各類細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 本發明涉及生物技術的基因工程領域，特別是一種基于"睡美人"轉座子系統制 作高效轉染各類細胞的方法。
【背景技術】
[0003] 轉座子（transposon)又稱為跳躍基因，是一種可在基因組內插入和切離并能改變 自身位置的DNA序列。"睡美人"（Sleeping Beauty, SB)是現在公認應用最為廣泛的轉座 子系統之一。近十五年大量的研究表明，"睡美人"不僅能在體外培養的魚、小鼠和人等大多 數脊椎動物的細胞中起作用，而且其介導的轉基因能夠穩定整合和長期表達，甚至整合的 "睡美人"還能通過生殖細胞傳遞給后代，在后代中繼續發揮作用。與其他轉座系統的效率 相比，"睡美人"在脊椎動物中的轉座效率最高，且體內的轉染效率要比體外高。
[0004] 一般用于基因轉移和表達的"睡美人"系統包含帶有T元件的轉座子 (transposon)和介導其轉座的轉座酶（transposase)兩部分。本發明選用SB11轉座酶，此 酶在已初具轉座酶活性的SB10基礎上對其4個位點進行定點突變，活性比SB10提高了約3 倍。pT轉座子包含由兩端帶有32bp的反向重復序列（IR)及同向重復序列（DR)組成的末 端反向重復序列（inverted terminal repeats，ITRS)，ITRS的兩個DR均可以和轉座酶相 結合，與細胞內的一種高度保守蛋白一高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG)HMGBl 結合形成突起復合物。轉座酶催化釋放轉座子序列，并使其特異性地整合到基因組中的ΤΑ 雙核苷酸位點。轉座子pT/ΗΒ從載體圖譜可見，在多克隆位點（MCS)兩端含有極為重要的 IR/DR序列。但其中缺少能夠啟動插入基因表達的啟動子，這也許會造成載體上目的基因的 過低表達甚至不表達。
[0005] 人類巨細胞病毒（CMV)啟動子屬于組成型啟動子，它包含了三部分：CMV基因， ΙΕ1/ΙΕ2增強子，以及在ΙΕ94基因上游存在的一個強啟動子，是上游調節區復合體的主要 部分。ΙΕ1和ΙΕ2蛋白的表達受增強子的調控，可立即早期啟動上游序列。因此CMV啟動子 被認為是啟動真核基因表達最有力的啟動子。其又因集中了細胞轉錄因子結合位點而具有 異常高的活性，并且在多種類型細胞的影響條件下均有活性。所以通常被用于構建高效真 核表達載體，廣泛應用于在基因工程及基因治療領域。
[0006] 綠色突光蛋白（Green Fluorecence Protein, GFP)由238個氨基酸構成，自身就 是一個生物發光系統，附帶有激發后能發射生物熒光的發光色基，無需熒光素酶的參與。增 強型綠色突光蛋白（Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP)經野生型綠色突光蛋白 突變，產生雙氨基酸取代而成，其熒光比野生型強35倍，具有結構穩定，表達高效，無種系 依賴性等特點。帶有EGFP基因的載體不僅適用于細胞基因表達、蛋白定位檢測和細胞示蹤 標記，更能以融合蛋白的形式直觀有效的檢測表達載體目的基因的表達水平。因此，可將增 強型綠色熒光蛋白作為一種良好的細胞指示劑，進行體外或體內實驗研究。
[0007] 外源基因進入宿主細胞的主要四種方法是：電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體介導法和 病毒介導法。由于電穿孔法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒介導的前期準 備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響，所以現在普遍采用的是脂質體法轉染細胞。利用 脂質體介導法關鍵要素就是防止其毒性的產生對細胞的影響，因此脂質體與質粒的比例， 質粒總量，多質粒系統內各質粒比份量，以及細胞密度，轉染的時間長短和培養基中血清的 含量都是影響轉染效率的重要問題。
[0008] 對于所有轉染而言，可能是因為細胞間膜結構的差異，懸浮細胞的轉染效率較貼 壁細胞要低得多，由于細胞分裂狀態差異原代細胞更難于前兩者。原代細胞的轉染一般需 要價格非常昂貴的專用試劑盒進行轉染，且轉染效率也不甚理想。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的是提供一種基于"睡美人"轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方 法，構建一個含有可利用CMV啟動的EGFP熒光表達轉座子系統，并通過我們所優化獲得的 轉染條件能高效穩定的轉染各種細胞系。
[0010] 具體技術方案： 一種基于"睡美人"（Sleeping Beauty)轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方法： (1)通過基因工程手段構建含有EGFP熒光蛋白的pT載體，再加上可以高效啟動目的 基因表達的CMV啟動子，形成完整的pT-CMV-EGFP轉座子表達系統。利用PCR的方法從 pEGFP-Nl載體中利用Bgl II和Not I酶切位點以及Not I和EcoR I酶切位點在pT/ΗΒ轉 座子載體上分別插入長度為589bp的CMV啟動子和長度為720bp的EGFP (增強型綠色熒光 蛋白）基因，構建全長為4849bp的pT-CMV-EGFP重組載體。
[0011] (2)采用脂質體介導法轉染細胞，優化后的轉染方案為：脂質體的用量為總DNA質 量的3-4倍，轉座酶（SB11)與轉座子（pT-CMV-EGFP)質量比為1:4的體系轉染3T3細胞系， H22細胞系，以及原代培養的樹突狀細胞（DC)。
[0012] 本發明按上述方法制備的轉染細胞經36-48小時培養后，利用熒光顯微鏡和流式 細胞儀檢測，篩選得到一個轉染各種細胞系較通用的體系，可高效穩定的轉染，具有較好的 適用性和可行性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明的pT/ΗΒ載體圖譜。
[0014] 圖2為本發明的pT-CMV-EGFP載體酶切鑒定圖。
[0015] 圖3為本發明的pT-CMV-EGFP載體構建流程示意圖。
[0016] 圖4為本發明的3T3細胞表達EGFP的熒光顯微鏡圖。
[0017] 圖5為本發明的H22細胞表達EGFP熒光的流式檢測圖。
[0018] 圖6為本發明的DC細胞表達EGFP熒光的流式檢測圖。
【具體實施方式】
[0019] 一種基于"睡美人"轉座子系統的高效轉染各類細胞的方法，所需相關材料： SB11及pT/HB質粒購自addgene公司； PMD19-T克隆載體購自日本寶生物公司； pEGFP-Nl質粒由廣西大學動物遺傳育種與繁殖實驗室饋贈； Lipofectamine LTX 試劑盒購自 Invitrogen 公司； 3T3及H22細胞系由中國科學院昆明動物所惠贈； 樹突狀細胞（DC) Balb/c小鼠由昆明醫學院提供。
[0020] 根據表達載體pEGFP-Nl圖譜和序列設計一對含有Bgl II / Not I酶切位點的引 物，從pEGFP-Nl質粒中PCR擴增并回收得到589bp的目的片段DNA，此片段包括CMV增強 區，CMV全序列及TATA box。目的片段連在pMD19-T克隆載體上構成pMD-CMV;再根據表 達載體pEGFP-Nl圖譜和序列設計一對含Not I /EcoR I酶切位點的引物，從中釣取長度 約720bp的EGFP基因全長，連接于pMD19-T克隆載體中，構成pMD-EGFP。通過限制性內切 酶Bgl II / Not I以及Not I / EcoR I雙酶切后再連接的方法，構建pT-EGFP (用于對照） 和pT-CMV-EGFP表達重組子。酶切鑒定結果，泳道1、3、4為pT-CMV-EGFP線性化條帶，約為 4900bp ;泳道2為Bgl II / EcoR I雙酶切結果，較大條帶3500bp，較小條帶1300bp ;泳道 5、6分別為Bgl II / Not I和Not I / EcoR I雙酶切結果，較小條帶分別為CMV約590bp 及EGFP為720bp。最終測序結果比對CMV，EGFP序列無誤，成功構建的pT-CMV-EGFP轉座 子載體可用于后續轉染實驗。
[0021] 用于PCR擴增的引物序列為： CMV-Bgl II :5'-GAAGATCTTAGTTATTAATAGTAATCAAT-3' CMV-Not I :5'-ATTTGCGGCCGCGATCTGACGGTTCACTA-3' EGFP-Not I ： 5'-ATTTGCGGCCGCGTCGCCACCATGGTGAG-3' EGFP-EcoR I :5'-CGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGT-3' 1、確實脂質體與總DNA優化質量比 采用脂質體介導轉染方法，Lipofectamine LTX脂質體與總DNA質量比例分別為2:1、 3:1和4:1，攜帶pEGFP-Nl熒光表達載體轉染3T3細胞系。本次轉染實驗共轉染六孔，每個 配比做兩個復孔。去內毒素抽提的pEGFP-Nl質粒濃度為0. 23μ g/μ 1，貼壁的3T3細胞以 每孔8χ105提前接種于24孔板上，待細胞融合度達80%時，每孔轉染DNA總量1 μ g。經40 小時后，通過流式細胞儀檢測綠色熒光的發射波長，鑒定轉染后表達熒光的細胞陽性率。
[0022] 檢測結果顯示，脂質體和總DNA質量2:1配比的轉染細胞陽性率為27%及29. 9% ; 脂質體和總DNA質量3:1配比的轉染細胞陽性率為35. 7%及37. 6% ;脂質體和總DNA質量 4:1配比的轉染細胞陽性率為38. 1%及42. 9 %。從結果上可明顯看出，脂質體和總DNA質 量比為3:1和4:1時，轉染效率明顯高于2:1混合比，所以確定了脂質體的用量為總DNA質 量的3-4倍最適宜。過低影響轉染效率，過高超出脂質體說明書建議使用范圍，易造成對細 胞毒性較高以及試劑浪費。
[0023] 由于公認的細胞轉染難度從貼壁細胞系，懸浮細胞系直到原代培養的細胞依次遞 增，本發明需要實現在原代培養的樹突狀細胞（DC)中轉染目的基因表達，因此，以下實施選 擇在懸浮細胞系（H22)中完成。
[0024] 2、確實pT-CMV-EGFP與轉座酶SB11的最佳質量比 本發明在輔助轉座酶3811質粒和？1^1^46--質粒比例4 :1、1:1、1:4、1:8和1:12 中，確定一個轉染效率最高的配比量。采用脂質體介導轉染方法，Lipofectamine LTX脂 質體與總DNA質量選取4:1混合比，輔助轉座酶SB11和pT-CMV-EGFP表達載體比例4:1、 1:1、1:4、1:8和1:12,每個配比三個復孔，轉染H22細胞系。去內毒素抽提的SB11和 pT-CMV-EGFP質粒濃度分別為0. 69 μ g/ μ 1和0. 196 μ g/ μ 1，H22細胞以每孔lxlO6提前接 種于24孔板上，每孔轉染DNA總量1 μ g。經42小時后，通過流式細胞儀檢測綠色熒光的發 射波長，鑒定染后表達熒光的細胞陽性率。
[0025] 檢測結果顯示，輔助轉座酶SB 11質粒和pT-CMV-EGFP質粒比例4:1、1:1、1:4、1:8 和1:12中，1:4配比下，陽性細胞率和平均熒光強度（MFI)都明顯高于其他配比組，達到 47. 7%。所以確定了輔助轉座酶SB11質粒和pT-CMV-EGFP質粒配比在1:4時最佳。
[0026] 采用業界公認轉染難度較大的原代培養樹突狀細胞（DC)為靶細胞。從Balb/c小 鼠股骨/脛骨骨髓中沖出混合樣細胞做DC細胞誘導培養，以每孔lxlO 6細胞數接種于24 孔板上，在誘導的第3天和第5天上述確定的體系：Lipofectamine LTX脂質體與總DNA比 例4:1，輔助轉座酶SB11質粒和pT-CMV-EGFP質粒比例1:4,每孔DNA總量為1 μ g，轉染DC 細胞兩次，每次轉染時用不含血清的培養基預混DNA稀釋液50 μ 1和脂質體稀釋液50 μ 1， 并將兩者混合室溫孵育30min后滴加至細胞培養液中，6小時后更換為新鮮的完全培養基。 以同樣方式設置相同體系下未連入CMV啟動子的pT-EGFP質粒為同型對照轉染組（pT-EGFP 質粒濃度為〇. 77 μ g/μ 1)，至第7天時，收集細胞，通過流式細胞儀檢測攜帶綠色熒光蛋白 的細胞數比例，以及用DC細胞特異結合抗體⑶11C標記檢測經誘導的混合細胞樣中，DC細 胞攜帶標簽基因的陽性率。
[0027] 檢測結果顯示，脂質體與總DNA質量4:1混合，輔助轉座酶SB11質粒和 pT-CMV-EGFP/pT-EGFP質粒1:4配比體系下，轉染兩次后，DC細胞約占68-90%，混合細胞陽 性率平均為14. 8%及3. 2%，同時，可見經誘導轉染的細胞中，DC細胞陽性率平均為23. 4%及 6. 2%。攜帶CMV啟動子并遵照本說明優化方案轉染DC的細胞陽性率明顯更為理想，也高于 大部分實驗中提到的原代細胞轉染率不及10-15%的結果。
[0028] 以上說明，本發明中構建的pT-CMV-EGFP轉座子在聯合SB11轉座酶按上述優化后 的體系轉染，不僅可對常規細胞系起效，也可使目的基因在轉染難度較大的原代半貼壁細 胞中高效表達。
【權利要求】
1. 一種基于"睡美人"轉座子系統制作高效轉染各類細胞的方法，其特征在于： (1) 利用Bgl II和Not I酶切位點以及Not I和EcoR I酶切位點在pT/HB轉座子載 體上加入長度為589bp的CMV啟動子和長度為720bp的EGFP (增強型綠色熒光蛋白)基因， 構建全長為4849bp的pT-CMV-EGFP重組載體； (2) 利用脂質體轉染pT-CMV-EGFP轉座子及輔助轉座酶SB11，脂質體的用量為總DNA 質量的3-4倍，轉座酶SB11與轉座子pT-CMV-EGFP質量比1:4體系轉染貼壁細胞3T3,懸浮 細胞H22和原代培養細胞DC。
【文檔編號】C12N5/10GK104195112SQ201410436949
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】楊柳, 蘇曉三, 王翼寅, 陳睿, 張蕾 申請人:昆明市第一人民醫院