白化病模型豬的重構卵及其構建方法和模型豬的構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種白化病模型豬的重構卵及其構建方法和模型豬的構建方法，該重構卵的構建方法通過敲除酪氨酸酶基因獲得了白化小型豬的重構卵，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術與體細胞核移植技術結合，證明該方法用于構建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可為人類白化疾病研究提供一種可靠的動物模型，且能應用于毒性及過敏反應的檢測等多方面，有望成為類似白化小鼠的一種標準化實驗動物。
【專利說明】白化病模型豬的重構卵及其構建方法和模型豬的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，尤其是涉及一種白化病模型豬的重構卵及其構建方法 和模型豬的構建方法。
【背景技術】
[0002] 人類疾病的研究和治療離不開實驗動物模型。嚙齒類動物在基因表達和各項生理 指標方面與人類差異較大，而非人靈長類動物雖是最接近于人類的實驗動物，但價格昂貴， 且存在倫理方面的障礙。豬在體型大小、生理條件、器官發育和疾病發展等方面與人類相 似，因此，豬被認為是一種合適的實驗動物模型。基因修飾豬模型有望在人類疾病發病機理 研究、治療策略研究中發揮重要的作用。目前制作基因修飾動物的方法中只有胚胎細胞嵌 合法和轉基因克隆法能夠實現哺乳動物的基因打靶。通過基因修飾胚胎干細胞和嵌合體 技術相對容易獲得基因修飾小鼠，但迄今還沒有辦法獲得具有生殖系嵌合能力的豬胚胎細 胞，因而基因修飾豬制備要比小鼠困難很多。
[0003] 研究人員一直致力于開發新方法，實現高效率的基因定點修飾。最近興起的鋅指 技術（Zinc Finger Nucleases, ZFNs)和 TALENs (TRNAscription activator-like (TAL) effector nucleases)技術為基因打祀技術創造了新的途徑。有研究顯不利用ZFNs 技術可使豬體細胞中基因打靶效率從KT6提高到4 %以上（Yang D，Yang H，Li W，et al.Production of PPAR-gamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear tRNAsfer cloning. Cell Research，2011，21 (6) :979-82.)。利用 TALENs技術 也成功高效率地獲得了大鼠、斑馬魚、爪蟾、小鼠、兔等多種基因打靶動物。ZFNs和TALENs 技術極大地提高了基因打靶效率，但ZFNs和TALENs技術設計和構建組裝仍需要有前后序 列特異的要求，經大量的優化條件以獲得特定的基因打靶，在的獲得性、靈活性、費用上均 受至丨J限制（Juillerat，A.，Dubois，G.，Valton，J.，et al. Comprehensive analysis of the specificity of tRNAscription activator-like effector nucleases. Nucleic Acids Res.，2014,42,5390 - 5402.)。
[0004] CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) /CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技術主要基于細菌的一種 獲得性免疫系統改造而成。該系統由兩部分組成：一是哺乳動物密碼子優化版本的Cas9 蛋白，其帶有一個核定位信號，以確保在哺乳動物細胞的核中表達；二是引導核糖核酸 (Single-guide RNA，gRNAs)指引Cas9的蛋白質進行序列特異性地切割目標DNA。較ZFNs 或TALENS而言，CRISPR/Cas9系統具有可擴展性和復用性、能同時作用于多個靶位點（Wang H,Yang HjShivalila C S,et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell,2013,153:910 -918)等優點，被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造分子工具（Mussolino C， Cathomen T.RNA guides genome engineering. NatBiotechnol,2013,31 (3):208_209)。利 用CRISPR/Cas9已獲得多種基因打靶動物，如大鼠、小鼠、兔子、猴子等，但均是通過注射 Cas9 mRNA和gRM mRNA到一細胞胚胎的方法獲得的，這種方法獲得的克隆動物多是帶有多 種突變類型的嵌合體，需進行多次交配和選擇才能得到單一突變基因型的動物。
[0005] 白化病是人和動物界的一種常見疾病。目前白化小鼠己成為生物醫藥研究中常用 的實驗動物，在燒傷、皮膚毒性、過敏檢測等研究中使用較多，但是迄今為止仍未有基因修 飾型白化豬的報道。目前野生型小型豬的皮膚和毛發多為黑色或花色，在研究中不利于觀 察，而野生型白色豬中多見于商品肉用大型豬種，體型大不利于實驗操作，不適合做實驗動 物。
【發明內容】
[0006] 基于此，有必要提供一種白化病模型豬的重構卵及其構建方法和模型豬的構建方 法。
[0007] -種白化病模型豬的重構卵的構建方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟一：針對豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補鏈上滿足 G (N) 19NGG序列模式的序列部分分別設計gRNA的識別序列，分別記為第一 gRNA識別序列和 第二gRNA識別序列，其中，所述第一 gRNA識別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 一致，所述第二gRNA識別序列與所述第一外顯子的互補鏈上序列G(N)19 -致，N為A、T、C 或G，下標19表示N的個數；
[0009] 步驟二：分別對所述第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列，以構 建含有所述第一 gRNA識別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識別序列的第二雙鏈DNA ;
[0010] 步驟三：分別根據所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設計gRNA表達載體，記 為第一 gRNA載體和第二gRNA載體，其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所 述第二gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA ;
[0011] 步驟四：將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表 達載體轉染進微型豬胎兒成纖維細胞中，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽性克隆細胞；
[0012] 步驟五：將所述陽性克隆細胞注入母豬的去核卵母細胞中，形成重構卵。
[0013] 在其中一個實施例中，所述步驟一中，所述豬物種的酪氨酸酶基因的序列為NCBI 數據庫中基因編號為407745所示的序列；所述第一外顯子的正鏈上滿足G (N) 19NGG序列模 式的序列如SEQ ID No. 1所示，所述第一外顯子的互補鏈上滿足G(N)19NGG序列模式的序列 如SEQ ID No. 2所示；所述第一 gRNA識別序列如SEQ ID No. 3所示，所述第二gRNA識別序 列如SEQ ID No. 4所示。
[0014] 在其中一個實施例中，所述步驟二具體包括如下步驟：
[0015] 分別對所述第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列；
[0016] 在所述第一 gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示 的序列片段，并在所述第一 gRNA識別序列的互補序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如 SEQID No. 8所示的序列片段，將加有粘性末端的第一 gRNA識別序列及加有粘性末端的互 補序列進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ;
[0017] 在所述第二gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示 的序列片段，并在所述第二gRNA識別序列的互補序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如 SEQID No. 10所示的序列片段，將加有粘性末端的第二gRNA識別序列及加有粘性末端的互 補序列進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
[0018] 在其中一個實施例中，所述步驟三具體包括如下步驟：
[0019] 在gRNA-GFP-Tl質粒載體中引入兩個BbsI酶切位點，得到中間體質粒；
[0020] 對所述中間體質粒使用限制性內切酶BbsI酶切，并將帶有粘性末端的所述第一 雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA對應連接到酶切后的中間體質粒上，分別得到所述第一 gRNA 載體和所述第二gRNA載體。
[0021] 在其中一個實施例中，所述步驟四中，在將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載 體及含有Cas9切口酶基因的表達載體轉染進微型豬胎兒成纖維細胞之前，還包括分別對 所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體經轉化處理后 擴大培養，再提取所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達 載體的步驟。
[0022] 在其中一個實施例中，所述重構卵的構建方法還包括對得到的重構卵進行融合和 激活的步驟，具體如下：
[0023] 將所述重構卵從去核操作液中轉至胚胎培養液中待融合與激活；
[0024] 將所述重構卵轉移至融合液激活液進行平衡，將平衡好的重構卵移入融合容器 內，輕輕撥動重構卵，使卵母細胞與注入的細胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間 隔為1mm，然后進行電脈沖刺激，電融合參數為：120volts/mm、30 μ s、2次；
[0025] 電脈沖刺激后將重構卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構卵。
[0026] -種采用上述任一實施例所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法構建得到的 重構卵。
[0027] -種白化病模型豬的構建方法，包括如下步驟：
[0028] 按照上述任一實施例所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法構建重構卵；
[0029] 對所述重構卵進行細胞融合和激活，得到激活的重構卵；
[0030] 將所述激活的重構卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將所述激活的重構卵在體外 或體內進行培養，形成重構胚，然后再將所述重構胚移植到代孕母豬的子宮內；
[0031] 飼養所述代孕母豬，產生白化病模型豬。
[0032] 在其中一個實施例中，所述對所述重構卵進行細胞融合和激活，得到激活的重構 卵，具體包括如下步驟：
[0033] 將所述重構卵從去核操作液中轉至胚胎培養液中待融合與激活；
[0034] 將所述重構卵轉移至融合液激活液進行平衡，將平衡好的重構卵移入融合容器 內，輕輕撥動重構卵，使卵母細胞與注入的細胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間 隔為1mm，然后進行電脈沖刺激，電融合參數為：120 volts/mm、30 μ s、2次；
[0035] 電脈沖刺激后將重構卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構卵。
[0036] 上述白化病模型豬的重構卵及模型豬的構建方法，通過敲除酪氨酸酶基因 （TYR 基因）獲得了白化小型豬，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術與體細胞核移植技術結合，證 明該方法用于構建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可 為人類白化疾病研究提供一種可靠的動物模型，且能應用于毒性及過敏反應的檢測等多方 面，有望成為類似白化小鼠的一種標準化實驗動物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1為一實施方式的白化病模型豬的重構卵的構建方法的流程示意圖；
[0038] 圖2為白化病模型豬與黑豬的外形及眼睛對比圖；
[0039] 圖3為另一視角的白化病模型豬與黑豬的外形對比圖；
[0040] 圖4為白化病模型豬與黑豬的皮膚基層對比圖，其中A表示黑豬，B表示白化病模 型豬；
[0041] 圖5為白化病模型豬與黑豬的虹膜組織對比圖，其中C表示黑豬，D表示白化病模 型豬。
【具體實施方式】
[0042] 下面主要結合附圖及具體實施例對白化病模型豬的重構卵及其構建方法及模型 豬的構建方法作進一步詳細的說明。
[0043] -實施方式的白化病模型豬的構建方法包括構建模型豬的重構卵、對該重構卵進 行激活以及將激活的重構卵導入代孕母豬體內進行生長的過程。
[0044] 如圖1所示，本實施方式的白化病模型豬的重構卵的構建方法包括如下步驟：
[0045] 步驟S110,針對豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補鏈上滿足 G (N) 19NGG序列模式的序列部分分別設計gRNA的識別序列，分別記為第一 gRNA識別序列和 第二gRNA識別序列。其中，所述第一 gRNA識別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 一致，所述第二gRNA識別序列與所述第一外顯子的互補鏈上序列G(N)19 -致，N為A、T、C 或G，下標19表示N的個數。
[0046] 上述豬物種優選但不限于山豬（學名：Sus scrofa)，其酪氨酸酶基因的序列為 NCBI數據庫中基因編號為407745 (Gene ID :407745)所示的序列。本實施方式所用的第一 外顯子的正鏈的部分序列（5 '-GCACCCCTGGGACCTCAGTTCCCCTTCACCGGGGTGGATGAACGGGAGTCT TGGCCCT-3'）如SEQ ID No. 1所示，第一外顯子的互補鏈的部分序列（3'-CGTGGGGACCCTGGA GTCAAGGGGAAGTGGCCCCACCTACTTGCCCTCAGAACCGGGA-5'）如SEQIDNo·2所示。針對該正鏈 及互補鏈的部分序列設計的第一 gRNA識別序列（5' -GGGTGGATGA ACGGGAGTCT-3'）如SEQ ID No. 3 所示，第二 gRNA 識別序列（5' -GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA-3'）如 SEQ ID No. 4 所 示。可理解，在其他實施方式中，第一 sgRNA識別序列及第二gRNA識別序列還可以為其他 序列結構，只要該第一外顯子的正鏈上及互補鏈上存在滿足G(N)19NGG的序列模式的序列 就可對應設計第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列。
[0047] 步驟S120 :分別對第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列，以構 建含有第一 gRNA識別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識別序列的第二雙鏈DNA。
[0048] 具體在本實施方式中，第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的構建過程包括如下步驟：
[0049] 分別對所述第一 gRNA識別序列（GGGTGGATGA ACGGGAGTCT)和第二gRNA識別序列 (GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA)設計互補序列；
[0050] 在所述第一 gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示 的序列片段（CACCGGGTGG ATGAACGGGA GTCT)，并在所述弟一 gRNA識別序列的互補序列的 5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No. 8所示的序列片段（AAACAGACTCCCGTTCATCC ACCC)，將加有粘性末端的第一 gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列進行退火處理， 得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ;
[0051] 在所述第二gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示 的序列片段（CACCGAAGGG GAACTGAGGT CCCA)，并在所述第二gRNA識別序列的互補序列的 5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No. 10所示的序列片段（AAACTGGGACCTCAGTTCCC CTTC)，將加有粘性末端的第二gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列進行退火處理， 得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
[0052] 形成的第一雙鏈DNA與第二雙鏈DNA均具有"CACC"和"AAAC"粘性末端，該粘性 末端可用于連接至相應的載體上。
[0053] 該加上粘性末端的過程可以使用但不限于全基因合成的方法或設計合適的引物 經PCR擴增得到。
[0054] 步驟S130 :分別根據第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA設計gRNA表達載體，記為第一 gRNA載體和第二gRNA載體。其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第二 gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA。
[0055] 本步驟是將第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA對應連接到含有gRNA編碼序列的質粒 中，如gRNA-GFP-Tl質粒載體，該過程具體包括如下步驟：在含有gRNA編碼序列的質粒載體 中引入相應的酶切位點，如BbsI酶切位點，得到中間體質粒，再將第一雙鏈DNA和第二雙鏈 DNA通過引入的酶切位點（即粘性末端）連接到酶切后的中間體質粒的對應位置得到所需 的質粒。其中，酶切位點可以但不限于BbsI酶切位點，當酶切位點為BbsI酶切位點時，該 第一雙鏈DNA與該第二雙鏈DNA均連接有上述"CACC"和"AAAC"粘性末端，且克隆載體經 BbsI酶切處理。
[0056] 步驟S140 :將第一 gRNA載體、第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體 轉染進微型豬胎兒成纖維細胞中，篩選出酪氨酸基因敲除的陽性克隆細胞。
[0057] 篩選出酪氨酸基因敲除的陽性克隆細胞包括如下步驟：
[0058] 對部分培養的克隆細胞進行裂解，提取裂解液；
[0059] 對裂解液進行PCR處理，其中，PCR的引物序列分別如SEQ ID No. 5及SEQ ID No. 6 所示，PCR條件為：95°C預變性5分鐘，94°C變形20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共 35個循環；
[0060] 取PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選陽性克隆細胞。
[0061] 此外，在本實施方式中，在將第一 gRNA載體、第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基 因的表達載體轉染進豬胎兒成纖維細胞之前，還包括分別對第一 gRNA載體、第二gRNA載體 及含有Cas9切口酶基因的表達載體經轉化處理后擴大培養，再分別提取第一 gRNA載體、第 二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體的步驟。
[0062] 步驟S150 :將陽性克隆細胞注入母豬的去核卵母細胞中，形成重構卵。
[0063] 具體在本實施方式中，可以采用如下步驟進行：
[0064] 將陽性克隆細胞使用胰蛋白酶進行消化之后進行離心處理，棄上清，重懸細胞；
[0065] 在去核操作液中對卵母細胞用盲吸法去核后，吸取上步重懸的細胞直接注射于去 核的卵母細胞的卵周隙中，輕輕擠壓卵母細胞，使卵母細胞的細胞膜與注入的細胞的細胞 膜接觸。
[0066] 步驟S160,對得到的重構卵進行融合和激活。
[0067] 具體在本實施方式中，可通過如下步驟進行：
[0068] 將重構卵從去核操作液中轉至胚胎培養液中待融合與激活；
[0069] 將重構卵轉移至融合激活液進行平衡，并將平衡好的重構卵移入融合容器內，輕 輕撥動重構卵，使卵母細胞與注入的細胞的接觸面平行于兩條電極，再進行電脈沖刺激融 合；
[0070] 電脈沖刺激后將重構卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構卵。
[0071] 本實施方式所述的將激活的重構卵導入代孕母豬體內進行生長的過程，可以是 將激活的重構卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將激活的重構卵在體外或體內進行培養， 形成重構胚，然后再將重構胚移植到代孕母豬的子宮內，再飼養代孕母豬，產生白化病模型 豬。
[0072] 該白化病模型豬的重構卵及模型豬的構建方法，通過敲除酪氨酸酶基因（TYR基 因）獲得了白化小型豬，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術與體細胞核移植技術結合，證明該 方法用于構建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可為人 類白化疾病研究提供一種可靠的動物模型，且能應用于毒性及過敏反應的檢測等多方面， 有望成為類似白化小鼠的一種標準化實驗動物。
[0073] 以下為具體實施例部分：
[0074] 以下試劑，除非特別說明，均購自Sigma公司，括弧后面為對應的中文名稱和/或 商品目錄號。
[0075] 本實施例主要包括以下步驟：（1)CRISPR/Cas9打靶系統的構建；（2)細胞轉染與 篩選，以及TYR基因敲除細胞克隆的獲得；（3)體細胞核移植；（4)基因修飾豬的基因型和 表型鑒定。
[0076] (I) CRISPR/Cas9打靶系統的構建：
[0077] 根據NCBI數據庫中豬物種Sus scrofa的TYR基因的序列（Gene ID :407745)，在 第一外顯子序列上按照G(N)19NGG原則，分別對正鏈（部分序列如SEQ ID No. 1所示）和互 補鏈（部分序列如SEQ ID No. 2所示）設計一 gRNA的識別序列，分別記為第一 gRNA識別 序列（如SEQ ID No. 3所示）和第二gRNA識別序列（如SEQ ID No. 4所示）。
[0078] 提取用于待轉染細胞的基因組，在gRNA的識別序列識別的靶序列兩端設計一對 引物，其中上游引物序列為：5'-CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3'（如SEQ ID No. 5所示），下 游引物序列為：5' -TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3'（如SEQ ID No. 6所示），PCR擴增含有靶序 列的DNA片段，片段大小為388bp。PCR擴增條件為：95°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C 退火30s，72°C延伸30s，35個循環。擴增的靶序列片段經測序后與GenBank上的序列比對， 確定序列正確。
[0079] 在質粒gRNA-GFP-Tl (購自Addgene公司，產品目錄號為41819)質粒引入2個 Bbs I酶切位點，得到U6-gRNA克隆載體。分別對第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列 設計互補序列，并在第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列及對應的互補序列兩端加上 粘性末端，再退火處理形成第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA。第一雙鏈DNA與第二雙鏈DNA均 包含有粘性末端"CACC"和"AAAC"，其中，第一雙鏈DNA中兩條鏈的序列分別如SEQID No. 7 和SEQ ID No. 8所示，第二雙鏈DNA中兩條鏈的序列分別如SEQ ID No. 9和SEQ IDNo. 10 所示。
[0080] 分別將第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA對應連接到經BbsI酶切的U6-gRNA克隆載 體中，得到第一 gRNA載體和第二gRNA載體，經測序確定序列連接正確。
[0081] (2)細胞轉染與篩選：
[0082] 將含有Cas9基因的質粒載體（Cas9_nickase，購自Addgene公司，產品目錄號為 41816)以及得到的第一 gRNA載體和第二gRNA載體經轉化后擴大培養，大提質粒，三種質粒 各制備20 μ g。
[0083] 轉染前一天復蘇版納微型豬胎兒成纖維細胞（來源于版納微型豬37日齡胎兒）， 在IOcm細胞培養皿中加入IOmL 15% FBS DMEM培養基，置于37°C培養箱培養；培養24小 時后電轉，轉入Cas9質粒載體、第一 gRNA載體和第二gRNA載體各20 μ g，電轉參數：電壓 230V電容500 μ F，儀器為美國伯樂電穿孔系統（Bio-Rad Gene Pulser Xcell)。
[0084] 電轉染后細胞分成25個IOcm大培養皿培養；隔天換液，換成含G418(濃度為 200 μ g/mL)的15% FBS DMEM培養基培養；隔2天換液，約10天后克隆生長，用記號筆在大 培養皿底部畫出克隆，在超凈臺中去掉培養基后用PBS溶液洗一次，用克隆環圈住記號筆 畫出的克隆，加入50-100 μ 1 0. 05 %胰酶消化5-8min，加培養基終止，將克隆環中的細胞 盡量全部轉移到48孔板中，并用培養基洗兩次。傳代時取1/10的細胞用于鑒定。
[0085] 離心收集取出用于鑒定的單克隆細胞，加15μ I NP40裂解液（含0.45%NP-40和 〇. 6%蛋白酶K)，依次在56°C裂解Ih、在95°C裂解IOmin，得到的裂解液于-20°C保存備用。 [0086] 對得到的裂解液利用上述設計的引物對，其中上游引物序列為： 5' -CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3'（如 SEQ ID No. 5 所示），下游引物序列為： 5' -TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3'（如 SEQ ID No. 6 所示），采用 PCR 程序進行擴增，PCR 條件 為：95°C預變性 5min ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環。取 3μ I PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。得到單一明亮一條帶的PCR產物以正向引物送深 圳華大基因測序。測序結果與原序列比對，部分測序結果為后雙峰圖譜的PCR產物，回收純 化后與PMD18T載體經TA克隆連接，轉化提質粒后用通用引物Μ13測序，得到序列。部分陽 性克隆的靶位點序列測序結果如表1所示。
[0087] 表 1
[0088]
【權利要求】
1. 一種白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一：針對豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補鏈上滿足g(n)19ngg 序列模式的序列部分分別設計gRNA的識別序列，分別記為第一 gRNA識別序列和第二gRNA 識別序列，其中，所述第一 gRNA識別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 -致，所述 第二gRNA識別序列與所述第一外顯子的互補鏈上序列G (N) 19 -致，N為A、T、C或G，下標 19表示N的個數； 步驟二：分別對所述第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列，以構建含 有所述第一 gRNA識別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識別序列的第二雙鏈DNA ; 步驟三：分別根據所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設計gRNA表達載體，記為第 一 gRNA載體和第二gRNA載體，其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第 二gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA ; 步驟四：將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載 體轉染進微型豬胎兒成纖維細胞中，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽性克隆細胞； 步驟五：將所述陽性克隆細胞注入母豬的去核卵母細胞中，形成重構卵。
2. 如權利要求1所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟一 中，所述豬物種的酪氨酸酶基因的序列為NCBI數據庫中基因編號為407745所示的序列；所 述第一外顯子的正鏈上滿足G(N) 19NGG序列模式的序列如SEQ ID No. 1所示，所述第一外顯 子的互補鏈上滿足G(N) 19NGG序列模式的序列如SEQ ID No. 2所示；所述第一 gRNA識別序 列如SEQ ID No. 3所示，所述第二gRNA識別序列如SEQ ID No. 4所示。
3. 如權利要求2所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟二 具體包括如下步驟： 分別對所述第一 gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列； 在所述第一 gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示的序 列片段，并在所述第一 gRNA識別序列的互補序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQID No. 8所示的序列片段，將加有粘性末端的第一 gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列 進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ; 在所述第二gRNA識別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示的序 列片段，并在所述第二gRNA識別序列的互補序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQID No. 10所示的序列片段，將加有粘性末端的第二gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列 進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
4. 如權利要求3所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟三 具體包括如下步驟： 在gRNA-GFP-Tl質粒載體中引入兩個Bbsl酶切位點，得到中間體質粒； 對所述中間體質粒使用限制性內切酶Bbsl酶切，并將帶有粘性末端的所述第一雙鏈 DNA和所述第二雙鏈DNA對應連接到酶切后的中間體質粒上，分別得到所述第一 gRNA載體 和所述第二gRNA載體。
5. 如權利要求4所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟四 中，在將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體轉染 進微型豬胎兒成纖維細胞之前，還包括分別對所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含 有Cas9切口酶基因的表達載體經轉化處理后擴大培養，再提取所述第一 gRNA載體、所述第 二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體的步驟。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于， 還包括對得到的重構卵進行融合和激活的步驟，具體如下： 將所述重構卵從去核操作液中轉至胚胎培養液中待融合與激活； 將所述重構卵轉移至融合液激活液進行平衡，將平衡好的重構卵移入融合容器內，輕 輕撥動重構卵，使卵母細胞與注入的細胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間隔為 1_，然后進行電脈沖刺激，電融合參數為：120 volts/mm、30y s、2次； 電脈沖刺激后將重構卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構卵。
7. -種如權利要求1-6中任一項所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法構建得到 的重構卵。
8. -種白化病模型豬的構建方法，其特征在于，包括如下步驟： 按照權利要求1-5中任一項所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法構建重構卵； 對所述重構卵進行細胞融合和激活，得到激活的重構卵； 將所述激活的重構卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將所述激活的重構卵在體外或體 內進行培養，形成重構胚，然后再將所述重構胚移植到代孕母豬的子宮內； 飼養所述代孕母豬，產生白化病模型豬。
9. 如權利要求8所述的白化病模型豬的構建方法，其特征在于，所述對所述重構卵進 行細胞融合和激活，得到激活的重構卵，具體包括如下步驟： 將所述重構卵從去核操作液中轉至胚胎培養液中待融合與激活； 將所述重構卵轉移至融合液激活液進行平衡，將平衡好的重構卵移入融合容器內，輕 輕撥動重構卵，使卵母細胞與注入的細胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間隔為 1mm，然后進行電脈沖刺激，電融合參數為：120volts/mm、30 μ s、2次； 電脈沖刺激后將重構卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構卵。
【文檔編號】C12N15/85GK104263754SQ201410438927
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】賴良學, 信吉閣, 楊化強, 鄒慶劍, 樊娜娜 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院