用于檢測大腸桿菌及其i類整合子的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測大腸桿菌及其I類整合子的組合物，包括引物對SEQ?ID?NO.1/2和引物對SEQ?ID?NO.3/4。在此基礎上進一步建立mPCR-DHPLC/電泳檢測試劑盒及方法，用以檢測食品中大腸桿菌種屬鑒定特異性基因16S～23SrRNA基因、及整合子基因Integrase1。所建立的方法在單次檢測中即可同時高特異性、高靈敏度地鑒定樣品中的大腸桿菌和攜帶整合子基因Integrase1大腸桿菌。所述方法檢測耗時短，操作簡捷，并具有快速高通量等優點，可以節省大量的勞力和財力，適合快速檢測的要求，滿足了食品中微生物檢測迅速準確的需求。
【專利說明】用于檢測大腸桿菌及其I類整合子的組合物
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測【技術領域】，涉及食品及生物產品中耐藥性大腸桿菌所攜帶的 與耐藥基因相關的器件的檢測，尤其針對大腸桿菌及其所攜帶的I類整合子的mPCR檢測。
【技術領域】 [0002]
[0003] 大腸桿菌是常見的可引起人畜共患病的致病菌，食品動物來源的菌株具有耐藥性 可能對人類存在巨大的潛在危害，檢測食品源、動物源等的大腸桿菌耐藥性的研究尤為重 要。由于細菌耐藥性的研究主要為臨床醫學領域，而對于動物源性及食源性細菌的耐藥性 研究起步較晚，且往往由于細菌同時食物鏈傳播給人類，人們對食物鏈的中間環節多著眼 于細菌致病性的檢測，而忽略了細菌耐藥性。
[0004] 目前，國內對動物源性細菌耐藥性的方法主要依據臨床和實驗室標準化委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的《動物及其制品中細菌耐 藥性的測定紙片擴散法》SN/T1944-2007進行體外細菌培養藥敏性試驗，而缺少快速檢測食 品中大腸桿菌耐藥菌株的檢測方法。體外細菌培養藥敏性試驗操作繁瑣，不適于大量樣品 的檢測，且只能檢測菌株的耐藥表型，而對于耐藥基因尚未表達的耐藥菌株易造成漏檢。而 且完成藥敏鑒定的全自動生化鑒定儀價格昂貴，鑒定結果受操作人員的影響較大，也易造 成假性耐藥或假性敏感現象；此外該體外藥敏試驗的結果無法評估細菌耐藥性對人體的危 害。
[0005] 大多數細菌的耐藥性是由于獲得外源性耐藥基因而產生的。整合子通過捕獲一個 或多個耐藥基因盒，使細菌表現出對相應抗生素的耐藥或多重耐藥。整合子系統作為一個 可移動的基因元件，定位在染色體上，通過垂直傳播使細菌產生耐藥性。整合子可以攜帶一 個或多個耐藥基因盒，由于細菌可以不斷地通過整合酶基因從環境中捕獲耐藥基因盒，而 使其具有耐藥或多重耐藥性。同時，整合子可以通過存在于質粒、轉座子等可移動基因元 件，在同種屬或不同種屬之間進行基因水平轉移，從而導致細菌耐藥性的傳播。迄今已經發 現至少有8類整合子，其中I型整合子最為普遍，它們可整合70多種基因盒，且絕大多數為 耐藥基因盒。大腸桿菌中攜帶耐藥基因盒的I型整合子流行較為廣泛，大腸桿菌I型整合 子可整合攜帶aadA、dhfr、sat、bla及ereA基因。因此，可以預計，對大腸桿菌及其攜帶I 類整合子情況的精準檢測對進一步研究菌株耐藥性是非常重要的依據。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一，在于提供用于檢測大腸桿菌及其I類整合子的組合物，包括 引物對 SEQ ID N0. 1/2 和引物對 SEQ ID N0. 3/4。
[0007] 關于這些引物對的描述如下表：
[0008]
【權利要求】
1. 用于檢測大腸桿菌及其I類整合子的組合物，包括引物對SEQ ID NO. 1/2和引物對 SEQ ID NO. 3/4。
2. 用于檢測大腸桿菌及其I類整合子的試劑盒，包括權利要求1所述的組合物。
3. 檢測大腸桿菌及其I類整合子的方法，包括PCR反應的步驟，其特征在于，所述PCR 反應使用權利要求1所述的組合物為擴增引物。
4. 權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應體系總體積25 μ L，包括：待測 樣品DNA溶液1 μ 1，5U/ μ L的Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，PCR反應液12 μ L和余量的水； 所述 PCR 反應液中含 10mM Tris ·Η(：1、50πιΜ KCl、25mM MgCl2、dNTP 各 2. 5mM 及 0· 1 μ Μ 的引物對 SEQ ID NO. 1/2 和(λ 1 μ Μ 的引物對 SEQ ID NO. 3/4。
5. 權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應參數為： 預變性：94°C，lmin ; 進入循環：94°C變性30s，57°C退火90s，72°C延伸90s，30個循環； 終止延伸：72°C，10min。
6. 權利要求3所述的方法，其特征在于，還包括對PCR反應產物進行DHPLC分析的步 驟，分析條件如下： 色譜柱：PS-DVB&C18DNAS印色譜柱，4. 6_X 50_，粒度 3 μ m ; 柱溫：50°C ; 按照體積比，流動相為： Omin ：55. 0% A,45. 0% B ； 0. 5min ：50. 2% A,49. 8% B ； 3. 6min ：41. 8% A, 58. 2% B ； 6. 8min ：38. 2% A,61. 8% B ； 9. 9min ：36. 3% A,63. 7% B ； 13. Omin ：35. 0% A,65. 0% B ； A為50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000ml所得溶液；B為50ml TEAA和250ml乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000ml所得溶液； 流速：〇· 9mL/min ; 檢測器：突光檢測器，光源150W Xenon燈；激發譜帶寬15nm ;發射譜帶寬15. 3nm ;檢測 靈敏度：在波長350nm積分2s ; 上樣量：PCR產物10μ L。
7. 權利要求6所述的方法，其特征在于，按照如下標準判斷所述DHPLC檢測結果： 檢測樣品無擴增吸收峰出現，可判定樣品結果為陰性，直接報告未檢出相對應的致病 菌； 檢測樣品E. coli 16S?23SrRNA基因出現典型的PCR產物吸收峰，且吸收峰值大于 3mV時，可判定該樣品為大腸桿菌，而Integrasel基因無擴增吸收峰，可判定該菌不攜帶I 類整合子； 檢測樣品E. coli 16S?23SrRNA基因出現典型的PCR產物吸收峰，且吸收峰值大于 3mV時，可判定該樣品為大腸桿菌，同時Integrasel基因出現典型的PCR產物吸收峰，可判 定該菌攜帶I類整合子； 檢測樣品出現典型的PCR產物吸收峰，但吸收峰值小于3mV時，建議樣本重做；重做結 果峰吸收值仍小于3mV則為陰性，否則為可疑陽性。
8. 權利要求3所述的方法，其特征在于，還包括對PCR反應產物進行電泳分析的步 驟，所述瓊脂糖凝膠電泳條件為：瓊脂糖3%，Marker lOObp，電壓200V，電流190mA，時間 20min，上樣量，10 μ L ;在紫外透射分析儀上觀察結果。
9. 權利要求8所述的方法，其特征在于，按照如下標準判斷所述電泳結果： 如待測樣品未出現相應大小的擴增條帶，則可報告該樣品檢驗結果為陰性； 檢測樣品E. colil6S?23SrRNA基因出現相應大小的擴增條帶，可判定該樣品為大腸 桿菌，而Integrase I基因無相應大小的擴增條帶，可判定該菌不攜帶I類整合子； 檢測樣品E. colil6S?23SrRNA，Integrase I基因均出現相應大小的擴增條帶，可判 定該菌為攜帶I類整合子的大腸桿菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195250SQ201410453110
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年9月5日
【發明者】鄭秋月, 曹際娟, 徐楊, 徐君怡, 戰曉微 申請人:鄭秋月, 曹際娟, 徐楊, 徐君怡, 戰曉微