一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法。該煙草角斑病菌的分子鑒定引物如序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:2所示，其中，序列SEQIDNO:1為鑒定煙草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO:2為鑒定煙草角斑病菌的下游引物。本發明所述煙草角斑病菌分子鑒定引物可以特異性鑒定煙草角斑病病菌。此外，本發明還提供了可靠、特異性強、靈敏度高的煙草角斑病菌快速分子鑒定的方法。
【專利說明】一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法，屬于植物病菌檢測領 域。
【背景技術】
[0002] 煙草是我國重要的經濟作物之一。煙草角斑病（Pseudomonas syringae pv.angulata)是煙草主要的細菌性病害，在我國北方煙區發生嚴重，每年均造成一定程度 的危害和經濟損失。
[0003] 傳統細菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，工作 繁瑣，時間長，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢 測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最 佳時期，而免疫血清學鑒定方法特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽 性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。目前，我國官方機構進行細菌鑒定過程中主要 采用傳統的分類學鑒定以及生物學鑒定（16S rRNA序列測定分析）相結合的方式，鑒定時 間至少需要1個月以上，對于農業生產過程中所面臨的需要及時快速鑒定的病原菌，這些 方法存在明顯的不足。隨著生物技術在病害鑒定方面開發應用及病菌DNA數據在基因庫中 的不斷積累，使分子生物學方法鑒定細菌種類技術日趨完善和成熟。建立細菌的PCR特異 鑒定引物，利用細菌分離培養技術及PCR技術，可以在（1-2) d內對初期侵染的細菌進行鑒 定，從而指導煙農及時準確用藥，對保障我國煙葉生產具有重要的意義。
[0004] 對于煙草角斑病的分子鑒定方法，河南農業大學的蔣世君等2010年申請了中國 專利CN 101206193"快速檢測和鑒定煙草野火病菌和角斑病菌的方法"，該方法涉及的角斑 病菌的PCR鑒定引物設計于hrpZ基因，且同時擴增出煙草野火病菌，也就是說不能有效區 分野火病和角斑病或者其它丁香假單孢菌。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有技術中煙草角斑病菌的生物學檢測方法特異性差、靈敏 度低、周期長、血清學鑒定方法成本高并易造成假陽性等問題，提供煙草角斑病菌特異分子 鑒定引物以及可靠、特異性強、靈敏度高的煙草角斑病菌快速分子鑒定的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0007] 基于煙草角斑病的AvrPphE基因區域設計合成了煙草角斑病菌特異的PCR鑒定引 物，該引物可以特異鑒別煙草角斑病菌，煙草野火病菌、其它的丁香假單孢菌及煙草葉面分 離的其它細菌分離物均擴增不出特異的條帶。
[0008] 具體地，一組煙草角斑病菌的分子鑒定引物，如下：
【權利要求】
1. 一組煙草角斑病菌的分子鑒定引物，其特征在于，該引物如序列表SEQ ID NO :1至 SEQ ID NO :2所示，其中，序列SEQ ID NO: 1為鑒定煙草角斑病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2為鑒定煙草角斑病菌的下游引物。
2. -種煙草角斑病菌的鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 煙草角斑病菌分離培養； (2) PCR擴增；其中，PCR擴增時的引物為序列SEQ ID NO :1所示的用于鑒定煙草角斑 病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2所示的用于鑒定煙草角斑病菌的下游引物； (3) PCR擴增產物分離及結果判別。
3. 根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，煙草角斑病菌分離培養的具體步驟 為：用滅菌的剪刀將煙草角斑病疑似病葉病斑剪下，消毒后置于LB固體培養基中25°C培養 2-3天，收集病斑周圍長出的細菌菌落于無菌的LB液體培養基中，混勻后，吸取菌液涂LB固 體平板，25°C培養2-3天，挑取單菌落于LB液體培養基中，25°C培養，用于PCR檢測，或者直 接用滅菌牙簽蘸取單菌落用于PCR檢測。
4. 根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，PCR擴增產物分離及結果判別的具體 步驟為：將PCR擴增產物用1. 5%瓊脂糖電泳分離，于紫外分析儀中根據擴增產物的大小判 定結果。
【文檔編號】C12Q1/04GK104212896SQ201410445480
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】萬秀清, 喬嬋, 李若, 李麗杰, 王春軍, 元野, 賀國強, 顏培強, 李尊強, 郭思達, 孫宏偉, 焦玉生, 李恒全, 邱恩建, 劉德育, 陳榮平, 黃磊, 張海霞, 劉偉, 魏繼承 申請人:中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學研究所