細胞移植用臨床治療級真皮多能干細胞規模化制備培養方法
【專利摘要】本發明公開了臨床治療級真皮多能干細胞的培養、篩選、擴增技術，這些瓶頸一直是生物學干細胞領域研究熱點和難點，目前利用基底膜顯著黏附特性進行分離純化，采用三維培養擴增手段獲得。該發明適合依賴擴增貼壁型細胞并提供三維高擬體內細胞外基質系統進行目標細胞水平的篩選與分離。高模擬體內貼附環境，體外培養成體(胚胎皮膚)干細胞的生物細胞新培養技術。高模擬底物所在環境黏附篩選培養目標真皮多能干細胞，具有高傳代能力，高增殖能力，并可在體外環境下形成分化全層真皮結構。篩出免疫原性細胞安全獲得免疫逃逸，延長移植時間增加組織工程臨床應用，促進創面愈合與皮膚疾病提供了絕對優勢臨床治療級細胞的解決方案。
【專利說明】細胞移植用臨床治療級真皮多能干細胞規模化制備培養方 法 一、【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物干細胞技術，組織工程領域。涉及一種體外構建高模擬體內貼附 環境分離篩選，皮膚干細胞的培養、擴增技術。獲得臨床治療級真皮多能干細胞應用于組織 工程皮膚構建技術中的活性種子干細胞。
[0002] 二、【背景技術】介紹：
[0003] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調節 體溫維持個體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統組成的重要的一部 分，而皮膚細胞是構成這器官的基本單元，皮膚細胞基礎研究領域是揭示皮膚健康、發育、 預防、治療的重要科研途徑。
[0004] 細胞外基質（extracellular matrix,ECM)廣泛存在于細胞間隙的基本填充成分， 是細胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的極其重要場所。早期研究學者 認為.外基質只是一種組織內、細胞外的單純的支持結構。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發現填充組織間隙的膠原與促進成肌細胞轉化肌管的現象。并在兩年之后，得以證 明學者們才對這種穩定外物質微環境有了新的認識和思考。
[0005] Hay在11年后報道了 ECM對胚胎發育過程具有重要的誘導作用。ECM影響細胞行 為的現象得以關注并進行廣泛的研究，但是并沒有成型的理論基礎佐證ECM與細胞的密切 關系。直到1982年有學者提出證明并建立ECM與細胞骨架和核基質之間"動態互惠"的模 型。在這個模中，ECM分子與細胞表面受體互相作用，然后把信號通過細胞膜傳導進入細胞 漿中，引起從細胞骨架到細胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達。
[0006] 并證明這些基因的表達產物又可以反過來對ECM發生作用，今天的許多研究證實 了這個模型的合理性，并且證明細胞和ECM相互作用直接參與了細胞的黏附、生長、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過程；外基質參與調節細胞因子、生長因子的活性；還能夠直接 激活、啟動細胞內信號傳導機制。由于這種對細胞的調節和對信號的傳導作用。因此，我們 必須充分了解細胞外基質的化學的、物理的、生物學性質和功能及其在組織的形成和修復 中的作用，才能更好地應用這些生物材料構建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構架"。我們建立的高擬細胞外基質材料利用的恰是反向理論，指導我們深入開展對ECM 的認識，同時也反作用得到我們可利用的干細胞，這種研究模式促進學科前行及發展。
[0007] 皮膚干細胞在正常皮膚組織中含量極少，干細胞公認是一種在體內具有無限更新 能力，且可分化形成相應全層組織分化細胞，體外培養具有長期生長潛能并可形成無限克 隆。是愈合修復創面，皮膚更新代謝再生的重要參與者。但由于目前缺乏理想篩選方法，對 干細胞進行篩選及鑒定方法報道較少。
[0008] 三、皮膚干細胞名稱概述
[0009] 1981 年 Potten 提出，皮膚干細胞（skin stem cell)。表皮干細胞（epidermal sten cell，ESC)或角脫干細胞（Keratinocyte stem cell，KSC);真皮干細胞（dermis stem cell)、或真皮多能干細胞（dermal multipotent sten cell)或稱為皮膚前體細胞 (skin-derived precursor)ο
[0010] 真皮間充質細胞又叫真皮多能干細胞，來源于發育早期的中胚層和外胚層，具有 廣泛的分化潛能，可向多種中胚層和外胚層來源的組織細胞分化。近年來發現，這類細胞廣 泛存在于成熟個體的多種組織中，并已證實問充質干細胞存在于骨髓、肌肉、大腦、骨膜等 組織中。真皮多能干細胞在體外培養時能分化成神經元、神經纖維、肌肉、脂肪等多種細胞。 [0011] 真皮多能干細胞存在于真皮層內。其數量較少，周圍血供良好，營養豐富、所處微 環境具有優異性；在損傷或生長刺激等因素下可增殖，具有慢周期性；具有未分化細胞的 特征；自我更新增殖能力強；體外克隆能力突出等優勢細胞特征。創傷修復的再生重建重 要愈合干性細胞。
[0012] 四、真皮多能干細胞概述
[0013] 真皮中多能干細胞的研究起步較晚，對于它的生物學認識目前才剛剛開始，因而 真皮多能干細胞目前尚未統一定義。但現在的研究結果證實，這種間充質干細胞來源的真 皮多能干細胞在成體內參與皮膚的再生與修復過程.且皮膚創傷后造成的微環境對真皮 多能干細胞具有一定的調控作用，這可能是由于創傷后皮膚局部因子發生改變，促進了真 皮多能干細胞的遷移分化，從而加速了創傷的修復。因而，有人推測干細胞與微環境之間的 相互作用是其參與修復的生理基礎（Watt、Van、史春夢等.Shi等，2004)。真皮中多能干細 胞可作為真皮修復細胞的來源細胞，在毛囊和非毛囊的真皮中都有分布，但目前對其在真 皮內的具體定位尚不清楚。但越來越多的實驗結果表明，在毛囊的毛乳頭及毛囊真皮鞘中， 有具克隆性生長的成體干細胞分布，這些細胞具有一定的分化潛能，而在毛乳頭中富含更 多的真皮多能干細胞（Jahoda等，2003 ;Legue等· 2005)。
[0014] 由于真皮多能干細胞相對易于獲得，同時能進行多向分化，從而它在自體干細胞 基因治療方面有廣闊的基礎及臨床研究前景。
[0015] 五、真皮多能干細胞的特點
[0016] Toma等的研究結果表明，利用添加表皮生長因子（EGF)和堿性成纖維細胞生長因 子（bFGF)的培養液對分離得到的真皮多能干細胞進行體外培養，可形成球形克隆。目前的 資料顯示，真皮多能干細胞可在體外進行擴增培養，并能傳20代以上，具有強的增殖能力。 大量的實驗結果顯示=TGF-β抑制皮膚基底層角質形成細胞的增殖，但可促進成纖維細胞 的生長增殖。Yoko等研究證實在真皮多能干細胞的體外培養中添加 TGF-β，在保證細胞特 性穩定的前提下，可進一步促進真皮多能干細胞的增殖，TGF-β在真皮多能干細胞的增殖 過程中具有一定的作用。
[0017] 在添加一定的因子（如地塞米松、維生素 C、維A酸等）的分化誘導體系中培養，真 皮多能干細胞可向骨樣細胞、軟骨樣細胞、脂肪樣細胞、神經樣細胞進行分化，具有多向分 化潛能（Dyce等，2004)。Gorio等將分離的大鼠真皮多能干細胞在體外培養擴增后，再自體 移植入受損的脊索內.60?90d后觀察到移植的細胞依然存活，且分化為具有膠質細胞及 神經元細胞標志分子的細胞。研究結果表明，真皮多能干細胞可能具有異質性，含有一類小 體積但功能更為原始的細胞群，人們利用基因芯片方法檢測到真皮多能干細胞表達多種不 同細胞類型的特定轉錄因子，包括骨細胞、神經細胞、肌肉等，這可能是其多向分化潛能的 分子基礎。
[0018] 六、真皮多能干細胞的分離及鑒別
[0019] 對真皮多能干細胞多采用貼壁篩選的方法進行分離，同時利用這一方法并結合相 對特異標識分子、增殖活性、分化潛能等幾方面對真皮多能干細胞加以鑒定。
[0020] 目前常根據特異性表面分子標識物和無限更新分化能力有無的特點來鑒別干細 胞。現在對真皮多能干細胞的研究并未發現特異的表面標識物，但它能表達CD90、CD59、 CD44等表面分子，特別在于真皮多能干細胞可表達表達nes-tin，而與真皮成纖維細胞不 同的是它不表達波形絲蛋白，也無膠原分泌功能。
[0021] 真皮多能干細胞在有毛區和無毛區的真皮中均有分布。史春夢等通過貼壁法分離 培養了大鼠和人包皮的真皮多能干細胞，表現出多能分化潛能，經誘導可向成骨細胞及脂 肪細胞分化。近年來，國外學者也通過干細胞培養基，分離培養了不同年齡段的人體真皮多 能干細胞克隆；其在體外培養的克隆數、增殖能力的大小以及其分化能力，受年齡的影響。 目前雖對真皮多能干細胞的研究剛剛起步，但已有研究表明其在組織工程、基因治療及細 胞治療等方面具有潛在的應用前景。
[0022] 七、傳統篩分方法介紹
[0023] 因為皮膚干細胞對基底膜有較強的粘附性，對細胞胞外基質的粘附速度要比其它 類型細胞快得多，所以利用該種特性進行培養篩選。目前傳統的皮膚干細胞篩選如下闡 述：
[0024] 方法一（3T3滋養層法）：人類皮膚細胞體外培養研究已有一個世紀的歷史背景， 建立體外擴增培養體系于1975年由學者Rheinwald和Green所設計3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細胞株3T3滋養層細胞，并用γ射線致死劑量照射，防止干細胞受到異種物種的影 響。滅活3T3滋養層細胞作為培養皮膚細胞的滋養層能促進皮膚細胞篩選的貼附和生長， 并具有未被論證的接觸性抑制成纖維細胞生長的功能。實驗室所選用的、功能較穩定的各 亞系但還不能完全排除對它的顧慮，還需繼續觀察和探索有效的替代方法。Green研究這種 方法的3T3雖然它是一個異種的具有問變性質的細胞，有不少實驗室曾試圖用其他措施予 以取代，但至今為止，它的效果在各種方法中仍是最有效的，繼續被廣泛應用。從第1例臨 床應用至令已近30年，尚未發現因它而造成的不良后果。
[0025] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）=Graziella P學者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質分離皮膚細胞；
[0026] 方法三（IV型膠原黏附法）Jone PH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經消 化，利用IV型膠原做底物基質分離皮膚細胞，所選用底物為異種膠原，存在不同種屬的污 染可能性，并且底物昂貴，不適合產業化規模或長期培養，適合試驗性小劑量研究；
[0027] 方法四（流式細胞儀篩選法）：學者Van Rossum麗j與Kaur P等從人小塊活檢 組織中得到角朊細胞，利用整合素標記異性標志物利用流式細胞儀分離干細胞，選用方法 復雜且技術要求高，大體應用integrinii 1，細胞黏附分子CD49,增列細胞核抗原（PCNA)等 多種標記進行特征分離，雖然干細胞得以篩選，但是會留有標記物標記滯留干細胞無法有 效去除，存在是否影響干細胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標記鑒定測定干細胞，并不 適合臨床應用的干細胞富集方法；
[0028] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學者Hagar B利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細 胞條件培養液作為培養基，不用滋養層細胞。但有研究報導表皮干細胞與基底膜脫離可誘 發進入分化周期，分化為過渡性擴充細胞，據猜想皮膚細胞與基底膜的高粘附性有可能是 維持皮膚細胞控制分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養層，有可能長期培養過程中 皮膚細胞分化引起后續研究的不可控發展；
[0029] 方法六（同體成纖維貼附篩選法）：學者金巖等利用參考改進學者Hagar B和 Dunnwald鼠成纖維細胞，改成供體預先體外擴增的成纖維細胞為附著底物作為滋養層，培 養同體皮膚細胞，但是專利并沒有明確如何制備滋養層平皿的詳細步驟，鋪皿周期短，成纖 維貼壁力低，篩選反復PBS清洗純化過程會損失部分培養的目標貼附成功的成纖維細胞， 從而降低目標干細胞的得率，皮膚細胞理論上具有同體同原性，另一技術問題在于，兩種細 胞在共有同一培養環境應考慮培養液的復雜性，兩種細胞可能出現競爭性的生長增殖抑制 等現象，后續分離皮膚細胞存在技術難度，并不能優于現有的六中常見方法，建議其可把此 方法改成復方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增加目標細胞得率， 或滅活成纖維鋪皿層細胞。
[0030] 方法七（甲基纖維素培養皿貼附篩選法）：國外學者利用添加甲基纖維素，用含 2% B27的DMEN/F12進行真皮多能干細胞培養。甲基纖維素易被微生物破壞而腐敗，并且 該方法制備培養基溶液粘度加大不利于細胞自由伸展擴增。影響相鄰細胞間的融合物質交 換如營養物質，氣體交換等，諸多不確定不利因素。并且該無機材料不被機體吸收代謝，培 養過程中引入不易清除，不適于臨床治療級細胞要求。
[0031] 綜上所述，真皮多能干細胞對細胞外基質的黏附強快速特性，體外篩選培養的人 真皮多能干細胞得以在國內外方法特異性快速發展。而真皮多能干細胞生物學性能，可 以做到增進功能、本發明避免潛在有害基因及對真皮多能干細胞污染，在基礎科研、臨床治 療、干細胞研究方向、皮膚再生損傷修復、高擬組織工程皮膚的構建方面等均有歷史時期的 重要不可取代的指導意義。
[0032] 八、組織工程皮膚背景介紹
[0033] 再生組織工程細胞建立系工作始于本世紀（Harrison 1907, Carrel 1912)，指導 引領著生物學，臨床醫學材料等各大銜接領域，成為重要的基礎科學之一。組織構建和細胞 體外培養是至關重要的課題。從供體捐獻者活體取組織，模擬體內生理環境等系列特定體 外微環境體系，進行孵化培養、使得組織細胞健康生長。
[0034] 組織工程皮膚建立早期應用于修復燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領域，麻省總醫 院的John F. Burke與MIT的Yannas I.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細胞生物學相關，隸屬于組織工程皮膚支架材料學范疇。隨著細胞生物 學的基礎學科發展，人們開始整合兩大學科，共同協作解決創傷皮膚修復構建，真正的含活 性細胞組織工程皮膚在哈福大學Honward Green與MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學醫學介矚目關注。
[0035] 20世紀80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網格組成的復合皮膚移植材 料被創造出來，內層為牛膠原和硫酸軟骨素構成，外層為硅膠樹脂，創面移植后內層與創面 接觸被緩慢降解，數周后硅樹脂層移除，清創后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0036] MIT的科學家Bellhe把材料學和生物學完美結合創造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科學界商人的典范。這家活性組 織工程皮膚先驅引領公司仍然是在人工皮膚市場占有率最高的組織工程公司之一。
[0037] 1997年通過美國FDA批準上市的第一個組織工程產品由Advanced Bionhealing 公司生產的TransCyte。用于燒傷創面修復治療。該產品屬于膠原支架材料種植滅活性 的纖維細胞，成為商業化的第一個"異體無活性細胞組織工程真皮療法"。Dermagraft和 Integra以及Organogenesis Inc制造的Apligraf也獲得FDA批準，利用新生兒包皮經生 物學體外培養活性細胞，制備的組織工程皮膚，用于潰瘍皮膚和大面積燒傷再生治療。該產 品是嚴格意義上具有類皮膚組織工程人工皮膚，含活性4?8傳代的細胞并具有完整表皮 真皮細胞構建在組織工程支架之上可降解全層人工皮膚。并且部分剔除減少朗格漢斯細 胞，降低了受體的免疫排斥反應，無活性的死亡細胞經過創面組織液及相關體液因子代謝 的作用被分解可用于創面修復的小分子片段基礎營養愈合物質被創面吸收利用。這種產品 制成后置于_70°C保存，37°C迅速復蘇，復蘇后有50%的活性細胞具有活性，活性維持5天 通過快遞郵寄到指定的醫療部門。
[0038] 這些產品的市場準入引領了嶄新的再生醫學組織工程皮膚時代開創。
[0039] 基于國內國際組織工程人工皮膚現狀，建立組織工程皮膚干細胞-高擬體內細胞 外基質，基質附著體外篩選方法設計首例含有表皮干細胞與真皮多能干細胞的全層組織工 程人工皮膚產業化產品。
【發明內容】
[0040] 1. -種用于篩選和培養真皮多能干細胞的培養基組合，
[0041] 配制培養液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 B40. 5? I X 1(T4/L、維生素 Cl?3 μ g/ml、胰島素2?4ug/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、維生素 Cl? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml。
[0042] 配制培養液B :滅活胎牛血清80ml、轉鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 維生素 B40. 5 ?I X 1CT4/L、霍亂霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰島素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干細胞生長因子（SCF)5?40ng/ml、 氫化可的松〇. 3yg/ml、商用培養基DMEM與商用培養基F12(l : 1)定容到SOOmLPH?. 2? 7. 4。
[0043] 配制培養液C :滅活胎牛血清60ml、轉鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 維生素 B40. 5 ?I X 10 4/L、膜島素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGFlO ?18ng/ml、牛 腦垂體提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干細胞生長因子（SCF) 15?40ng/ml、氫化可的松0. 3 μ g/ 1111、商用培養基01^]?與商用培養基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
[0044] 2. -種制備高擬體內細胞外基質的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處 理；b)脫細胞處理；優選地，還進一步包括將消毒或經脫細胞處理的皮膚進一步進行低溫、 脫水、輻照滅菌處理；更優選地步驟b)的脫細胞方法選自冷酶交聯劑法、酶-非離子表面活 性劑-絡合劑聯合法、絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯合EDTA交聯液法。
[0045] 3.權利要求2所述方法，其中冷酶交聯劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷 消12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，PH在7. 20?7. 40之間，交聯4?6h，超 純水或注射用水沖洗8?10次。
[0046] 4.權利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡合劑聯合法是：0. 1? 0· 25%中性蛋白酶與0· 01?0· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用 24 ?48h。
[0047] 5.權利要求2所述方法，其中絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0. 01? 0·02%EDTA含0·6?0·8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0·2?0·5%SDS 溶液，室溫下作用30?60min)。
[0048] 6.權利要求2所述方法，其中胰酶聯合EDTA交聯液是：0. 25?0. 40%胰蛋白酶 和0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯液中交聯4?6h。交聯 后用超純水或注射用水沖洗8?10次。
[0049] 7.由權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內細胞外基質。
[0050] 8.權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內細胞外基質或者權利要求7所述的 高擬體內細胞外基質在篩選皮膚干細胞中的用途。
[0051] 9. 一種利用權利要求1所述的培養基組合和權利要求7所述的高擬體內細胞外基 質篩選和培養真皮多能干細胞的方法，包括：
[0052] a)制備真皮多能干細胞懸液：取材，消化，用權利要求1所述的培養液A終止消 化，剝離表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集細胞混懸液。離心后加入培養液A養 液；
[0053] b)真皮多能干細胞的篩選及培養：將權利要求7所述的高擬體內細胞外基質加入 權利要求1所述的培養液B，加入步驟a)制備的細胞懸液，培養，清洗，目標真皮多能干細胞 貼壁粘附于高擬體內細胞外基質，加入權利要求1所述的培養液C進行擴增培養；
[0054] c)消化富集傳代培養：消化，離心后加入權利要求1所述的培養液C進行擴增培 養。
[0055] 優選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細胞，免疫逃逸方法可以為射線法、 低溫凍融法
【專利附圖】
【附圖說明】
[0056] 圖1高擬體內細胞外基質制備流程
[0057] 圖2細胞篩選培養
[0058] -、高擬體內細胞外基質種類
[0059] (涉及的皮膚均為器官捐獻，包皮環切皮膚、以及醫療救治過程中植皮取皮廢棄皮 膚組織）
[0060] 1. 1其特征在于：針對本發明技術的發展現狀，本發明的目的是提供一種高擬體 內真皮層作為細胞外基質為篩選貼附，成體或胚胎皮膚真皮多能干細胞篩選分離和體外培 養的方法，并使獲得的高純度真皮多能干細胞。
[0061] 1.2其特征在于：針對本發明技術的發展現狀，本發明的目的是提供一種高擬體 內全層皮膚作為為細胞外基質為篩選貼附，成體或胚胎皮膚皮膚干細胞篩選分離和體外培 養的方法，并使獲得的高純度皮膚干細胞。皮膚細胞包括：（真皮多能干細胞、毛囊干細胞、 表皮干細胞、及其它皮膚附件附屬相關的干細胞及皮膚相關細胞）。
[0062] 這種篩選分離和體外培養的方法，獲得的真皮多能干細胞細胞克服以上傳統七種 方法的缺陷。
[0063] 發明屬生物成體（胎兒）干細胞細胞【技術領域】，涉及真皮多能干細胞的分離與培 養方法。方法特征包括：同體表皮、真皮、全層脫細胞表皮底物預備；同體真皮細胞的分離； 利用高擬體內附著基質真皮多能干細胞的篩選及培養。目前用該法在體外已穩定培養傳代 超過20?30 (代），經體內外實驗證實該細胞無細胞毒，具有強的增殖能力，并可以形成成 熟的全層分化真皮層結構為有關皮膚干細胞在科研、教學及臨床的應用起到不可估量的作 用，同時孕育著巨大學術方向與社會效益和經濟效益。通過此種方法理論基礎推進我國其 他干細胞的學術基礎建立。
[0064] 二、高擬擬體內細胞基質構成：
[0065] 經分析含有多種膠原并包含IV型、其中I型膠原含量最大（I與III型膠原的比 例為10 : 1)，同時還保留了完整的基底膜結構。
[0066] 三、高擬體內細胞基質底物孔隙率與黏附表面特征：
[0067] 高擬底物電鏡觀察，測定表皮黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32? 145um，促進黏附真皮組織再生底物基底膜多孔孔隙直徑為72?191 μ m。這種孔隙率所購 建的空間黏附表面均有利干細胞黏附附著生長、增殖、分化。
[0068] 通過以上制備方法；有效的保留了皮膚細胞外基質的微觀構架和完整的基底膜結 構，其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質成分，可為真 皮干細胞等快速粘附、表皮干細胞、增殖擴展提供有力的支持。因此，高擬底物是目前最理 想的組織工程皮膚干細胞篩選的解決方案。
[0069] 四、皮膚干細胞高擬擬體內細胞基質制備具體實施步驟與方法：
[0070] 一、包括以下兩個步驟種方法：
[0071] 步驟一：皮膚消毒處理過程：取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、頭 皮、腋下皮膚、及軀干皮膚均可）含表皮真皮結構的斷層皮膚，剪切成組織塊浸泡在生理鹽 水稀釋含〇. 05?0. 1 %苯扎溴銨溶液中10?15min，消毒處理，用無菌生理鹽水反復沖洗 殘余苯扎溴銨。
[0072] 步驟二：低溫-60?-80°C冷凍干燥，真空度達到20?llOpa，脫去組織塊90? 95%以上水分，取出密封與真空包裝，經輻照25?60KGY劑量滅菌。終品可以在室溫中保 存長達5年。啟動只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營養液復蘇15?30min即可應用，浸 泡延長至10?12h效果更佳。使用后并且應用去細胞漂洗液（見下方法中相應提及適合 的脫細胞液）脫細胞處理、再經過上述過程永生反復使用的特點。
[0073] 1 :步驟二【具體實施方式】：
[0074]
【權利要求】
1. 一種用于篩選和培養真皮多能干細胞的培養基組合， 配制培養液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 B40. 5? 1X1(T4/L、維生素 C1?3μ g/ml、胰島素2?4μ g/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、維生素 C1? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml〇 配制培養液B :滅活胎牛血清80ml、轉鐵蛋白6?17μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、維 生素 B40. 5 ?1XKTVL、霍亂霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰島素 4 ?6μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干細胞生長因子（SCF)5?40ng/ml、 氫化可的松〇. 3yg/ml、商用培養基DMEM與商用培養基F12(l : 1)定容到δΟΟπιΚΡΗ?. 2? 7. 4。 配制培養液C :滅活胎牛血清60ml、轉鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、維生 素 B40. 5 ?1 X 10 4/L、膜島素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛腦垂體 提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干細胞生長因子（SCF) 15?40ng/ml、氫化可的松0. 3 μ g/ml、商用 培養基〇1^]?與商用培養基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
2. -種制備高擬體內細胞外基質的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處理；b) 脫細胞處理；優選地，還進一步包括將消毒或經脫細胞處理的皮膚進一步進行低溫、脫水、 輻照滅菌處理；更優選地步驟b)的脫細胞方法選自冷酶交聯劑法、酶-非離子表面活性 劑-絡合劑聯合法、絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯合EDTA交聯液法。
3. 權利要求2所述方法，其中冷酶交聯劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷消 12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，PH在7. 20?7. 40之間，交聯4?6h，超純 水或注射用水沖洗8?10次。
4. 權利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡合劑聯合法是：0. 1?0. 25% 中性蛋白酶與〇· 01?〇· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用24? 48h。
5. 權利要求2所述方法，其中絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0. 01?0. 02% EDTA含0. 6?0. 8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0. 2?0. 5% SDS溶液， 室溫下作用30?60min)。
6. 權利要求2所述方法，其中胰酶聯合EDTA交聯液是：0. 25?0. 40 %胰蛋白酶和 0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯液中交聯4?6h。交聯后用 超純水或注射用水沖洗8?10次。
7. 由權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內細胞外基質。
8. 權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內細胞外基質或者權利要求7所述的高擬 體內細胞外基質在篩選皮膚干細胞中的用途。
9. 一種利用權利要求1所述的培養基組合和權利要求7所述的高擬體內細胞外基質篩 選和培養真皮多能干細胞的方法，包括： a) 制備真皮多能干細胞懸液：取材，消化，用權利要求1所述的培養液A終止消化，剝 離表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集細胞混懸液。離心后加入培養液A養液； b) 真皮多能干細胞的篩選及培養：將權利要求7所述的高擬體內細胞外基質加入權利 要求1所述的培養液B，加入步驟a)制備的細胞懸液，培養，清洗，目標真皮多能干細胞貼壁 粘附于高擬體內細胞外基質，加入權利要求1所述的培養液c進行擴增培養； C)消化富集傳代培養：消化，離心后加入權利要求1所述的培養液C進行擴增培養。 優選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細胞，免疫逃逸方法可以為射線法、低溫 凍融法。
【文檔編號】C12N5/074GK104263699SQ201410482325
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月19日 優先權日:2014年9月19日
【發明者】朱寧文, 王凌儀 申請人:江蘇華億細胞組織工程有限公司