專利名稱：：人工改造合成的殺蟲基因及其編碼的蛋白質與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因工程領域，尤其涉及一種人工改造合成的殺蟲基因以及其構建的植物表達載體及其在抗蟲轉基因植物研制方面的應用。
背景技術：
：植物生長過程中易遭受蟲害，每年因蟲害造成的農作物損失量十分巨大。為防治植物蟲害發生，需大量噴施農藥,長期大量使用化學農藥，可導致害蟲抗藥性增強，并且會大量殺傷其天敵，生態失衡，步入惡性循環。利用基因工程手段使植物獲得抗蟲性，目前已被廣泛采用，用于植物抗蟲基因工程的基因主要包括(l)蘇云金芽孑包桿菌(_6flc/〃w"/wn'"g/em7'&份)殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因如a7"c,Oj7F，Oj246等；(2)蛋白酶抑制劑(proteinaseinhibitors,PIS)基因如3工豆(w'wem^)月夷蛋白酶卞卩制劑(cowpeatrysininhibitor,CpTI)基因Q77等；(3)淀粉酶抑制劑(amylaseinhibitor,AI)基因如菜豆(尸/w"o/"i"vw/gar的a-淀粉酶抑制劑基因等；(4)植物外源凝集素(lectin)類基因如雪花蓮外源凝集素(Ga/a"Awsm'vfltoaggulutinin,GNA)基因g"a等；(5)昆蟲特異性神經毒素(neurotoxin)基因如蝎毒素基因5""&/7>等。在生產上利用最成功的基因主要有說殺蟲晶體蛋白基因和QTI基因。其中應用最廣泛的是價殺蟲晶體蛋白基因，即蘇云金芽孢桿菌(B)內毒素晶體蛋白基因，克隆于蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌(5)是1901年發現的一種革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，已知其是可產生對多種昆蟲，如鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和雙翅目(Dipterans)等作物害蟲有毒性的多種伴孢結晶蛋白質。這種殺蟲蛋白質已經發現了五十多大類，三百多種。Bt殺蟲蛋白在昆蟲消化道內消化酶的作用下，蛋白被水解，釋放出約6070kDa抗蛋白酶的活性毒素分子。活性毒素分子可與腸道上皮細胞紋緣膜上的特異性受體結合，并發生作用而使細胞膜穿孔。消化道上皮細胞的離子、滲透壓平衡遭到破壞，最終導致昆蟲死亡。由于其殺蟲的專一性和高度選擇性，所以對植物和包括人在內的動物沒有毒害，而且是環境可以接受的。自80年代后期以來，許多實驗室已將說殺蟲基因導入到不同植物組織的細胞中，并已在被轉化的細胞和植物中表達了這種來源與微生物的殺蟲基因，使轉基因植物具有抗蟲性。不同種類Bt殺蟲蛋白殺蟲譜可能不同，目前人們已經發現了對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目據有毒性的殺晶體蛋白的大小及性狀也不同。在1995年無脊推病理學會(SocietyforInvertebratePathology,SIP)年會上專門成立了由Crickmore等人組成的Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會，提出了以殺蟲蛋白氨基酸序列同源性為唯一標準的分類命名體系，將殺蟲基因分為17類，36亞類(Crickmoreeta1.1995)，2008年增補為54類,101亞類(http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil一Crickmore/Bt/)。其中Oj24a對棉鈴蟲、紅鈴蟲、玉米螟、煙芽夜蛾、粉紋夜蛾、藜豆夜蛾、稻縱巻葉螟、大豆夜蛾、熱帶家蚊等害蟲均具有殺蟲效果。由于遺傳密碼有64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分，如果直接將昆蟲的基因直接轉化至植物中，在一定程度上會影響其蛋白的表達，利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密碼子合成基因，可以增加蛋白表達量。另外歷殺蟲晶體蛋白的N端小段氨基酸殘基在毒蛋白活化過程中被切除是殺蟲活性所必須的。
發明內容為提高轉基因植物的抗蟲性，本發明的目的在于提供一種在植物中能高效表達的殺蟲基因。一種人工改造合成的殺蟲基因，具有SEQIDNO:1所示的核苦酸序列。一種人工改造合成的殺蟲基因，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2所示的核苷酸序列與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列相比，5'端在起始密碼子后少84個堿基。所述核苦酸序列采用了植物偏愛性密碼子。所述核苦酸序列采用了棉花偏愛性密碼子。本發明的第二個目的在于提供一種含有上述人工改造合成的殺蟲基因并可在植物中表達該殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質。一種人工改造合成的殺蟲基因編碼的蛋白質CmCry2Aa殺蟲蛋白，由SEQIDNO:l所示殺蟲基因編碼，具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，由633個氨基酸殘基組成。一種人工改造合成的殺蟲基因編碼的蛋白質CmlCry2Aa殺蟲蛋白，由SEQIDNO:2所示殺蟲基因編碼，具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，由605個氨基酸殘基組成，CmlCry2Aa殺蟲蛋白與CmCry2Aa殺蟲蛋白相比N端缺失28個氨基酸，二者都具有殺蟲活性。一種含有上述人工改造合成的殺蟲基因的植物表達載體。用含有上述人工改造合成的殺蟲基因植物表達載體轉化的具有殺蟲能力的植物細胞。用含有上述人工改造合成的殺蟲基因植物表達載體轉化的植物組織、器官及植林。本發明的第三個目的在于提供人工改造合成的殺蟲基因在培育抗蟲植物品種中的應用，尤其是在培育抗蟲棉花中的應用。本發明利用棉花優化密碼子合成了Ow07Z4a以及Cm70724c殺蟲蛋白基因，并分別構建了植物表達載體。轉基因煙草鑒定結果表明所設計合成的Cw(37Z4a及Ow/Oy24a殺蟲基因對棉鈴蟲具有極顯著的抗性，缺失說殺蟲蛋白的N端氨基酸可簡化殺蟲蛋白質的活化，在保持其殺蟲活性的同時，擴大其殺蟲譜。圖l是CwOyZ4aD7-;G五M質粒圖語；圖2是Ow07Z4flD2-pt/C57質粒圖譜；圖3是CwCo;Z4aZ^-pi7C57質粒圖語；圖4是CmQ724aZ)2ZX-;f/C57質粒圖語；圖5是CwO少24a-;[/C57質粒圖譜；圖6是OwO少24fl殺蟲基因植物表達載體M7-A4i-35S-CwCo/Z4fl的構建流程圖7是CwQ724a殺蟲基因植物表達載體M7-A4i-35S-OMO少24aPC/擴增鑒定圖；圖8是CwOj24a殺蟲基因植物表達載體M7-A4i-"S-OwO_y24a酶切鑒定圖；圖9是質粒似/-^47-355-0072^轉化煙草抗蟲性鑒定圖；圖10是CmQ724a殺蟲基因植物表達栽體M7-P"cw-A^77/-3>55f-0770y24fl的構建流程圖1l是CwO;;Z4a殺蟲基因植物表達載體M/-JPwos'-M577/-"1S-Cm07Z4a的酶切鑒定圖12是Cw/Co;2v4fl-;MD7S質粒圖譜；圖13a、b是C附/Oy24a植物表達載體MZ-Prnw-A^TTZ-^S-CwJOyZ^的構建流程圖14是質粒jW-Z^oj-A^TY/^M-O^OyZ^轉化煙草抗蟲性鑒定圖；圖15是OwOy2^基因原核表達栽體CmCo^4a-/7￡n0a的構建流程圖；圖16是CmO少24fl基因原核表達載體OwQ7Z4a-;^r鄧a酶切鑒定圖；圖17是Cw70少24a基因原核表達栽體Cw7O_yZ4a-;^n0a的構建流程圖；圖18是Ow70j24fl基因原核表達載體C附70724a-;^rMa酶切鑒定圖；圖19是CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa殺蟲蛋白的原核表達的蛋白電泳圖；圖20是獲得轉基因棉花植;昧的情況說明。具體實施方式主要試劑配方LB培養基胰蛋白胨10g/1,酵母粉5g/1,氯化鈉10g/l,PH:7.0-7.2,固體培養基加1.5%瓊脂粉抗生素Kan(卡那霉素)50mg/ml,Chl(氯霉素)34mg/ml1MTris-Hcl(PH6.8):121.2gTris溶于1L水中，用濃鹽酸調節PH值到6.8,高壓滅菌1.5MTris-Hcl(PH8.8):181.7gTris溶于1L中，用濃鹽酸調節PH值到8.8,高壓滅菌30%Acrylamide:丙烯酰銨290g、N,N-亞曱雙丙烯酰銨10g定容到1L超純水中0.1mol/lIPTG:0.25g的IPTG溶解于10mL的ddH20中1MDTT:3.09gDTT溶于20ML的0.01M醋酸鈉(PH5.2)中，分裝成小份一20'C保存10%過硫酸銨lg過硫酸銨加水定容至10ml,分裝成小份一20。C保存1xSDS-PAGE凝膠上樣緩沖液50mmol/lTris-HCL(PH6.8)、2。/。SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、100mmol/lDTT(臨用時加)5xTris-GlycineBuffer:Tris15.1g、Glycine94gSDS5.0g定容到lL水中考馬斯亮藍染色液0.1%考馬斯亮藍R-250、25%異丙醇、10%冰醋酸定容到1L水中考馬斯亮藍脫色液100ml醋酸、50ml乙醇定容到1L水中實施例1CwOy24a殺蟲基因的合成1.根據Oy2^殺蟲蛋白的氨基酸序列，根據棉花密碼子用法，分結構域分別設計合成了構建CwOj;24a殺蟲基因的3個基因片段。基因合成委托北京奧科公司完成。根據設計，合成的OwQ724a殺蟲基因的密碼子用法如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注上表中各密碼子所編碼氨基酸符號后的三個數字分別表示密碼子數量/在蛋白中的出現頻率(％。)/密碼子用法(％)結構域I(DomainI)DI基因片段BamHI-ATG-DI-Apal,其具體序列如SEQNOID:5所示。結構域II(DomainII)DII基因片段Apal-DII-SspI,其具體序列如SEQNOID:6所示。結構域III(DomainIII)DIII基因片段Xbal-HpaI-DIII-SacI，其具體序列如SEQNOID:7所示。On07Z4a殺蟲基因的三個結構域基因編碼片段Dl、D2、D3人工合成后，分別克隆到載體pG五M和/f/C57中，質粒分別命名為CmCryZ4aD7-pG￡M,質粒圖語如圖1所示；CmO少Z4flD2-/L/C57,質粒圖語如圖2所示和CwOjZ^aDJ-pC/C57,質粒圖譜如圖3所示。2.OwOj24fl殺蟲基因的克隆拼接首先將CwO少Z4fli^-;7t/C57中的Hpal-D3-Sacl片段克隆到CmCo/24flD2-;t/C57中的Sspl和Sacl位點之間，一平端一粘端連接，構建得到載體質粒Cw0724aZ)2.D3-/t/C57，質粒圖傳如圖4所示，然后將CwOjZ^Z^-pGEM中的Sphl-ApalDl片段克隆到該載體中，得到質粒CmCry2Aa-pUC57,質粒圖譜如圖5所示，完成CFMCw07Z4fl殺蟲基因的拼接，CwOj24fl殺蟲基因的核香酸序列如SEQIDNO:1所示。與天然的Oy24"(genebank登陸號AY496458:http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=45685585)基因對應部分的核苷酸序列對比，其同源性為75.97%。其編碼蛋白質氨基酸序列的同源性為99.95%。實施例2C附Oy24a殺蟲基因植物表達載體ikO-A4/-35S-CmO^Z4a的構建帶有完整CwO;;24"殺蟲基因的質粒CwCo/24fl-/^C57,進一步按照如圖6所述程序構建植物表達載體M7-5^-35S-Cw07^4a。植物表達栽體M7-」R4U5S-OwOyZ4a構建過程中篩選鑒定的PCR鑒定結果及酶切鑒定結果分別如圖7和圖8所示，圖7中1、2和3泳道代表以1、2和3號克隆子為模板擴增出了目標條帶，"+"代表以質粒JW-A4i-35S-CwOy24fl為模板擴增出目標條帶(陽性對照)，"-"代表以水為模板未擴增出目標條帶(陰性對照)；圖8中1泳道為限制性內切酶XbaI+Sacl切質粒M7-A4及-7)ms-G^，切下GUS，大約1.8Kbp左右，2，3，4,5和6泳道為限制性內切酶Xbal+SacI切1,2,3,5,6克隆子，切下來35S+Cw0724a,大約2.7Kbp左右。結果表明l、2、3號克隆均為正確克隆。實施例3轉On0^24fl殺蟲基因煙草獲得采用農桿菌介導葉盤法轉化煙草(本領域科研人員周知的方法)，經PPT生根篩選，獲得抗性植林46抹，提取抗性煙草葉片總DNA,進行PCR鑒定，篩選出27株陽性植抹，并進行抗棉鈴蟲飼蟲試驗，每葉接5頭初孵幼蟲，三天后結果如圖9所示，1為未轉CFMCw07Z4a殺蟲基因煙草葉片，2、3和4分別為轉化CwO_yZ4a殺蟲基因煙草葉片，結果表明所合成Cw0724a殺蟲基因抗棉鈴蟲效果非常突出。經調查，棉鈴蟲平均校正死亡率93.3%。實施例4iV』W//為選擇標記的CmOj24a殺蟲基因植物表達載體^-尸/105-7\^77/-355-00724(|的構建鑒于OKOjZ4a殺蟲基因具有理想的棉鈴蟲毒殺效果，進一步進行了棉花的農桿菌轉化。由于原Cw0^240植物表達栽體M7-A4i-35S-On0724a中選擇標記基因萬ar不利于棉花的農桿菌轉化體系(草丁膦對棉花細胞的再生分化有抑制作用)，設計了克隆路線，獲得A/pf//為選擇標記基因的CwCo;24a殺蟲基因植物表達載體M7-尸"os-iV尸77W:W-CwCo;24a,從通過PCR獲得的^戶///基因經克隆后經測序驗證，確信所擴增7印///基因核苷酸序列正確。整個克隆流程如圖10。最終載體似7-戶"0^^>77/-155^附0724"經酶切鑒定，結果如圖11所示，1,2泳道為EcoRI切M/^ww-MT/W^-OnCo^Ifl的克隆子7,22的結果，能切下1.7Kbp左右的帶，卩日性；3泳道為EcoRI切/5wo;y-A^77/-r"ay-jPaS>作為陽性對照，切下1.7Kbp左右的帶；4,5泳道為Ncol+Kpnl切M7-Pww-A^P77/-J5S-On07Z4a的克隆子7，22的結果，能切下1.4Kbp左右的帶，為陽性；6，7泳道為PstI切M7-JPww-iV尸77/-^5(S-Cwa724a的克隆子7，22的結果，能切下3Kbp左右的帶，陽性；證明所構建以A(pr//為選擇標記基因的OwQ724a植物表達載體完全正確。實施例5CmJC/y24a殺蟲基因的克隆及植物表達載體的構建及其功能鑒定(1)Cm7Q7Z4a殺蟲基因的克隆根據Cm07Z4a殺蟲蛋白的分子結構，殺蟲基因N端存在長度為29個氨基酸的Coli結構片段，位于結構域la-螺旋l的前端。4艮據殺蟲蛋白結構功能關系，該氨基酸序列為原毒素活化時需要被昆蟲消化道胰蛋白酶水解去除。經DNAman軟件分析，在第29、30氨基酸之間的確存在胰蛋白酶識別切割位點。如果殺蟲蛋白進入昆蟲消化道后如不能切除該段多肽，殺蟲活性降低。因此，設計突變引物，將CmCV724a的5'端28個氨基酸去除，使表達出的蛋白直接為活性蛋白，對于擴大殺蟲譜(昆蟲不能正確活化原毒素時)和提高殺蟲效率有利(活化效率不是100%時)。將其命名為Cm/Co^4a。C附/0;;Z4a5端引物加BamHI位點，3端引物加SacI位點，以便下一步的克隆。所設計的引物如下引物12Aa5:5'-GGGATCCATGTCTTTGGACACTATCCA-3'引物22Aa3:5'-GAGCTCTTAGTACAAGGGT-3'以質粒Cm0724fl-/C/C57為模板，擴增出的目的條帶為1820bp。將擴增出的Cw70j24a克隆到pMD7S-r上，命名為Cm/OjZ4a-;MDM，其質粒圖譜如圖12所示。(2)C附7Q7Z4a植物表達載體^^-戶"0-7\^77/-"5-07072^的構建為在植物中驗證Cw/Co;2^的殺蟲功能，設計構建以]\^//為選擇標記基因的Cm70y24a植物表達栽體M7-Pww-7W577/-35S-Cm/Oiy24a,構建流程如圖13a和b所示。(3)Ow7OyZ4a在煙草中的抗棉鈴蟲鑒定采用農桿菌介導葉盤法轉化煙草(本領域科研人員周知的方法)，經卡那霉素生根篩選，獲得抗性植林25林，提取抗性煙草葉片總DNA，進行PCR鑒定，篩選出22林陽性植抹，并進行抗棉鈴蟲飼蟲試驗，每葉接5頭初孵幼蟲，三天后部分結果如圖14所示，1、2為未轉Cm/CV少24a殺蟲基因煙草葉片(對照試驗)，3和4分別為轉化CFMOw07Z4a殺蟲基因煙草葉片，結果表明所合成Cw/Oj24fl殺蟲基因抗棉鈴蟲效果與OwO72力fl殺蟲基因基本相當。經調查，棉鈴蟲平均校正死亡率87.7%。統計學分析表明差異不顯著，與設計的預期結果一致。實施例6(Qz7Cryi^a及070j24fl殺蟲基因原核表達栽體的構建及原核表達(1)CwO少Z4a基因原核表達載體CmO7Z4a-/7￡n0a的構建CmCry24a基因原核表達載體CwO7Z^-;五r3Oa的構建流程如圖15所示，其酶切鑒定結果如圖16所示，"B+S"表示BamHI+Sacl切1號CwO7Z^-;五n0陽性克隆子質粒，能切下完整的C附OyZ4a，1.9Kbp左右，大小符合；"+"表示BamHI+Sacl切Ow0724a-;7f/C57質粒做為正對照，也能切下完整的OwCV_v24a,1.9Kbp左右，大小符合；"B"BgII單酶雙切CwO少Z4fl-;^n0的陽性克隆子質粒，能切下1.3Kbp左右的帶，大小符合，可見此構建正確。(2)Cm70^Z4a基因原核表達載體On7O7Z4a-p￡r30a的構建G^OyZ4G基因原核表達載體Cw7O7Z4fl-;五r30fl的構建流程如圖17所示，其酶切鑒定結果如圖18所示，1,DNALadder;2,BamHI+Sad切4號CmlCry2Aa-pET30a陽性克隆子質粒，能切下完整的On70;;24a，1.8Kbp左右，大小符合；3,BamHI+Sacl切1號Cw70^24a-;jE7^a陽性克隆子質粒，能切下完整的Cw/C>724fl,L8Kbp左右，大小符合(載體酶切不充分)；4,Kpnl切4號0^0724a-p￡"^陽性克隆子質粒，能切下1.78Kbp左右基因片段，大小符合；5，Kpnl切1號Cw/0724a-;￡n^陽性克隆子質粒，能切下1.78Kbp左右的基因片段，大小符合。可見此構建正確。(3)CwC/7Z4a及Cw70724a基因的原核表達制備感受態大腸桿菌細胞在LB培養基平板上活化E.coliRosetta(DE3)菌抹，挑取單菌落接種于5mlLB液體培養基中，37。C搖菌過夜，取此菌液500^1加入到100mlLB液體培養基中，37。C培養2-2.5hr，有大量絮狀菌體出現時，冰浴15min，4°C、6000r/m離心5min，棄上清，加入1/5體積預冷的氯化4丐，重懸菌體，4°C、6000r/m離心5min,再加1/3體積的氯化4丐，重懸菌體，冰浴30min,4'C、6000r/m離心5min,棄上清，吸千，加入1/25體積氯化鈣重懸菌體，以lOO^il菌液分裝，-7(TC保存。分別將空原核表達載體p五7^0a義C附O7Z4"-;^n0a及Cw/O7Z4a-p￡n0a原核表達載體轉入菌抹E.coliRosetta(DE3)感受態細胞中，具體方法為從-70。C冰箱中拿出E.coliRosetta(DE3)感受態細胞，置于冰上解凍，在超凈工作臺上把lOlil連接產物加入到感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，再在42。C水浴中熱激90sec,迅速再冰浴2min，再加入350plLB空白液體培養基，37。C下搖動培養40min,再將此管菌體全部加入到含有50pg/mlKan的固體培養基中，均勻涂布平板，待液體完全被吸收后，37。C倒置培養12~16小時。挑取單菌落接種到含有50pg/mlKan和34|ag/mlChl抗生素的5mL液體培養基中37。C過夜培養，取100pl接種到含有50嗎/mlKan和3化g/mlChl抗生素的10mL液體培養基中，37。C培養2hr左右，OD6000.6時加入IPTG至終濃度lmmo1〃1,37。C下誘導表達。誘導表達4hr后，各取lmL菌液，10000r/m離心5min,收集菌體，加入100pl含有10Ommol/1DTT的1xSDS-PAGE凝膠上樣緩沖液重懸，取40pl在IOO'C煮5min，取20^1上樣，進行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE分析法參考《分子克隆》，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%,先以80v電壓電泳，待溴酚藍指示劑進入到分離膠后，加大電壓到110v，大約lhr30min待指示劑移動到膠底部時，結束電泳，用考馬斯亮藍染色液染色過夜，再用脫色液脫色直至蛋白條帶清晰為止。圖19為CwOjZ4a及On/0;/Z4a基因的原核表達SDS-PAGE電泳結果，1和2分別為經大腸桿菌表達的CmlCry2Aa蛋白及CmCry2Aa蛋白，可見大小在約66kD附近，CmlCry2Aa目的蛋白較CmCry2Aa蛋白略小(pET30a載體上HISTag基因150bp,編碼50個氨基酸)；3為轉化/五nOa空栽體的陰性對照試驗；5為蛋白質Marker。實施例7利用CmC^24fl及Ow/Oj24a殺蟲基因植物表達栽體獲得轉基因棉花分別通過花粉管通道法和農桿菌介導法將CwOj24a或0^QjZ4a殺蟲基因植物表達載體轉化棉花，均獲得了轉基因棉花。花粉管通道法導入是利用微量注射器將DNA溶麻注入棉花受精子房，并收獲種子進行篩選鑒定而獲得轉基因棉花。具體操作程序為1)選擇次日將開放的花蕾進行自交，并用毛繩標記；2)在開花后20~24h左右，即開花次日，選擇果枝和花位專交好的幼子房作為導入對象，摘除或剝去花瓣，抹平花柱，使用50pL微量進樣器作為微注射工具，一般用右手持微量注射器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的約三分之二處，并后退至約三分之一處，輕輕操作微量注射器，將DNA溶液推入受精子房中。每朵花注射基因片段濃度為0.01lag/pl,每朵花注射5pi;3)未鈴柄基部涂抹40ppm的赤霉素溶液，以減輕幼鈴脫落；4)掛牌標記已經轉基因的棉花幼鈴；5)收獲種子，田間密植，根據選擇標記基因種類進行篩選鑒定，獲得轉基因棉花植抹。農桿菌介導法是本領域科研人員熟知的植物遺傳轉化方法。具體操作程序為1.菌林培養將所構建的殺蟲基因植物表達載體電激轉化到農桿菌菌抹LBA4404中，農桿菌單菌落接種于含卡那霉素(kanamycin,km)50mg/L、利福平(rifampicin,rif)25mg/L的LB或YEB液體培養基中。28。C振蕩暗培養過夜到細菌生長對數期。用LB或YEB液體培養基稀釋菌液，再振蕩培養46h,將菌液稀釋至OD600值0.3~0.35。2.無菌苗制備(1)棉花種子用硫酸(H2S04)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾千后用70%乙醇對種子進行表面消毒1min,再用10%~15%過氧化氫(11202)處理2~4h,用無菌水沖洗23次；(2)在無菌水中浸泡18-24h,待種子露白，再在無菌條件下剝去種皮，種入種苗培i基(l/2MS+瓊脂6g/L,pH6.8)中；(3)25。C28。C光培養35d時備用。3.棉花外植體與農桿菌的共培養取無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，浸入稀釋好的菌液中5~10min,然后取出胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養培養基上(MS+2.4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+瓊脂6g/L,pH5.0,表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。22。C25。C共培養2天。4.誘導愈傷組織及抗性愈傷組織的篩選(1)愈傷組織的誘導經共培養后的下胚軸段放入愈傷組織誘導培養基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+Km50~100mg/L+Cef500mg/L+葡萄糖30g/L,pH5.8),在常規條件下(25。C)培養2個月(一個月換一次相同的培養基)。(2)抗性愈傷組織的檢測無菌條件下挑取愈傷組織少許進行選擇標記基因甲///的ELISA檢測或報告基因g^的檢測，檢測結果為陽性的愈傷組織繼續繼代，非陽性的愈傷組織淘汰。通過對"^//或基因表達的檢測，獲得棉花抗性愈傷組織的頻率為50°/。~76%。5.愈傷組織的增殖繼代誘導出的抗性愈傷組織接入增殖培養基(MS培養基+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，常規條件下(25。C)培養，每隔一個月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉入增殖培養基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。6.愈傷組織的分化及轉基因苗移栽愈傷組織經繼代幾次后，有的愈傷組織轉成米粒狀顆粒，將其轉入分化培養基中(無NH4+、且KN03加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L十天門冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91~1.35g/L+Gelrite2.0~3.0g/L+葡萄糖20~30g/L，pH5.8),進一步分化成胚狀體，胚狀體長成為小植林后再轉入大的三角瓶中，待根長好后練苗移栽。洗去再生棉抹根部的培養基，栽到滅菌蛭石中，澆足營養液。栽好的再生棉苗放入控溫22。C、控濕80~85%的人工培養箱中5~7d，再在溫室中培養1020d后移栽到土盆或大田中。利用上述方法，分別將CwD724a及Cw7Qy24fl殺蟲基因植物表達載體導入棉花中獲得了轉基因棉花。圖20為獲得轉基因棉花植抹的情況說明，l為利用花粉管通道法將#/-/3/05-yV尸777-J必-C歷7C/丁iMa載體轉化棉花后，利用1000ppm卡那霉i在溫室篩選轉基因植抹的情況；2為非轉基因植林葉片卡那霉素處理后變黃；3為篩選獲得的轉基因植抹，葉片經卡那霉素處理后不變色；4為非轉基因植抹葉片50ppm草丁磷處理后萎縮受害情況；5為利用花粉管通道法將C/z7Cryi^a殺蟲基因植物表達載體#7-^y-J5^-(QzOy^a轉化棉花后，篩選到的轉基因植抹，利用50ppm草丁磷處理后葉片不受害。6為利用農桿菌介導法將C歷&r2^殺蟲基因植物表達載體#/-尸/305-AP77/-M5"-CfflCry^Ia轉入棉花后獲得的尚未移栽的抗卡那霉素轉基因棉花植林。SEQUENCELISTING<110〉創世紀轉基因技術有限公司<120>人工改造合成的殺蟲基因及其編碼的蛋白質與應用<160>7<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>l卯2<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaataacgttcttaattctggtagaactaccatttgtgatgcttataacgtggttgca60catgatcctttctcatttgaacacaagtctttggacactatccaaaaggagtggatggaa120tggaaaaggacagatcattcactttatgttgctcctgtggttggaactgtctcttccttc180ttgcttaagaaagttggttctcttattggaaagaggatcttgtcagaactttggggtatt240atctttccttctggttcaaccaatcttatgcaagacattcttagagagactgaacagttc300ttgaaccaaaggttgaatacagatactcttgctagagttaacgctgaacttattggattg360caagccaatattagagagttcaatcagcaagttgataactttcttaatcctactcaaaac420ccagttcctcttagcattacttcttcagtgaatacaatgcagcaacttttcttgaacaga480cttcctcaattccag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