一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法

專利名稱：一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于轉基因載體技術領域，涉及一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法。
背景技術：
轉基因是將攜帶基因的DNA片段導入基因組中的方法。通過觀察由轉基因產生的生物體的表型改變，可以獲得相關基因的功能信息。另外，轉基因技術還可用于改良生物體的性狀，有巨大的經濟價值。在哺乳動物細胞或動物體內最常用的轉基因方法是將線性化的攜帶外源基因的DNA通過脂質體、電穿孔或顯微注射等手段導入細胞中，使DNA隨機整合入基因組中。這種方法有很多缺點(I)整合效率低，因此在大多數哺乳動物中用此法不能高效地培育轉基 因動物；(2)多數情況下線性化的DNA會形成多拷貝的串聯重復，即多聯體(concatamer)，其很難模擬內源基因的正常生理狀況；(3)多聯體在傳代時不同轉基因拷貝間易于發生重組而造成缺失(deletion)，或由于甲基化修飾影響轉基因的穩定表達；(4)由于利用此方法很難確定轉基因插入所在基因組中的位置，因此也無法對插入位點附近的染色體環境作出評估。與單純的線性化DNA相比，病毒載體能使轉基因更高效地整合入基因組，但其主要不足在于(I)負載容量小，即所能攜帶外源DNA片段的長度有限；(2)宿主也會對病毒進行甲基化修飾，使轉基因表達靜默；(3)制備病毒操作繁瑣；(4)雖然用于轉基因的大多是復制缺陷型病毒，但安全性仍是一個需要警惕的問題。轉座子(transposon)是一類能在宿主基因組中變更插入位置的可移動遺傳因子，其變更插入位置的過程被稱為轉座(transposition)。pi ggyBac (PB)轉座子是病毒遺傳學家Malcolm J. Fraser最初發現并構建二元轉座系統證明其不僅僅在一個宿主中具有轉座活性。PB轉座子全長2472bp，其中間飽含一個長2. Ikb的轉錄區域，包含一個潛在的啟動子和僅含一個外顯子的長I. 8kb的0RF，它編碼一個預測大小為64kDa的轉座酶，并且依據該轉錄酶的方向來區分其外側的兩個末端。其兩端最外側有各長13bp的堆成的反向末端重復序列(inverted terminal repeat, ITR),其內側各有一段間隔區(spacer),分別長3bp和31bp,再靠內側是各長19bp的對稱亞末端反向重復序列(sub-terminal inverted repeat, STR)。PB轉座子最初是由Handler將其用于昆蟲生殖細胞轉化，至2005年之前PB轉座子已經被證明能在5個目的20多種昆蟲以及扁形動物、原生動物體內進行轉座，在這些非脊椎動物中的應用主要集中在兩方面生殖細胞轉化(即轉基因)和基因插入誘變，這些為PB轉座子在哺乳動物中的應用奠定了基礎。2005年Cell雜志刊登封面文章，由復旦大學發育生物所改造的PB轉座系統能夠證明在哺乳動物細胞和小鼠中進行高效轉座，并成功培育出由PB轉座子介導的轉基因小鼠，這為細胞轉基因提供了一種新型模式，并且該研究表明PB轉座子具有安全、高效、負載容量大并相對于一般載體來說由于其插入位點為TTAA而具有比較高的特異性等特點。近幾年，PB轉座系統被應用到了更多的領域，例如利用PB轉座子攜帶某些因子誘導成纖維細胞重編程成為多能干細胞，RNA干擾，轉基因動物的生產以及基因捕獲和基因治療等。

發明內容
本發明解決的問題在于提供一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法，該載體能夠使目的基因穩定持續地表達。本發明是通過以下技術方案來實現一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，包括供體載體和輔助載體；·
所述的供體載體包括PiggyBac轉座子5’重復末端序列5’ TR和3’重復末端序列3’ TR，在5’ TR和3’ TR之間設有兩個絕緣子，在絕緣子序列之間設有多克隆位點；所述的輔助載體包括PiggyBac轉座酶編碼基因Pbase，在Pbase的上游設有啟動子，在其下游設有PloyA。所述的5’ TR的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；5’ TR的核苷酸序列如SEQ.ID. NO. 2 所示。所述的絕緣子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。所述的多克隆位點的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。所述的Pbase的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；所述的啟動子為PTK啟動子。所述靠近5’ TR的絕緣子與多克隆位點之間還設有相互連接的抗生素篩選基因和突光標記基因。所述的抗生素篩選基因和熒光標記基因的兩端分別設有兩個同向的Loxp序列Loxpl 和 Loxp2 ；在Loxpl與抗生素篩選基因之間還設有SV40 PloyA，抗生素篩選基因與熒光標記基因通過2A序列連接，熒光標記基因與Loxp2之間還設有CMV啟動子。所述的抗生素篩選基因為Neo基因，所述的熒光標記基因為EGFP。一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體的制備方法，包括以下步驟I)分別合成如SEQ. ID. NO. I所示的PiggyBac轉座子5，TR和如SEQ. ID. NO. 2所示的PiggyBac轉座子3’ TR序列，以及如SEQ. ID. NO. 3所示的雞源絕緣子序列、如SEQ.ID. NO. 4所示多克隆位點的序列，然后按照5’ TR-雞源絕緣子-多克隆位點序列-雞源絕緣子-PiggyBac轉座子3’ TR的元件順序連接，并將所構建的片段通過TA克隆的方式克隆至pMD18-T simple載體中，得到質粒TP ；2)擴增上游連接有2A序列的NEO基因將其克隆到pEGFP_Cl質粒中EGFP的下游，得到質粒pNA ；3)以pNA為模板，以CEANF和CEANR為引物擴增CMV至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段克隆至TP質粒中的靠近5’端的絕緣子與多克隆位點之間，得到pBNW-TPl載體；所述的 CEANF 為gagcagatct ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgttatcccctgat tctgt ；
所述的CEANR為 tatcgtcgac ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgcttacaatttacgc cttaag ；4)擴增PTK啟動子，并將其克隆至pEGFP-Cl質粒中，得到pPTK質粒；5)擴增如SEQ. ID. NO. 5所示的Pbase編碼基因，并將其克隆至pPTK質粒中PTK啟動子的下游，得到質粒pPTK-Pbase ；6)以pPTK-PBase為模板，擴增PTK至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段通過TA克隆的方式連接克隆至pMD18-Tsimple載體中，得到pBNW_TD2載體；所構建的載體pBNW-TPl和pBNW_TD2共同組成通用型PiggyBac轉座子轉基因載體。所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體在外源基因轉染細胞中的應用將外源基因克隆至供體載體的多克隆位點中，然后再與輔助載體混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，包括供體載體和輔助載體，將外源基因克隆至供體載體的多克隆位點中，然后再與輔助載體混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆，通過PB轉座子元件將外源基因特異性整合到基因組中。供體質粒在輔助載體質粒表達的轉座酶的作用下，在細胞中發生轉座整合，特異性插入TTAA位點。本發明提供的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，由于兩個雞絕緣子核心序列的存在，在轉座子整合至基因組的情況下，能有效避免基因組表觀遺傳修飾和位置效應對目的基因的影響，使目的基因穩定持續地表達；多克隆位點可用的稀有酶切位點如下Bstzl7I，AccIII, AscI, Bell, EspI，Fsel，Nhel，PacI，Sse232I，Sbfl，Spel，大多數基因組中這些酶切位點出現的頻率很小，可滿足外源基因克隆至本載體，同時在引入報告基因的同時在多克隆位點5’端引入T3通用測序引物，便于對目的基因進行測序。本發明提供的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，利用2A序列將EGFP和NEO基因串聯，共用CMV啟動子啟動表達，在不影響其功能的前提下，減少了載體分子量，并且由于報告系統的兩端存在兩個同向Loxp序列，可根據實驗需要加入Cre酶去除報告系統。本發明提供的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，鑒于PB轉座子的特點，該系統在轉基因動物生產、永生化細胞系的建立、RNA干擾以及IPS細胞的誘導等領域具備了很好的應用前景。且越來越多的文獻對PB轉座子具體轉座的某些機理也得到了進一步的闡明，這為轉座子在哺乳動物轉基因大規模應用上奠定了基礎。


圖I為通用型PiggyBac轉座子轉基因載體系統的構建流程圖；圖2為載體TP的單酶切鑒定電泳圖譜，其中標號M為DNA分子量Marker, I為SpeI單酶切TP。圖3為載體pNA雙酶切鑒定結果，標號為M為Marker，I為BspEI和BamhI雙酶切P NA結果。圖4為載體pBNW-TPl的酶切鑒定電泳圖譜，標號M為Marker, I為Sail單酶切結果，2為BglII和SalI雙酶切結果。圖5為載體pPTK酶切鑒定結果，標號M為Marker, I和2均為HindIII和SacII雙酶切pPTK結果。圖6為載體pPTK-Pbase酶切鑒定結果，標號M為Marker，I和2均為HindIII和 BamHI 雙酶切 pPTK-Pbase 結果。圖7為載體pBNW-TD2單酶切鑒定結果，標號M為Marker，I為SacII單酶切PBNW-TD2 結果。圖8為通用型PiggyBac轉座子轉基因載體系統載體圖譜，其中A為供體質粒pBNW-TPl載體圖譜，B為輔助質粒pBNW-TD2載體圖譜。圖9為Loxp序列功能驗證電泳圖譜,標號M為Marker, I為SpeI單酶切pBNW-TPl結果，2為SpeI單酶切pBNW-TPL結果。圖10為將通用型PiggyBac轉座子轉基因載體系統質粒轉染293細胞，利用G418藥物持續篩選兩星期所得單克隆細胞，其中A為40倍物鏡下暗場細胞生長圖片，B為40倍物鏡下明場細胞生長圖片。圖11為篩選的293單細胞克隆擴大培養后圖片，其中A為40倍物鏡下暗場細胞生長圖片，B為40倍物鏡下明場細胞生長圖片。圖12為PiggyBac轉座子轉基因載體系統質粒轉染293細胞后，利用染色體步移對穩定篩選出單克隆細胞基因組中側翼序列檢測并分析的結果。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I、材料及試劑載體pMCIneo(stratagen), pMD18_T simple (TAKARA), pEGFP-Nl 和 pEGFP-Cl 購自Clotech公司，phspBac載體(Handler and Harrell, 2001a)由美國農業部農業昆蟲病害南大西洋中心Handler教授惠贈。菌株DH5α (天根)試劑各種內切酶(NEB，MBI),T4DNA 連接酶(TAKARA)，CIAP(TAKARA)，Klenow(TAKARA)，質粒小提試劑盒(上海生工)，質粒大提試劑盒(Promega),凝膠回收試劑盒(Axygen)，HP DNA 轉染試劑(Roche)，G418 (Sigma)7PCR 相關試劑(TAKARA)，染色體步移試劑盒(TAKARA) T4核苷酸激酶(TAKARA)，血液、細胞、組織基因組提取試劑盒(天根)。所用到的引物如下(委托上海生工合成)NEOF:GGATCCGGAAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCAGGAGACGTTGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTCTCCGGCGTTAGGATGATTGAACAAGATGGATTG ；NEOR:CGCGGATCCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG ； CEANF:GAGCAGATCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT ；CEANR:TATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG ；
PTKF:CTCAAGCTTTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTCG ；
PTKR:GGACCGCGGATTGGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTT ；
PbF:TCCCCGCGGATGGGTAGTTCTTTAGACGATGA ；
PbR:CGCGGATCCTCAGAAACAACTTTGGCACATATC ；
PPBF:TAAAACGACGGCCAGTGAAT ；
PPBR:CGCTTACAATTTACGCGTTAAG ；
SPlTATGTCGACTACGTAGGGGAGCTCA ；
SP2 ACGGGATCGCTTTCCTCTGAAC ；
SP3 TGACTCACGCGGTCGTTATAGTTC
2、參見圖I所示的構建方法，分別構建pBNW-TPl和pBNW-TD2載體
pBNW-TPl載體的構建
O通過南京金斯瑞生物公司分別合成如SEQ. ID. NO. I所示的PiggyBac轉座子
5’TR和如SEQ. ID. NO. 2所示的PiggyBac轉座子3’TR序列，以及如SEQ. ID. NO. 3所示的雞源絕緣子序列、如SEQ. ID. NO. 4所示多克隆位點的序列，然后按照PiggyBac轉座子5’ TR-雞源絕緣子-多克隆位點序列-雞源絕緣子-PiggyBac轉座子3’TR的元件順序連接，并將所構建的片段通過TA克隆的方式克隆至pMD18-T simple載體中，該質粒命名為TP。載體TP的單酶切鑒定電泳圖譜如圖2所示,可以看到載體TP構建成功。2)以NEOF和NEOR作為引物，上下游引物5’端設計BspEI和BamHI兩個酶切位點，以pEGFP-Nl質粒為模板擴增NEO基因，并在上游引物中引入2A序列；所述的2A序列為 cctaacgccg gagaagaaga agggcccagg gttggactca acgtctcctgccaacttgag aaggtcaaaa tt ；PCR擴增條件95度變性5min，然后進行如下30個循環，95度30s，59度30s，72度Imin,最后一個循環結束后,進行72度延伸lOmin。通過膠回收該片段，并將其與pEGFP-Cl質粒分別用BspE I和BamH I雙酶切，然后將其克隆至PEGFP-Cl質粒中，所得質粒命名為pNA。載體pNA雙酶切鑒定結果如圖3所示，結果檢測表明載體pNA構建成功。3)以pNA為模板，以CEANF和CEANR為引物擴增以下片段CMV-EGFP-2A-NE0-PIoyA ；其中，引物上下游5’端引入兩個順序相同的長度為34bp的Loxp回文序列，上游引物Loxp外側引入T3引物(T3primer),并分別在上下游引物5’末端設計BglII和SalI酶切位點，PCR擴增條件95度變性5min,然后進行如下32個循環，95度30s，61度35s，72度3min,最后一個循環結束后,進行72度延伸lOmin。擴增后的片段膠回收后，并將其與TP質粒分別用BglII和SalI雙酶切，然后將其克隆至TP質粒中，所得質粒命名為pBNW-TPl。載體pBNW-TPl的酶切鑒定電泳圖譜如圖4所示，結果表明載體pBNW_TPl構建成功。pBNW-TD2載體的構建
4)以PTKF和PTKR分別為上下游引物(引入HindIII和SacII酶切位點)，以PMClneo載體為模板，擴增PTK啟動子；
PCR擴增條件95度變性5min，然后進行如下35個循環，95度30s，58度30s，72度30s,最后一個循環結束后,進行72度延伸lOmin。目的片段膠回收后，并將其與pEGFP-Cl質粒分別用HindIII和SacII雙酶切，然后將其克隆至pEGFP-Cl質粒中，所得質粒命名為pPTK。5)以PbF和PbR分別為上下游引物(引入SacII和BamHI酶切位點)，以phspBac載體為模板，擴增PiggyBac轉座酶(Pbase)編碼基因序列；PCR擴增條件95度變性5min，然后進行如下33個循環，95度35s，60度35s，72度2min,最后一個循環結束后,進行72度延伸lOmin。所擴增的Pbase編碼基因的序列如SEQ. ID. NO. 5所示；擴增后的片段膠回收后，并將其與pPTK質粒分別用SacII和BamHI雙酶切，然后將其克隆至pPTK質粒中，所得質粒命名為pPTK-Pbase。載體pPTK-Pbase酶切鑒定結果如圖6所示，結果表明載體構建成功。6)以PPBF和PPBR分別為上下游引物，以pPTK_PBase為模板，擴增PTK-Pbase-PloyA片段，PCR擴增條件95度變性5min，然后進行如下32個循環，95度35s，61度35s，72度2. 5min，最后一個循環結束后，進行72度延伸lOmin。片段膠回收,通過TA克隆的方式連接克隆至pMD18_T simple載體中，構建的質粒載體命名為PBNW-TD2。載體PBNW-TD2單酶切鑒定結果如圖7所示，結果檢測表明載體構建成功。參見圖8所示的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體系統載體圖譜，所構建的載體pBNW-TPl和pBNW-TD2共同組成通用型PiggyBac轉座子轉基因載體系統，使用時，將外源基因克隆至pBNW-TPl的多克隆位點(MCS)中，和PBNW-TD2按常用的1:1的比例混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆后，檢測整合位點側翼序列，確定其功能。3、載體相關元件的檢測I)將載體pBNW-TPl轉化入組成型表達Cre酶的大腸桿菌BM2. 5 (Clontech)中驗證Loxp序列的功能Cre酶是一種位點特異性重組酶，能介導兩個同向34bp的Loxp位點之間的序列發生特異性重組，使Loxp位點間的序列被刪除。該實驗方法具體操作如下將BM2.5大腸桿菌參照《分子克隆實驗指南》第三版中的Inoue法制備成為感受態細胞，利用傳統質粒轉化方法將載體pBNW-TPl轉化進入該感受態細胞內，并篩選重組子擴大培養，提取擴大培養后的重組子中質粒并命名為pBNW-TPL，利用spel分別單酶切pBNW_TP I和pBNW_TPL，O. 8%凝膠電泳結果顯示pBNW-TPL比pBNW-TP短2500bp左右，結果如圖9所示；這說明報告系統已被刪除，送測序后結果與電泳結果相符，證明Loxp序列功能正常，在轉座成功后，可利用Cre酶去除報告系統。2 ) EGFP和NEO基因功能將質粒pBNW-TPl和pBNW_TD2分別轉化DH 5 α大腸桿菌經氨芐青霉素(Amp)篩選擴大培養之后，大批量提取質粒后，利用HPDNA轉染試劑將上述質粒按照I: I的比例轉染293細胞，24h后綠色熒光表達正常；
細胞換液后加入500ug/ml濃度的G418并持續篩選一星期，對照組全部死亡，陽性對照和實驗組均正常生長，證明通過2A序列連接的EGFP和NEO基因功能正常。圖10所示為利用G418藥物持續篩選兩星期所得單克隆細胞，其中A為40倍物鏡下暗場細胞生長圖片，B為40倍物鏡下明場細胞生長圖片。結果表明篩選到陽性克隆的細胞。3)轉座功能將所篩選的陽性293細胞單克隆擴大培養后(如圖11所示，其中A為40倍物鏡下暗場細胞生長圖片，B為40倍物鏡下明場細胞生長圖片)，提取基因組，以基因組為模板利用染色體步移的方法(熱不對稱PCR)檢測PB轉座子整合位點，在已知轉座子序列中設計三條特異性引物SP1、SP2、SP3，具體實驗原理及步驟參照TAKARA染色體步移試劑盒說明書(貨號D316)，將擴增的條帶克隆至pMD19-T載體，測序表明PB轉座子元件特異性整合到人類基因組TTAA位點，證明本系統轉座功能正常，具體的檢測結果如圖12所示其中A圖為I號克隆檢測結果，圖A I是轉座子5’ TR和檢測的側翼序列比對結果，圖A 2將側翼序列輸入NCBI數據庫進行BLAST比對結果，證實I號克隆插入TTAA位點，并整合到人基因組8號染色體。圖B為2號克隆檢測結果，其中圖B I為轉座子5’ TR和檢測的側翼序列比對結果，圖B 2將側翼序列輸入NCBI數據庫進行BLAST比對結果，證實2號克隆插入TTAA位點，并整合到人基因組9號染色體。
權利要求
1.一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，包括供體載體和輔助載體； 所述的供體載體包括PiggyBac轉座子5 ’重復末端序列5 ’ TR和3 ’重復末端序列3 ’ TR，在5’ TR和3’ TR之間設有兩個絕緣子，在絕緣子序列之間設有多克隆位點； 所述的輔助載體包括PiggyBac轉座酶編碼基因Pbase，在Pbase的上游設有啟動子，在其下游設有PloyA。
2.如權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的5’TR的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示;5，TR的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的絕緣子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
4.如權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的多克隆位點的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
5.如權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的Pbase的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示；所述的啟動子為PTK啟動子。
6.如權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，靠近5’TR的絕緣子與多克隆位點之間還設有相互連接的抗生素篩選基因和熒光標記基因。
7.如權利要求6所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的抗生素篩選基因和突光標記基因的兩端分別設有兩個同向的Loxp序列Loxpl和Loxp2 ； 在Loxpl與抗生素篩選基因之間還設有SV40PloyA,抗生素篩選基因與突光標記基因通過2A序列連接，熒光標記基因與Loxp2之間還設有CMV啟動子。
8.如如權利要求7所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體，其特征在于，所述的抗生素篩選基因為Neo基因,所述的突光標記基因為EGFP。
9.一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 O分別合成如SEQ. ID. NO. I所示的PiggyBac轉座子5’ TR和如SEQ. ID. NO. 2所示的PiggyBac轉座子3’ TR序列，以及如SEQ. ID. NO. 3所示的雞源絕緣子序列、如SEQ.ID. NO. 4所示多克隆位點的序列，然后按照5’ TR-雞源絕緣子-多克隆位點序列-雞源絕緣子-PiggyBac轉座子3’ TR的元件順序連接，并將所構建的片段通過TA克隆的方式克隆至pMD18-T simple載體中，得到質粒TP ； 2)擴增上游連接有2A序列的NEO基因將其克隆到pEGFP-Cl質粒中EGFP的下游，得到質粒pNA ； 3)以pNA為模板，以CEANF和CEANR為引物擴增CMV至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段克隆至TP質粒中的靠近5’端的絕緣子與多克隆位點之間，得到pBNW-TPl載體； 所述的 CEANF 為gagcagatct ataacttcgt atagcataca ttatacgaagttattgcgttatcccctgat tctgt ； 所述的 CEANR 為tatcgtcgac ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaagttatcgcttacaatttacgc cttaag ； 4)擴增PTK啟動子，并將其克隆至pEGFP-Cl質粒中，得到pPTK質粒； 5)擴增如SEQ.ID. NO. 5所示的Pbase編碼基因，并將其克隆至pPTK質粒中PTK啟動子的下游，得到質粒pPTK-Pbase ； 6)以pPTK-PBase為模板，擴增PTK至PloyA之間的片段，并將所擴增的片段通過TA克隆的方式連接克隆至pMD18-Tsimple載體中，得到pBNW_TD2載體； 所構建的載體pBNW-TPl和pBNW-TD2共同組成通用型PiggyBac轉座子轉基因載體。
10.權利要求I所述的通用型PiggyBac轉座子轉基因載體在外源基因轉染細胞中的應用將外源基因克隆至供體載體的多克隆位點中，然后再與輔助載體混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆。
全文摘要
本發明公開了一種通用型PiggyBac轉座子轉基因載體及其制備方法，包括供體載體和輔助載體；所述的供體載體包括PiggyBac轉座子5’重復末端序列5’TR和3’重復末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之間設有兩個絕緣子，在絕緣子序列之間設有多克隆位點；所述的輔助載體包括PiggyBac轉座酶編碼基因Pbase，在Pbase的上游設有啟動子，在其下游設有PloyA。將外源基因克隆至供體載體的多克隆位點中，然后再與輔助載體混合轉染細胞，穩定篩選細胞單克隆，通過PB轉座子元件將外源基因特異性整合到基因組中的TTAA位點。
文檔編號C12N15/85GK102943092SQ201210472708
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者胡廣東, 張涌, 王靜, 余源, 高元鵬 申請人:西北農林科技大學, 楊凌科元克隆股份有限公司