一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶D478N的制作方法
【專利摘要】一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶D478N，屬于酶的基因工程【技術領域】。本發明公開了由來源于微生物Alicyclobacillushesperidum的L-阿拉伯糖異構酶（簡稱Alhe-LAI酶）作為親本，利用基因突變技術，將其478位的天冬氨酸Asp替換為天冬酰胺Asn，獲得單突變體酶D478N；酶反應的最適pH由原來的7.0降至6.0；在酸性條件下，酶反應的底物D-半乳糖轉化為D-塔格糖的平衡轉化率由15%提高至20%；同時突變體酶D478N的催化活性提高，更適于產物D-塔格糖的生成，具有重要的工業應用價值。
【專利說明】一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶的 突變體酶D478N
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶（Alhe-LAI)的 突變體酶D478N，屬于酶的基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002] D-塔格糖是近年發現的一種具有特殊保健功能的功能性甜味劑。D-塔格糖屬于 天然稀有糖的一種，在許多食品中都發現少量存在，如高溫滅菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶 制品等。2000年美國食品與藥物管理局（FDA)確定D-塔格糖為普遍公認安全食品（GRAS)， 并正式批準作為甜味劑用于食品飲料業以及醫藥制劑中；隨后聯合國糧農組織和世界衛生 組織聯合食品添加劑委員會（JECFA)第57次會議批準D-塔格糖作為食品添加劑；歐盟也 于2003年批準D-塔格糖在歐洲上市。
[0003] 目前，國內對于D-塔格糖生產的研究還處于起步階段，國外對其研究已較為深 入，生產方法主要有兩種：化學法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化學法生產的。 由于一方面化學法生產存在許多不利因素，如化學污染物多，堿性條件下異構化反應副產 物多，分離困難等；另一方面由于消費者消費觀念的轉變，天然食品的需求日益增長，因此 近年來對D-塔格糖生產的研究集中在生物法上。研究發現L-阿拉伯糖異構酶可以催化 D-半乳糖轉化為D-塔格糖，是目前生物法生產D-塔格糖最為有效的途徑。D-半乳糖與 D-塔格糖之間異構反應的平衡受溫度影響很大，較高溫條件下（60°C以上）更有利于D-塔 格糖的生成，因此耐熱性的L-阿拉伯糖異構酶將具有更好的應用前景。
[0004] 目前，已有很多菌屬被鑒定具有L-阿拉伯糖異構酶的基因（araA)，例如 Mycobacterium smegmatis (J Bacteriol, 1978, 133 (1) :413 - 414) > Escherichia coli (World J Microbiol Biotechnol, 2003, 19 (1) : 47 - 51) > i?. stearothermophilus US100 (Biochim Biophys Acta, 2006, 1760: \9\-\99) ^ Lactobacillus sakei 23K (Bioresource Technology 101, 2010, 9171 - 9177)及 Bifidobacterium longum (Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36:489 - 497)等菌屬均具有L_阿拉伯糖異構酶的基 因，被鑒定出來具有表達L-阿拉伯糖異構酶的功能。近年來，對于L-阿拉伯糖異構酶的研 究熱點集中在嗜熱及耐酸微生物。因為溫度和酸性環境是催化反應的一個重要因素，高溫 及酸性環境利于D-塔格糖的合成，并減少副產物的生成。因此，為獲得更適合的生物催化 齊U，通過定點突變的方法，對來自嗜熱菌的Alhe-LAI酶進行分子改造，進一步提高其催化 活性，并降低了酶反應的最適PH，以期得到酶學性質更適合工業應用的Alhe-LAI酶。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶的突 變體酶，對D-塔格糖的生產有重要的意義。
[0006] 本發明的技術方案，一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶 Alhe-LAI的突變體酶D478N，將來源于的L-阿拉伯糖異構 酶進行突變得到單突變體酶；將原來Alhe-LAI酶基因中第478位的天冬氨酸Asp替換為天 冬酰胺Asn，獲得單突變體酶，命名為D478N。
[0007] 與野生型酶Alhe-LAI相比，所述Alhe-LAI的突變體酶D478N反應的最適pH由原 來的7. 0降低至6. 0 ;在酸性條件下，酶反應的底物D-半乳糖平衡轉化率由15%提高至20% ; 突變體酶D478N的催化活性提高。
[0008] 一種重組表達質粒pET-22b(+)-D478N，其中含有所述的Alhe-LAI的突變體酶 D478N基因。
[0009] 一種表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)，其被含有Alhe-LAI的突變體酶D478N基因的 重組表達質粒pET-22b (+) -D478N轉化。
[0010] 所述來源于微生物的 Alhe-LAI 基因在GenBank 的 編號為NZ_AKZN01000011. 1，基因全長1494個核苷酸，見序列表中SEQ ID No:l;編碼498 個氨基酸，見序列表中SEQ ID No:2。
[0011] 所述Alhe-LAI的突變體酶是將其478位氨基酸天冬氨酸Asp突變為天冬酰胺 Asn，命名為D478N，見序列表中SEQ ID No:4。D478N的核苷酸序列見SEQ ID No:3。
[0012] Alhe-LAI酶的突變體酶D478N的制備方法，其具體步驟為： (1) 在的Alhe-LAI酶模擬結構的基礎上確定突變位 占. (2) 設計定點突變的突變引物，以攜帶Alhe-LAI酶基因的載體pET-22b ( + )-Alhe-LAI 為模板進行定點突變構建突變質粒pET-22b (+) -D478N ; 突變引物如下所示，下劃線為突變點： 上游外側引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外側引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突變引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下劃線為突變堿基， 反向突變引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下劃線為突變堿基； (3) 將突變質粒pET-22b (+) -D478N轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，挑選驗證后的陽性 單克隆進行發酵培養； (4) 離心菌體，重懸后超聲破碎，陰離子交換柱純化得到突變體酶D478N。
[0013] 突變體酶D478N的應用：應用于化學、食品和制藥領域，最適反應pH為6.0,使得 底物D-半乳糖的平衡轉化率提高。
[0014] 本發明的有益效果：本發明提供一種催化活性提高且最適pH降低的Alhe-LAI酶 的突變體酶D478N，其最適反應pH為6. 0,明顯低于野生型Alhe-LAI酶的最適反應pH7. 0 ; 在酸性條件下，底物D-半乳糖的平衡轉化率明顯提高，較適于D-塔格糖的工業化生產，同 時突變體酶D478N的催化活性有所提高，在化學、食品和制藥領域中具有重要的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1突變體酶D478N和野生型酶Alhe-LAI，pH對酶活影響對比示意圖。
[0016] 圖2突變體酶D478N和野生型酶Alhe-LAI對底物D-半乳糖的轉化率對比示意圖。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1 :Alhe-LAI酶耐酸性突變體制備方法 利用快速PCR定點突變的方法構建pET-22b (+) -D478N突變質粒； pET-22b(+)-D478N突變質粒的構建：以pET-22b(+)-Alhe-LAI質粒為模板，經PCR1， PCR2及PCR3，引入D478N定點突變，測序驗證結果表明除了所需突變位點外，沒有出現隨機 突變，因此突變質粒pET-22b (+)-D478N構建成功。
[0018] 突變引物如下所示：（下劃線為突變點） 上游外側引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外側引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突變引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下劃線為突變堿基， 反向突變引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下劃線為突變堿基， PCR 1 :反應體系的組成： 以帶有L-阿拉伯糖異構酶目的基因的克隆載體pET-22b ( + ) -Alhe-LAI為模版。
【權利要求】
1. 一種催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶Alhe-LAI的突變體酶 D478N，其特征在于：將來源于的L-阿拉伯糖異構酶進行突 變得到單突變體酶；即將原來Alhe-LAI酶基因中的第478位天冬氨酸Asp替換為天冬酰胺 Asn，獲得單突變體酶，命名為D478N。
2. 權利要求1所述催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶Alhe-LAI的突 變體酶D478N的制備方法，其特征在于步驟為： (1) 在的Alhe-LAI酶模擬結構的基礎上確定突變位 占 . ^ \\\ ? (2) 設計定點突變的突變引物，以攜帶Alhe-LAI酶基因的載體pET-22b ( + )-Alhe-LAI 為模板進行定點突變構建突變質粒pET-22b (+) -D478N ; 突變引物如下所示，下劃線為突變點： 上游外側引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外側引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突變引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下劃線為突變堿基， 反向突變引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下劃線為突變堿基； (3) 將突變質粒pET-22b (+) -D478N轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，挑選驗證后的陽性 單克隆進行發酵培養； (4) 離心菌體，重懸后超聲破碎，陰離子交換柱純化得到突變體酶D478N。
3. 根據權利要求2所述催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶Alhe-LAI 的突變體酶D478N的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述突變質粒pET-22b (+)-D478N含 有Alhe-LAI的突變體酶D478N基因。
4. 權利要求1所述催化活性提高且最適pH降低的L-阿拉伯糖異構酶Alhe-LAI的突 變體酶D478N的應用，其特征在于：應用于化學、食品和制藥領域，最適反應pH為6. 0,使得 底物D-半乳糖的平衡轉化率提高。
【文檔編號】C12N15/70GK104152430SQ201410438619
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】沐萬孟, 江波, 范晨, 張濤 申請人:江南大學