用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的組合物，包括用于PCR擴增的引物-探針，所述引物-探針包括：SEQIDNO.1/2及SEQIDN0.3;以及，下述引物-探針組中的至少一組：SEQIDNO.4/5/6；SEQIDNO.7/8/9；SEQIDNO.10/1/12；SEQIDNO.13/14/15；SEQIDNO.16/17/18。采用上述組合物及檢測方法，可在對金黃色葡萄球菌進行菌屬鑒定的同時，可對其耐藥性基因進行有效的檢測分析，可以在一次檢測過程中同時完成金黃色葡萄球菌、MRSA、耐紅霉素金黃色葡萄球菌及耐氨基糖苷類抗生素的金黃色葡萄球菌的檢測及耐藥性分析，具有快速高通量等優點，滿足了食品中微生物檢測迅速準確的需求。
【專利說明】用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的組合物
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測【技術領域】，涉及食品及生物產品中耐藥性金黃色葡萄球菌所 攜帶的耐藥基因的檢測，尤其是針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐紅霉素金黃色葡萄球 菌、及耐氨基糖苷類抗生素的金黃色葡萄球菌耐藥基因的PCR檢測。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著動物飼養過程中抗生素的大量使用及獸藥的濫用，食品及動物中耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、耐氨 基糖苷類抗生素金黃色葡萄球菌、及耐紅霉素的金黃色葡萄球菌分離率不斷升高。食品中 金黃色葡萄球菌耐藥菌株，在感染人類時由于其耐藥性造成患者治療困難，難以治愈；其耐 藥因子也會在菌株間傳播擴散，造成耐藥菌株發生率不斷攀升，危害嚴重。耐藥性菌株從食 品（尤其是動物性食品）中經食物鏈傳播給人類，危害人體健康。
[0003] 我國對動物源性食品中細菌耐藥性研究起步較晚，特別"超級細菌"一mecA基因 陽性的金黃色葡萄球菌一MRSA金黃色葡萄球菌，具有傳染力強、多重耐藥性、致病毒力因子 多等特點，對除糖肽類抗生素外幾乎對其他抗生素均有不同程度的耐藥性，感染后治療困 難，對人類的危害大大增強。MRSA常表現為對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類等多種抗 生素同時耐藥。隨著氨基糖苷類抗生素被大量使用于抗金黃色葡萄球菌，其耐藥菌株逐漸 出現，我國耐氨基糖苷類金黃色葡萄球菌主要原因是產生氨基糖苷乙酰轉移酶（AAC)和氨 基糖苷磷酸轉移酶仏?11)，分別可由3 &(^-&?11〇基因編碼與&?11(3')-1118基因編碼。
[0004] 我國部分地區食源性金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率可達50%以上，erm機制 是金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥的主要原因，其中ermA、ermC為我國目前主要流行的耐藥 基因型。
[0005] 目前，國內對動物源性細菌耐藥性的方法主要依據臨床和實驗室標準化委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的《動物及其制品中細菌耐 藥性的測定紙片擴散法》SN/T1944-2007進行體外細菌培養藥敏性試驗，而缺少快速檢測食 品中金黃色葡萄球菌耐藥菌株的檢測方法。體外細菌培養藥敏性試驗操作繁瑣，不適于大 量樣品的檢測，且只能檢測菌株的耐藥表型，而對于耐藥基因尚未表達的耐藥菌株易造成 漏檢。而且完成藥敏鑒定的全自動生化鑒定儀價格昂貴，鑒定結果受操作人員的影響較大， 也易造成假性耐藥或假性敏感現象；并且該體外藥敏試驗的結果無法用于評估細菌耐藥性 對人體的危害。因此，本發明旨在建立針對耐藥基因的PCR檢測方法，希望能夠較為準確的 判斷耐藥菌株，避免被檢測菌株因體外藥敏試驗而產生的假性耐藥或假性敏感現象。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一，在于提供一種用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的組合物，包 括用于PCR擴增的引物-探針，所述引物-探針包括：
[0007] Nuc 引物對 SEQ ID NO. 1/2 及探針 SEQ ID NO. 3 ;以及，
[0008] 下述引物-探針組中的至少一組：
[0009] mecA 引物對 SEQ ID NO. 4/5 及探針 SEQ ID NO. 6 ;
[0010] erm A 引物對 SEQ ID NO. 7/8 及探針 SEQ ID NO. 9 ;
[0011] erm C 引物對 SEQ ID NO. 10/11 及探針 SEQ ID NO. 12 ;
[0012] aph(3，）-111 a 引物對 SEQ ID NO. 13/14 及探針 SEQ ID NO. 15 ;
[0013] aacA-aphD 引物對 SEQ ID NO. 16/17 及探針 SEQ ID NO. 18。
[0014]
【權利要求】
1. 用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的組合物，包括用于PCR擴增的引物-探針組，所述 引物-探針組包括： SEQ ID NO. 1/2 及 SEQ ID NO. 3 ;以及， 下述引物-探針組中的至少一組： SEQ ID NO. 4/5 及 SEQ ID NO. 6 ; SEQ ID NO. 7/8 及 SEQ ID NO. 9 ; SEQ ID NO. 10/11 及 SEQ ID NO. 12 ; SEQ ID NO. 13/14 及 SEQ ID NO. 15 ; SEQ ID NO. 16/17 及 SEQ ID NO. 18。
2. 權利要求1所述的組合物，包括下述引物-探針組： Nuc 引物對 SEQ ID NO. 1/2 及探針 SEQ ID NO. 3 ; mecA 引物對 SEQ ID NO. 4/5 及探針 SEQ ID NO. 6 ; erm A 引物對 SEQ ID NO. 7/8 及探針 SEQ ID NO. 9 ; erm C 引物對 SEQ ID NO. 10/11 及探針 SEQ ID NO. 12 ; aph(3，）-111 a 引物對 SEQ ID NO. 13/14 及探針 SEQ ID NO. 15; aacA-aphD 引物對 SEQ ID NO. 16/17 及探針 SEQ ID NO. 18。
3. 用于金黃色葡萄球菌耐藥性檢測的試劑盒，包括權利要求1或2所述的組合物。
4. 金黃色葡萄球菌耐藥性檢測方法，其特征在于，所述方法包括實時熒光PCR反應的 步驟，使用如權利要求1或2所述的組合物。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR反應體系為：反應體系 總體積25 yL，其中含有：權利要求1所述的引物對各0.2 ii M及相應探針各0.4 yM，以及： 濃度為 10 ?1〇〇 U g/mL 的樣品 DNA 2 ii L，5U/ ii L Taq DNA 聚合酶 0? 5 ii L，10 ii mol/L dNTPl ii L，10XPCR緩沖液2. 5 ii L，以及余量的水。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的實時熒光PCR反應參數為：95°C， 30s，l 個循環；95°C，5s ;60°C，34s，40 個循環。
7. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR反應設陽性對照，陰性 對照和空白對照； 所述陽性對照樣品包括金黃色葡萄球菌的DNA提取物，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的 DNA提取物，耐紅霉素金黃色葡萄球菌的DNA提取物及耐氨基糖苷類抗生素的金黃色葡萄 球菌的DNA提取物； 所述陰性對照樣品是大腸桿菌的DNA提取物； 所述空白樣品對照是滅菌水； 結果采用如下的結果判定標準： a.質量控制：當以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效： (a) 空白對照：無熒光對數增長，相應的Ct值> 40. 0 ; (b) 陰性對照：無熒光對數增長，相應的Ct值> 40. 0 ; (c) 陽性對照：有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值 < 30. 0 ； (d) 內參照：有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值< 30. 0 b.結果判定：設置40個循環，Ct值即為循環數， 如果Ct值彡35. 0,表明樣品在經過35個循環以內的擴增，即檢測到擴增曲線，則判定 為被檢樣品陽性； 如Ct值> 40. 0,表明樣品經過40個循環擴增，仍沒有擴增曲線，則判定為被檢樣品陰 性； 如35. 0 < Ct值< 40. 0,在此之間結果為可疑結果，則重復一次；如再次擴增后Ct值 仍為< 40. 0,則判定被檢樣品陽性；如再次擴增后Ct值彡40. 0,則判定被檢樣品陰性。
【文檔編號】C12R1/445GK104212901SQ201410453124
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年9月5日
【發明者】鄭秋月, 那晗, 董振霖, 徐鳳敏, 戰曉微 申請人:鄭秋月, 那晗, 董振霖, 徐鳳敏, 戰曉微