基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒的制作方法

基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，所述試劑盒包含以下靶標基因特異引物序列：正向引物如SEQIDNO.2所示，反向引物如SEQIDNO.3所示。本發明方法，需人力及樣品量少，檢測數量大，而且靈敏度高、特異性強、快速簡便和準確可靠，因而能有效的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的抗性水平，適合于小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的早期快速診斷，同時可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時監控和預警預報，應用前景廣泛。
【專利說明】基于ABCC1基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的檢 測方法及其試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程領域，尤其涉及小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實時熒 光定量PCR檢測方法及其試劑盒。

【背景技術】
[0002] 1 像 Plutella xylostella (L.)，屬鱗翅目（Lepidoptera)菜蛾科 (Plutellidae)，是一種世界性危害的十字花科蔬菜重要害蟲。在我國，上世紀70年代以 來，小菜蛾逐漸上升為華南和長江中下游地區十字花科蔬菜的主要害蟲。目前，在我國廣大 的華北、東北、西北地區該蟲的危害也已日趨嚴重。小菜蛾主要以幼蟲在十字花科蔬菜的整 個生長期危害葉片，大大降低了蔬菜的產量和質量，個別田塊嚴重發生時能減產90%以上， 甚至絕產。小菜蛾之所以危害如此嚴重主要是因為它能很快對多種化學藥劑產生抗藥性， 對農藥具有超強的適應性。它幾乎對用于防治其危害的各類殺蟲劑都產生了不同程度的抗 藥性，這其中就包括生物源農藥蘇云金芽孢桿菌Bt (唐振華和周成理，1992)。
[0003] 蘇云金芽孢桿菌（ZfeciBm 簡稱Bt)是一種在芽孢形成期間可 產生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,簡稱ICPs，又被稱為δ-內毒素） 的革蘭氏陽性細菌。由于其殺蟲譜廣，專一性強，對人畜無害，對環境友好等優點，Bt制劑現 已成為世界上應用最廣的一類微生物殺蟲劑。而且，目前編碼Bt殺蟲蛋白的多種基因也已 被成功轉入到了多種重要的糧棉作物中，用于田間害蟲防治。多年來，它在害蟲防治中發揮 了重要作用。但是Bt制劑大量及不合理的使用最終造成了害蟲產生Bt抗性。小菜蛾的Bt 抗性問題已非常突出，因此為了更有效的使用Bt生物農藥防治小菜蛾，開發有效地小菜蛾 Bt抗性早期快速分子診斷技術就顯得尤為重要。目前，盡管一些基于PCR方法的分子標記 技術如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,擴增片段長度多態性）已經用于小菜蛾抗性相關基因的 尋找上，但這些標記并未直接用于小菜蛾抗性檢測，小菜蛾Bt抗性檢測仍局限于生物測定 方法。然而，傳統的生物測定方法有一些缺點：（1)靈敏度低：生物測定很難檢測早期抗性 或低頻率抗性；（2)周期長：小菜蛾的Bt生物測定結果一般需要2天（48小時）以上；（3) 對試蟲數量要求很大：測定一個標準曲線完成一次生測至少需要約200頭試蟲，且對昆蟲 飼養的要求也很高。（4)操作麻煩且標準性不強：方法比較繁瑣，操作起來比較復雜，從蟲 源、飼養到測定難以做到真正的標準化，尤其要求試蟲的大小一致，不僅導致生測的工作量 加大，而且諸多人為因素也會影響生測結果；(5)傳統的方法從軟件繪出的標準曲線求出 的LC 5(I和LC9(I值的重復性和精確性較低；(6)傳統的生物測定方法對供試昆蟲測得的抗性 水平往往具有滯后性。
[0004] 隨著分子生物學技術進一步的飛速發展，人們已經將實時熒光定量PCR技術 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)廣泛應用于多種病 毒、細菌的抗藥性檢測，并開始應用于轉錄水平上昆蟲Bt抗藥性靶標基因的表達量檢測。 實時熒光定量PCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于 在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值（每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷 的循環數）和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。相對于生測等常 規Bt抗性檢測手段，實時熒光定量PCR具有操作簡單，靈敏度高，重復性好等優點，因而已 開始成為昆蟲抗藥性靶標基因轉錄水平表達量檢測的首選方法，在抗藥性檢測上日益顯示 出強大的優勢。
[0005] 目前，利用PCR技術對Bt殺蟲蛋白受體基因類鈣粘蛋白基因（cadherin-like gene)在對Bt殺蟲蛋白抗性的棉紅鈴蟲（/?^及煙芽夜蛾 rirescefls)中缺失突變位點來檢測這兩種害蟲對Bt殺蟲蛋白抗性情況已 經被報道，但是田間害蟲種群檢測效果并不理想（Morin et al·，2004; Gahan et al·， 2007)。而且，研究表明，形成Bt殺蟲蛋白抗性小菜蛾的類鈣粘蛋白基因并未發生突變，小 菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性與該基因無關（Baxter et al.，2005)。最近，卻有研究表明，ABC 轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)超家族中 ABCC 亞家 族的ABCC2基因發生突變并導致小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性（Baxter et al.， 2011)，而且，該實驗中所用的小菜蛾種群是田間進化的Bt殺蟲蛋白CrylAc高抗種群，這說 明ABCC2基因發生突變的小菜蛾可以在田間存活，這就為田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc 抗性檢測提供了很好的靶標基因。然而，我們隨后的實驗并未發現ABCC2基因突變與Bt殺 蟲蛋白CrylAc抗性相關，然而，我們最近利用實時熒光定量PCR技術研究發現，ABC轉運蛋 白超家族中ABCC亞家族的ABCC1基因表達量在抗性種群中顯著上調，那么，利用實時熒光 定量PCR技術檢測ABCC1表達量的升高水平是一種有效檢測田間害蟲Bt Cry類殺蟲毒素 抗性的好方法。毫無疑問，小菜蛾早期抗藥性分子檢測與診斷技術的開發將為其抗性治理 措施的評價以及抗藥性風險預警提供技術手段，在減少害蟲危害損失、減少農藥對環境的 污染、保障蔬菜產品的質量和保障人民身體健康等方面具有重要的意義。因此，建立一種準 確、簡便、快速、可靠的小菜蛾Bt抗性檢測手段尤為迫切。所以為了更好的檢測小菜蛾Bt 殺蟲蛋白CrylAc抗性，開發出更有效地小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測手段，我們開 展了該研究內容。


【發明內容】

[0006] 本發明針對現有小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測技術中存在的靈敏度低、周 期長、重復性差及材料要求高等問題，擬通過特異性熒光定量PCR引物篩選及其反應體系 的優化等步驟，建立一種快速準確的實時熒光定量PCR分子檢測方法及快速、簡便、準確、 高效的檢測小菜蛾Bt抗性的檢測試劑盒，為小菜蛾Bt抗性有效檢測提供有效工具。
[0007] 本發明的一個目的是提供了一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的 PCR引物對，所述引物對的序列：正向引物如SEQ ID N0. 2所示，反向引物如SEQ ID N0. 3 所示。
[0008] 所述特異性引物對包括以小菜蛾中腸 ABC轉運蛋白超家族中ABCC亞家族ABCC1 基因的保守片段區為靶目標序列設計得到的靶標基因特異性引物對以及已報道的小菜蛾 持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區為靶目標序列設計得到的內參基因 L32特異性 引物序列。
[0009] 本發明還提供一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測試劑盒， 其特征在于：所述試劑盒包含所述的引物對。進一步的，本試劑盒中還包括本實驗室已發表 的（Fuetal.，2013)以小菜蛾持家基因核糖體蛋白L32基因的保守片段區為靶目標序 列設計得到的內參基因 L32特異性引物序列（正向引物：5' -CCAATTTACCGCCCTACC-3';反 向引物：5' -TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3')，用于校正樣品間實驗誤差。本試劑盒中含有 的逆轉錄酶，DNase，RNase抑制劑，dNTP混合物，特異性引物，MgCl 2溶液，熱啟動Taq DNA 聚合酶，突光定量反應液，Buffer緩沖液，RNase-free水等實驗組分對于本領域技術人員 來說屬于公知常識，可根據自身需要選用。此外，本試劑盒還包括符合該試劑盒要求的陽性 對照及陰性對照樣品。
[0010] 本發明進而提供一種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測方法，其 特征在于：其采用如所述的引物對或所述的試劑盒進行PCR。
[0011] 具體包括以下步驟： (1) 提取待測小菜蛾的RNA樣品，并反轉錄為CDNA模板； (2) 將所述cDNA模板加入到含有所述引物對的PCR反應液中得到PCR反應體系； (3) 進行實時熒光定量PCR檢測； 其中優選地，所述實時熒光定量PCR檢測的擴增程序為：94°C預變性15 min，94°C變性 15 sec，55?退火 30 sec，72?延伸 32 sec，40 個循環。
[0012] 進一步的，PCR過程完成后，按0. 1°C · f的升溫速率從72°C升至95°C進行融解 曲線的分析驗證，具體過程為：95°C進行15 s，然后60°C進行1 min，接著95°C進行30 s， 最后再在60°C進行15 s ; 若所述待測小菜蛾的樣品產生典型的"S"型擴增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值[Ct 值（目_--α-__?32)]彡9,則說明所述小菜蛾待測的樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗 性；若ACt值收值 （目__。。「_基_2)] > 10,則說明待測小菜蛾的樣品未對Bt殺蟲蛋 白CrylAc產生抗性。
[0013] 優選地，所述待測小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
[0014] 優選的，本發明使用ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀進行檢測。
[0015] ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀進行結果分析時，基線設置取3-15個循環 的熒光信號。為便于比較，樣品、陰性及陽性對照的所有擴增曲線的閾值均設定為〇. 50153 (位于擴增曲線對數期中間位置，其它儀器基線和閾值設定可根據儀器作相應調整）。
[0016] 對上述步驟中熒光定量PCR反應產物進行熒光定量檢測，在特定的波長條件下， 根據熒光檢測的抗敏樣品間各自靶標基因 ABCC1與內參基因 L32之間的Ct值差值(即Λ Ct 值）判斷結果，若所述待測小菜蛾樣品產生典型的"S"型擴增曲線及單峰融解曲線，且ACt 值彡9,則說明所述小菜蛾待測樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性；若Λ Ct值彡10,則說 明待測小菜蛾樣品未對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性。若Λ Ct值位于兩者中間，則建議重 做，樣品對Bt殺蟲蛋白抗性產生與否視重做結果而定。
[0017] 本發明系選擇小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區為靶目標序列，根據該基因特 點和實時熒光定量PCR引物的設計原則，設計了一對特異性引物，再配合已發表的內參基 因 L32特異性引物，建立了一種用于小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢測的實時熒光定量 PCR試劑盒及其檢測方法。較之現有生物測定技術而言，本發明所提供的小菜蛾Bt殺蟲蛋 白抗性檢測的實時熒光定量PCR檢測試劑盒及其使用方法，具有如下效果及優點： (1)特異性更強。本發明是利用小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區為靶目標序列，設 計了一對特異性引物，從而在PCR過程中可以對靶目標序列進行特異性擴增，通過將未知 樣品和陽性對照間的ABCC1基因表達量差異進行比對即可測定未知樣品是否產生抗性；而 傳統的生測方法是通過觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白CrylAc濃度下死亡情況來粗略判 斷小菜蛾是否對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性，其判斷較之基因檢測特異性差得多。
[0018] (2)靈敏度和準確度更高。本發明中涉及的小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性檢 測方法是通過檢測PCR實時熒光強度確定抗性相關基因表達量來判斷小菜蛾是否產生抗 性，而實時熒光強度的儀器檢測，相對于傳統的通過人為觀察判斷試蟲在不同Bt殺蟲蛋白 CrylAc濃度下死亡情況來粗略判斷小菜蛾是否對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性這種誤判率 及重復性較差的生測方法，抗性檢測的靈敏度和準確度大大提高。
[0019] (3)檢測周期短。生測過程至少需要48小時的時間，而本發明方法僅需3小時即 可完成判斷，一次可以同時檢測多個樣品，特別適合于大批量樣品的快速檢測。
[0020] (4)材料要求少。小菜蛾毒力生物測定中測定一個標準曲線至少需要約200頭標 準試蟲，這些試蟲的飼養及挑取需要花費一定的人力、物力和財力。而本發明對一個種群的 檢測只需要幾十頭左右的4齡試蟲，甚至可以檢測單頭4齡試蟲。
[0021] 綜上所述，本發明的方法可替代傳統的生物測定方法，它可以準確、快速、特異、方 便的檢出供試小菜蛾是否具有Bt抗性，對田間小菜蛾Bt抗性的監測監控具有重要意義。
[0022] 尤其需要指出的是，本發明人之前研究認為利用PCR技術檢測小菜蛾中腸膜結合 形式的堿性磷酸酶基因（mALP)表達量變化可作為小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的好方 法（已申請國家發明專利，專利號201210273591.0)，盡管與mALP相比，ABCC1基因表達量 變化并不與小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性性狀連鎖，但是抗性小菜蛾卻需要ABCC1基因 表達量變化來補充適合度代價，那么在不同抗性倍數小菜蛾中ABCC1基因表達量變化卻比 mALP表達量變化更為靈敏，因此，與該發明專利內容相比，本發明專利所利用的檢測ABCC1 基因表達量變化的方法更能反應不同抗性基因頻率水平與抗性倍數之間的關系，從而能更 好的檢測形成不同程度抗性的田間小菜蛾種群。
[0023] 本發明所提供的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測方法，需人力及樣 品量少，檢測數量大的特點，而且靈敏度高、特異性強、快速簡便和準確可靠，因而能有效的 檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白的抗性，適合于小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的早期快速診 斷，同時可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的實時監控和預警預報，應用前景廣 泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明中所用特異性引物對擴增小菜蛾中腸 ABCC1基因 cDNA片段序列。
[0025] 圖2為圖1中目的基因 ABCC1和內參基因 L32在Bt殺蟲蛋白CrylAc敏感的4齡 小菜蛾幼蟲中腸 cDNA樣品PCR擴增片段的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1 :目的基因 ABCC1 的PCR擴增片段（165bp) ;2:內參基因 L32的PCR擴增片段（120bp) ;M:Marker I。
[0026] 圖3為標準品梯度稀釋進行實時熒光定量PCR所得到的標準擴增曲線。其中，橫 坐標代表循環數（Cycle)，縱坐標代表第η次PCR循環時的熒光信號強度（Rn)，圖中平行 且遠離橫坐標的直線代表熒光閾值，字母代表樣品cDNA的5個2X梯度稀釋濃度。
[0027] 圖4是根據圖3中得出的數據繪制的熒光定量PCR所得到的標準曲線。其中，橫 坐標代表標準樣品cDNA濃度的對數值，縱坐標代表循環閾值即Ct值。
[0028] 圖5為實施例1的檢測小菜蛾Bt殺蟲蛋白抗性的熒光定量PCR檢測結果。其中， A :對Bt殺蟲蛋白CrylAc敏感小菜蛾種群DBMIAc-S的4齡幼蟲中腸 cDNA樣品；B :對Bt殺 蟲蛋白CrylAc產生抗性小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA的樣品。
[0029] 圖6為實施例2的檢測小菜蛾Bt抗性的熒光定量PCR檢測結果。其中，A :實施例 1中對Bt敏感的小菜蛾種群DBMIAc-S的4齡幼蟲中腸 cDNA陰性對照樣品；B :實施例1中 對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性的小菜蛾種群SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA陽性對照樣品； C :對Btk制劑產生抗性的小菜蛾種群SH-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品；D :對Bt殺蟲 蛋白CrylAc產生抗性的近等基因系小菜蛾種群DBMIAc-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品； E :對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗性的小菜蛾種群NIL-R的4齡幼蟲中腸 cDNA待測樣品。
[0030]

【具體實施方式】
[0031] 以下結合實施例對本發明作進一步描述與說明，但本發明的保護范圍并不僅限于 此。
[0032] 實驗前材料樣品準備： (1) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群（DBMIAc-S):該小菜蛾種群在中國農業科學院蔬菜 花卉研究所昆蟲組昆蟲飼養室內用無蟲甘藍苗進行繼代飼養，期間未接觸任何有毒殺蟲 齊U，對Bt制劑及其產生的毒素敏感；記載過小菜蛾Bt敏感種群（DBMIAc-S)的非專利文獻 是：Yang, Z. X. , ffu, Q. J. , Wang, S. L. , Chang, X. L. , Wang, J. H. , Guo, Z. J. , Lei, Y. Y. , Xu, B. Y. , Zhang, Y. J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in CrylAc-susceptible and Cry1Ac~resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539 - 548. (2) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性種群（DBMIAc-R):該種群在中國農業科學院蔬菜 花舟研究所昆蟲組昆蟲飼養室內用Bt殺蟲蛋白CrylAc (提取方法參考Luo, K. , Banks, D. , Adang, M. J. (1999) Toxicity, binding, and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cryl δ-endotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodop tera frugiper da. Applied and Environmental 65, 457 - 464.)進行抗性汰選，連續飼養至今；記載過小菜蛾Bt殺蟲蛋 白 CrylAc 抗性種群（DBMIAc-R)的非專利文獻是：Yang, Ζ· X.，Wu，Q. J.，Wang, S. L.， Chang, X. L. , Wang, J. H. , Guo, Z. J. , Lei, Y. Y. , Xu, B. Y. , Zhang, Y. J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in CrylAc-susceptible and CrylAc-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539 - 548. (3) 小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R):該種群在敏感種群 DBMIAc-S和抗性種群DBMIAc-R經過多達7次的多組單對雜交、回交及汰選后建立的與 DBMIAc-S敏感種群遺傳背景高度相似的近等基因系CrylAc抗性種群。該種群建成后在本 實驗室內用Bt殺蟲蛋白CrylAc進行持續抗性汰選，連續飼養至今；記載過該小菜蛾Bt殺 蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R)的非專利文獻是：Zhu，X.，Lei，Y.，Yang， Υ·，Baxter，S. W.，Li，J.，Wu，Q.，Wang，S.，Xie，W.，Guo，Ζ·，Fu，W.，Zhang，Υ· (2014) Construction and characterisation of near-isogenic Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to CrylAc toxin. Pest Management Science, DOI: 10. 1002/ps. 3785. (4) 深圳汰選種群（SZ-R，又叫T2-R):該種群是2003年在廣東省深圳田間采集的小 菜蛾種群，在本實驗室內用Bt殺蟲蛋白CrylAc浸葉汰選至今； (5) 上海汰選種群（SH-R):該種群是2005年在上海田間采集的小菜蛾種群，在本實驗 室內用Btk制劑（購自湖北省農科院Bt研究開發中心）浸葉進行抗性選育至今。
[0033] 以上所用的5個種群：小菜蛾Bt殺蟲蛋白敏感種群（DBMIAc-S)、小菜蛾Bt殺蟲蛋 白CrylAc抗性種群（DBMIAc-R)、小菜蛾Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性近等基因系種群（NIL-R)、 深圳汰選種群（SZ-R)和上海汰選種群（SH-R)。
[0034] 上述五個小菜蛾種群均在室內進行隔離飼養，將蛹放入成蟲飼養籠中（R=10 cm， L=40 cm)，籠四周以80目的紗網包圍，成蟲羽化后，籠內掛浸過10%蜂蜜糖水的脫脂棉球一 個，為成蟲補充營養，讓其在甘藍苗上產卵，卵孵化后再轉入新鮮的甘藍苗上飼養。飼養溫 度是25±1°C，相對濕度為60%-70%，光周期為光照：黑暗=16h :8h。
[0035] 實施例1 利用實時熒光定量PCR技術對DBMIAc-S及SZ-R的4齡幼蟲中腸 cDNA樣品的檢測及 本檢測試劑盒和其使用方法的建立。
[0036] 1.以小菜蛾中腸 ABCC1基因的保守片段區為靶目標序列（SEQ ID N0. 1)，根據實 時熒光定量PCR引物設計原則，設計特異性熒光定量引物序列如下： 正向引物（qCCl-F) :5' -GGTGGTGCTCATCTGCTACCTCAT-3' (SEQ ID NO. 2)； 反向引物（qCCl-R) :5' -ATCCTGACACGCTCATCGGTTTT-3' (SEQ ID NO. 3)； 該特異性引物擴增片段序列如圖1所示，其擴增特異性如圖2(其中，1 :目的基因 ABCC1 的PCR擴增片段；2 :內參基因 L32的PCR擴增片段;M :Marker I。）所示，從圖中可看出該 引物擴增特異性高，擴增條帶單一，大小為165bp，符合實時熒光定量PCR反應要求。此外， 從圖中也可看出本實驗中使用的內參基因 L32的引物擴增特異性也很高，擴增條帶單一， 大小為120bp，也符合實時熒光定量PCR反應要求。
[0037] 2.提取兩種群4齡小菜蛾中腸 RNA樣品，然后反轉錄為cDNA模板，在包括步驟1 所述特異性引物的實時熒光定量PCR反應體系中進行反應； (1)小菜蛾中腸 RNA的提取步驟如下： ① 取敏感、抗性種群小菜蛾4齡幼蟲，使用解剖鑷冰上取出中腸組織，并使用0. 7% NaCl溶液漂洗干凈； ② 將中腸組織放入玻璃勻漿器內，并向勻漿器中加入1 ml的Trizol試劑充分勻漿，勻 漿后將液體倒入1. 5ml離心管內，室溫放置5min ; ③ 向離心管中加入0. 2 ml的氯仿，劇烈振蕩15 s，然后室溫放置3 min ; ④ 在4°C條件下12, 000 rpm離心15 min ; ⑤ 吸取上清液轉入到一個新的離心管中，加入0. 5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室 溫靜置10 min ; ⑥ 在4°C條件下12, 000 rpm離心10 min ; ⑦ 棄上清，然后加入1 ml 75%的乙醇，輕輕洗漆沉淀，4? ,7,500 rpm離心5 min,棄上 清； ⑧ RNA沉淀自然干燥后，加入約5〇μ1 DEPC水溶解，冰上保存，測OD26(l/OD28(l值，電泳檢 測條帶，選擇符合條件的RNA樣品進行以下反轉錄實驗或-80°C保存備用。
[0038] (2)反轉錄合成cDNA模板： 下面以日本TaKaRa公司去基因組的PrimeScript? RT試劑盒為例，實驗過程如下： ① 使用前將試劑盒各組分解凍并離心混勻； ② 基因組DNA的去除反應：

【權利要求】
1. 一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR引物對，其特征在于： 所述引物對的序列為：正向引物如SEQ ID NO. 2所示，反向引物如SEQ ID NO. 3所示。
2. -種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白CrylAc抗性的PCR檢測試劑盒，其特征在于： 所述試劑盒包含權利要求1所述的引物對。
3. -種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其特征在于： 其采用如權利要求1所述的引物對或權利要求2所述的試劑盒進行PCR。
4. 如權利要求3所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，具體 包括以下步驟： (1) 提取待測小菜蛾的RNA樣品，并反轉錄為cDNA模板； (2) 將所述cDNA模板加入到含有所述引物對的PCR反應液中得到PCR反應體系； (3) 進行實時熒光定量PCR檢測。
5. 如權利要求4所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其中， 所述實時熒光定量PCR檢測的擴增程序為：94°C預變性15 min，94°C變性15 sec，55°C退火 30 sec，72°C延伸 32 sec，40 個循環。
6. 如權利要求4所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry lAc抗性的PCR檢測方法，其中， PCR過程完成后，按0. ΓΟ?Γ1的升溫速率從72°C升至95°C進行融解曲線的分析驗證，具體 過程為：95°C進行15 s，然后60°C進行1 min，接著95°C進行30 s，最后再在60°C進行15 s ； 若所述待測小菜蛾的樣品產生典型的"S"型擴增曲線及單峰融解曲線，且Λ Ct值[Ct 值（目_Β?α-__?32)]彡9,則說明所述小菜蛾待測的樣品對Bt殺蟲蛋白CrylAc產生抗 性；若ACt值收值 （目__。。「_基_2)] > 10,則說明待測小菜蛾的樣品未對Bt殺蟲蛋 白Cry 1 Ac產生抗性。
7. 根據權利要求4至6任一項所述的方法，其特征在于：所述待測小菜蛾的RNA樣品 為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。
【文檔編號】C12N15/11GK104195253SQ201410455061
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月9日 優先權日:2014年9月9日
【發明者】張友軍, 郭兆將, 康師, 朱勛, 吳青君, 王少麗, 徐寶云, 謝文 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所