一種培育高抗tylcv番茄的方法
【專利摘要】本發明公開了一種培育高抗TYLCV番茄的方法，具體是選擇TYLCV基因組中AV1基因、AC1基因和AC3基因的片段嵌合得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3，并構建回文序列的干擾載體RNAi；通過農桿菌介導在番茄子葉中瞬時表達dsRNA，得到轉化多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉基因番茄；轉基因番茄經過TYLCV的系統侵染后表現為對TYLCV抗性，未觀察到明顯的發病癥狀，具有高抗TYLCV性能，從而篩選出高抗TYLCV番茄。本發明可在2個月內快速篩選和培育出高抗TYLCV番茄株系，大大縮短了培育周期，為防治TYLCV提供了技術支持。
【專利說明】-種培育高抗TYLCV番茄的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種培育高抗TYLCV番茄的方法。
【背景技術】
[0002] 番爺黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)屬于雙生病毒科 (Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus)，是植物病毒中唯--類具有孿生 顆粒形態的單鏈環狀DNA(single stranded DNA，ssDNA)病毒。TYLCV基因組編碼六個ORF : 在病毒鏈上的AVl和AV2,在互補鏈上的AC1、AC2、AC3和AC4。AVl編碼的是病毒的外殼蛋 白（coat protein，CP)，與病毒的包殼、介體傳播及與寄主互作相關；AV2編碼是移動蛋白 (move protein, MP)相關的蛋白，主要起到協助移動蛋白的功能；ACl編碼病毒復制相關蛋 白（replication-associated protein, Rep)，參與病毒基因組DNA的復制起始；AC2編碼的 蛋白是一個轉錄激活子（transcriptional activator, TrA)，該蛋白能激活DNA-A和DNA-B 病毒鏈上的基因轉錄；AC3編碼一個復制增強蛋白（replication enhancer protein, REn)， 但對病毒侵染力不起決定作用）；AC4編碼的蛋白參與病毒的復制或轉錄調控。
[0003] TYLCV病發病癥狀主要表現為：頂端葉片邊緣黃化且上卷，葉脈間葉肉發黃，植株 上部葉片變小，整個葉片萎縮，褶皺，植株生長變緩或停滯，節間縮短，明顯矮化，致使產量 和質量降低。1991年，我國首次在廣西南寧發現該病毒。從2006年起，該病毒在北京、山 西、江蘇、上海、廣東、廣西、云南等地相繼發現，并對當地的番茄生產造成了巨大的損失。
[0004] 預防為主、防治結合是防治番茄黃化曲葉病毒病的主要原則，目前主要通過調整 栽培結構、防治煙粉虱、加強田間管理以及選用抗病品種等措施對該病進行綜合防治。但這 些方法成本高、效果不夠理想，有時甚至會給環境帶來負面影響，而進行抗病品種選育是最 有效的途徑之一。在TYLCV的抗病性育種方面，國外研究的比較早，目前國外一些國家的科 研人員已經以野生抗病番茄品系為材料，通過雜交選育和基因工程得到了一些抗病或耐病 的商業品種。
[0005] 但傳統的雜交育種艱苦費時，從而大大限制了育種工作的進展。與之相比，基因工 程育種具有明顯的優越性：1)育種周期短；2)適用范圍廣，尤其適用于傳統育種因缺乏抗 原而難以進行的抗CMV育種；3)在育種過程中不會引入其它不良農藝性狀的基因等。因此， 基因工程在番茄抗病毒病育種中的應用日益受到人們的重視。當前，番茄抗病毒病基因工 程主要采用轉病毒外殼蛋白（CP)基因的方法，獲得了轉煙草花葉病毒外殼蛋白基因番茄， 培育出了能穩定遺傳的抗病毒植株。除病毒的外殼蛋白基因外，目前在番茄上主要采用衛 星RNA、反義RNA以及RNAi等方法獲得不同程度的抗病毒番茄。
[0006] 目前，轉基因的大部分的注意力都集中于單個的ACl蛋白、AVl蛋白或干擾TYLCV 在番茄內的復制、轉移的其它蛋白基因。這種轉基因的方法獲得的高抗轉基因植物的幾率 較小，且該策略還存在異源重組等生態安全性的問題。RNA沉默機制的發現和應用，為抗病 毒基因工程提供了新的途徑，該方面的研究在國際、國內已經廣泛深入進行。但是，所有抗 TYLCV的商業雜交種均為單個抗性基因導入，當TYLCV大規模發生時，它們的抗病能力有限 甚至下降，仍會造成嚴重的經濟損失。為保障我國番茄產業可持續發展，促進菜農增產增 收，進行更高抗TYLCV的番茄新品種的研究選育工作刻不容緩。
[0007] 有研究表明，通過聚合不同抗源的基因以提高植物對多種病毒的抗性是提高一個 品種抗病能力的重要策略之一。2005年，白慶榮等在煙草中轉入PVX-CP和PVY-CP嵌合基 因并獲得了 6株對兩種病毒免疫的轉基因株系；2008年，朱常香等獲得了同時對PVY、TMV 和CMV這3種病毒都有抗性的煙草；2011年，牛顏冰等獲得同時對兩種病毒（TMV和CMV)免 疫的轉基因煙草；至今為止，國內外尚未有關利用基因技術聚合同一抗源的不同基因來提 高植物對特定病毒高抗性的研究報道，因此進行高抗TYLCV番茄新品系的多嵌合基因沉默 技術及相關研究具有重大意義。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種培育高抗TYLCV番茄的方法，針對目前TYLCV對番茄的 產量和質量的嚴重危害，采用基因瞬時表達來快速篩選并培育對TYLCV具有高抗性的高抗 TYLCV番茄，大大縮短篩選周期。
[0009] 為了達到上述目的，本發明的技術方案如下：
[0010] 一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合 體AV1-AC1-AC3,并構建反向重復序列的RNAi載體；其中，AVUACl和AC3基因片段的核苷 酸序列分別如SEQIDNo·l，SEQIDNo·2和SEQIDNo·3所示，多基因嵌合體AVl-ACl-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0012] 2)利用農桿菌介導法將RNAi載體在番茄上瞬時表達得到轉化多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3的轉基因番茄。
[0013] 3)轉基因番茄經過TYLCV系統性侵染、鑒定抗病性，獲取對TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
[0014] 一種快速篩選并培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：
[0015] 1)以感病番茄中提取的總DNA為模板，利用三對引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分別進行PCR擴增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVI、ACl 和AC3基因片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；弓丨 物 AV1F/AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具體為：
[0016] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0017] AVlR：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0018] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0019] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0020] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0021] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0022] 2)將如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示的 PCR 產物混合，以 引物AVlF和AClR進行PCR擴增，得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合體AV1-AC1-AC3與載體pGEM-T Easy Vector連接，得到質粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0023] 3)使用限制性內切酶XbaI和BamHI雙酶切質粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl，將酶切片段和載體進行連接，得到重組質粒pBluescript II SK (-)-AV1-AC1-AC3-RTM1。
[0024] 4)使用限制性內切酶SacI和NotI雙酶切質粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和質粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,將酶切片段和載體進行連接，得到 重組質粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r)。
[0025] 5)將構建的干擾片段AV1-AC1-AC3從重組質粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達載體 PBIN19 上，構建 RNAi 載體 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0026] 6)通過農桿菌介導法將RNAi載體pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)注射到2-3葉期苗 齡的番茄幼苗，注射20d后，用含有TYLCV侵染質粒的農桿菌侵染番茄植株，將TYLCV基因 組導入番茄植株內；通過提取番茄DNA、斑點雜交檢測TYLCV含量來篩選對TYLCV具有抗性 的高抗TYLCV番茄。
[0027] 本發明所述培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的應用。
[0028] 本發明轉化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉基因番茄經含有TYLCV侵染質粒 的農桿菌接種到番茄植株進行傳毒，接種5周后其葉片生長正常，沒有感染TYLCV的癥狀， 在其葉片中也沒有檢測到TYLCV，說明轉化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉基因番茄對 TYLCV具有高抗性，從而篩選并培育出對TYLCV具有高抗性的高抗TYLCV的轉基因番茄。
[0029] 本發明的有益效果：
[0030] 本發明利用TYLCV基因組中AVI、ACl和AC3基因片段擴增出如SEQ ID NO. 4所 示的多基因嵌合體AV1-AC1-AC3,并構建了專用于番茄的瞬時表達RNAi載體，將其在番茄 上瞬時表達得到轉化多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉基因番茄，轉基因番茄再經過TYLCV 系統性侵染、鑒定抗病性，獲取高抗TYLCV番茄，可以在2個月內篩選并培育具有優良高抗 TYLCV的轉基因番茄，大大縮短番茄的育種周期，為防治TYLCV提供了技術支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明多基因嵌合的RNAi載體T-DNA區域的構建流程圖；
[0032] 圖2為本發明嵌合基因瞬轉番茄的PCR檢測結果，其中，M :DNA marker ; 1-8 :嵌合 基因瞬轉番茄；
[0033] 圖3為本發明TYLCV侵染沒有轉化的番茄的葉片照片；
[0034] 圖4為本發明TYLCV侵染轉化空載的番茄的葉片照片；
[0035] 圖5為本發明TYLCV侵染轉化多基因嵌合體的番茄的葉片照片；
[0036] 圖6為本發明轉基因番茄體內TYLCV的檢測結果，其中，1 :接種TYLCV的沒有轉化 的番茄；2 :轉化嵌合基因的番茄；3 :沒有接種TYLCV的沒有轉化的番茄。
【具體實施方式】
[0037] 以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明的技術方案 而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理 解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范 圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0038] 本發明所用的試劑和材料若未經說明，均購自西格瑪一奧德里奇（Sigma - Aldrich)公司。
[0039] 本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學出版社。）
[0040] 實施例ITYLCV的AVI，ACl和AC3基因片段的RNAi載體構建
[0041] 三基因片段嵌合基因的RNAi載體的構建流程如圖1所示，主要步驟如下：
[0042] I. 1感病番茄的基因組DNA提取
[0043] 本實施例采取改良的CTAB法提取番茄葉片基因組DNA。具體實驗步驟如下：稱取 2g感病的番茄葉片放入_20°C預冷的研缽中，加入適量液氮，而后迅速將葉片研成粉末。研 磨完后將粉末裝入I. 5mL的EP管中；在EP管中加入600 μ L 2% CTAB溶液（60°C預熱）， 振蕩混勻，60°C水浴15min ;加入300μ L氯仿，輕微振蕩，放入4°C離心機中13, OOOrpm,離 心5min。將上清轉移至另一新I. 5mLEP管中；加入等體積的25:24:1的苯酚/氯仿/異戊 醇，輕微振蕩，放入4<€離心機中13,000印111，離心51]1；[11。將上清轉移至另一新1.51]11^?管 中；加等體積（600 μ L)異丙醇，輕微搖勻，在-20°C冰箱沉淀不少于30min;將沉淀后的EP 管13, OOOrpm離心lOmin。棄上清后，用75%的乙醇將沉淀出的DNA洗滌2次；待乙醇蒸發 干后，向EP管中加入50 μ L TE緩沖液溶解DNA ;加入2 μ L的RNase，混勻后放入37°C水浴 lh，放-20°C冰箱備用。
[0044] I. 2PCR分別擴增AVI，ACl和AC3基因片段
[0045] 引物如下所示：
[0046] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0047] AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0048] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0049] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0050] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0051] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0052] 以感病番茄中提取的基因組DNA為模板，分別以引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分別擴增3個目的片段AVI，ACl和AC3。所述目的片段AVI，ACl和AC3的核苷 酸序列分別如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示。
[0053] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，（94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30個循環，72°C繼續延伸5min。I. 0 %瓊脂糖凝膠電泳分離并使用DNA凝膠回收試劑 盒（Axygen公司）回收目的片段AVI，ACl和AC3。
[0054] I. 3PCR 擴增嵌合基因 AV1-AC1-AC3
[0055] 將1. 2擴增的目的片段AVI，ACl和AC3混合做模板，以AVlF和AClR作為引物進 行PCR擴增。PCR反應條件為：94°C預變性5min，（95°C變性60sec，55°C退火IOsec) 7個循 環，72°C繼續延伸 2min，（94°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30 個循環，72°C 繼續延伸lOmin。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離并使用DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）回 收嵌合基因片段AV1-AC1-AC3，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。回收的AV1-AC1-AC3片 段，連接到pGEM-T vector中。連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，涂板。次日挑取大腸桿菌菌 落，培養過夜后抽取質粒，命名為PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0056] L 4 克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl 的構建
[0057] 引物如下所示：
[0058] Fl：GCTCTAGATAGGACCTGTAGGGAAGC
[0059] Rl：GCGCGGCCGCACGCCATGAGATAGAAAA
[0060] 按照I. 1的方法提取擬南芥的基因組DNA，按照I. 2的方法，使用引物Fl和Rl 擴增120bp的RTMl基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，按照1. 3的方法獲取 pGEM-T-RTMl。以pBluescript II SK(-)為出發克隆載體，將含有克隆載體pBluescript II SK(-)的大腸桿菌菌液以及含有質粒pGEM-T-RTMl的大腸桿菌菌液接種到1.6mL LB液 體培養基（含有氨卞霉素）中，37°C，220rpm振蕩培養過夜，次日提取質粒。限制性內切酶 XbaI和NotI雙酶切質粒pBluescript II SK (-)和質粒pGEM-T-RTMl，瓊脂糖凝膠電泳回 收目的片段RTMl和載體片段pBluescript II SK (_)。將載體片段pBluescript II SK (-) 和目的片段1^￥1，41：連接過夜，產物轉化到大腸桿菌0冊〇感受態細胞中，加入80(^1^ SOC液體培養基震蕩培養2h后，涂在加入氨卞霉素的LB固體平板上，37°C培養過夜。挑取 平板上的單菌落接種到LB液體培養基中（含有氨卞霉素），37°C震蕩培養過夜，次日提取 質粒進行XbaI和NotI雙酶切鑒定。酶切結果正確表明目的片段RTMl已正確連接到載體 pBluescript II SK(-)上，重組質粒命名為 pBluescript II SK(-)-RTMl。
[0061] 1. 5嵌合基因正向片段的構建
[0062] 使用限制性內切酶XbaI和BamHI雙酶切質粒pBluescript II SK(_)-RTMl和質粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3,連接，轉化，及重組質粒的鑒定。方法同1.4。酶切結果正確表明AC3 正向片段已正確連接到載體pBluescript II SK(-)-RTMl上，重組質粒命名為pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl。
[0063] 1.6嵌合基因反向片段的構建
[0064] 使用限制性內切酶SacI和NotI雙酶切質粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和質粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,連接，轉化，及重組質粒的鑒定。方 法同1.4。酶切結果正確表明AV-AC1-AC3反向片段已正確連接到載體pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3-RTMl 上，重組質粒命名為 pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0065] I. 7RNAi植物表達載體的構建
[0066] 將構建的干擾片段AV1-AC1-AC3從克隆載體pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達載體PBIN19,轉化，及重組質粒的鑒定。方法同1.4。酶切結果正確表明AV1-AC1-AC3反 向重復片段已正確連接到載體PBIN19上，重組質粒命名為pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0067] 實施例2農桿菌介導法瞬轉番茄
[0068] 2. 1農桿菌EHA105感受態細胞的制備
[0069] 挑取農桿菌EHA105在含有25 μ g/mL利福平的YEP固體平板劃線，28 °C培養 36-48h ;挑取單菌落接種于2mLYEP培養基中，28°C，200rpm培養過夜；2mL菌液接種到 50mLYEP 培養基中繼續培養 6-8h，至 0D600 = 0. 5,冰浴 IOmin ;4°C，7, OOOrpm 離心 5min，棄 上清，將菌體重懸于5mL 20mM CaC12溶液中；4°C，7,000rpm離心Imin,棄上清，菌體用ImL 20mM預冷的CaC12輕輕懸浮，每管100 μ L分裝，液氮速凍，-80°C保存備用。
[0070] 注：實驗中所有接觸空氣的步驟均在超凈臺操作，NaCl和CaC12配制完成后121°C 滅菌20min備用。
[0071] 2. 2RNAi載體轉化農桿菌
[0072] 將5 μ L重組質粒pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)加入到100 μ L農桿菌感受態細 胞中，輕輕吹吸混勻；將轉化的感受態放入液氮中冷凍lmin，取出后水浴鍋中37°C水浴 15min ;離心管中加入800 μ L無抗性YEP液體培養基，28°C，200rpm培養3h ;8, OOOrpm離心 lmin，棄掉大部分上清，剩余100 μ L重懸菌體，涂布在加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利 福平的YEP固體平板上，28 °C培養36h ;待平板上長出單菌落后，挑取單菌落接種到2mL加 入卡那霉素和利福平的YEP液體培養基中繼續培養過夜；使用菌液PCR對農桿菌進行鑒定。 使用引物Fl和Rl擴增，當目的片段長度為120bp時，則檢測結果正確。結果正確的用于農 桿菌介導的瞬時表達實驗。
[0073] 2. 3農桿菌瞬轉番茄
[0074] 將結果正確的農桿菌菌液接種到含2mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平 的YEP液體培養基的試管中，28°C，200rpm震蕩培養約20h，使菌液0D600 = 0. 6左右；將 搖培的菌液轉入含50mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP液體培養基的錐形 瓶中擴大培養4-7h，檢測菌液濃度0D600 = 0. 6左右；離心搖培的菌液，收集菌體，使用農 桿菌侵潤緩沖液將菌體稀釋至0D600 = 2. 0左右，室溫放置2h，即可用于侵染番茄植株；使 用無菌注射器的針頭在番茄植株已完全展開的第二片或第三片葉子上劃出傷口，傷口不宜 過大，不要扎透葉片，只需稍微劃破上表皮即可，注射器針筒吸取準備好的農桿菌侵染液， 以手指墊住番茄葉片傷口的背面，針筒對準傷口靠壓力將侵染液注入到葉片兩個分葉脈之 間。含不同轉化載體的農桿菌需用不同的注射器，同時對部分植株注射含空載體的菌液，作 為陰性對照。
[0075] 2. 4瞬轉番茄的PCR檢測
[0076] 攜帶抗病毒載體的農桿菌侵染番爺植株一周后，隨機挑選其中8株番爺，按照I. 1 的方法提取注射葉片的總DNA，按照1. 2的方法進行轉化片段的PCR檢測，使用的引物為 AV1AC1AC3F和AV1AC1AC3R。檢測結果如圖2所示，泳道M為DNA標記，泳道1-8為隨機 所選的8株番茄。所選的番茄泳道中都能擴增到200bp的目的片段，表明多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3已經成功轉到番茄中。
[0077] 引物的序列如下所示：
[0078] AV1AC1AC3F ：TCTATCTCATGGCGTGTA
[0079] AV1AC1AC3R ：AGGTAATGCGGATCTACG
[0080] 實施例3轉基因番茄的TYLCV抗性鑒定
[0081] 3.1農桿菌注射接種
[0082] 接種RNAi載體3周后，將含有TYLCV侵染質粒的農桿菌接種到轉基因番茄植株 的新葉上，對番茄進行傳毒，以未轉化但傳毒的番茄植株為陽性對照，同時留下部分番茄植 株轉化空載做為陰性對照，方法同2. 3。接種5周后，觀察番茄葉片癥狀，結果如圖3、4、5 所示。由圖3可知，A是未轉化但傳毒的番茄植株，從葉片癥狀可以發現該番茄已經嚴重 感染TYLCV ;由圖4可知，B是轉化空載的番茄植株，其葉片癥狀與A相似，說明該番茄也感 染TYLCV ;由圖5可知，C是轉化嵌合基因的番茄植株，其葉片生長正常，沒有發現任何感染 TYLCV的癥狀，說明轉化嵌合基因的番茄沒有感染TYLCV。
[0083] 3. 2轉基因番茄內病毒的檢測
[0084] TYLCV接種5周后使用斑點雜交的方法來檢測番茄葉片中TYLCV的DNA含量。具 體操作步驟如下：
[0085] 剪膜：剪裁兩塊所需大小的尼龍膜（Hybond N+，Amersham Pharmacia, Germany), 用鈍頭鉛筆劃出〇. 5cmX0. 5cm方格圖；點樣：取0. Ig番茄葉片，使用0. 5mL 0. 4M NaOH處 理，取10 μ L處理液點在尼龍膜上，自然晾干；烤膜：將尼龍膜點有樣品的一面朝上，置于分 子雜交爐中于80°C條件下烘烤1?2h ;預雜交：將烤好的尼龍膜放入雜交袋中，加入已經 預熱至42°C的預雜交液于搖床上溫和搖動30min ;探針準備：以提取的TYCLV的cDNA為模 板，體外合成以32P為標簽的病毒探針，取適當體積已標記的探針在沸水中變性5min，迅速 置于冰上冷卻5min，加到已預熱至42°C的雜交液中，溫和充分混勻，避免產生氣泡；換雜交 液：傾去預雜交液，將尼龍膜放入雜交管中，裝入含探針的雜交液；雜交：置于分子雜交爐 中于42°C條件下溫和搖動，保溫過夜；洗膜：將尼龍膜拿出，用洗膜液I洗兩次，每次5min， 于搖床上溫和搖動。用預熱至65°C的洗膜液II在分子雜交爐中于65°C洗膜兩次，每次 15min，溫和搖動；漂洗：洗膜后用Washing溶液將膜漂洗1?5min，于搖床上溫和搖動；封 閉：將洗后的尼龍膜轉移至雜交袋中，用IXBlocking溶液封閉，于搖床上溫和搖動30min。
[0086] 抗體作用：將封閉后的尼龍膜轉移至雜交袋中，用抗體溶液與膜相互作用，于搖床 上溫和搖動30min ;平衡：用適量檢測溶液將膜平衡5min，于搖床上溫和搖動；顯色：將封 閉后的尼龍膜轉移至新的雜交袋中，加5mL新配顯色液，置于暗處5?IOmin (不可搖動）， 幾分鐘后有色素顆粒開始形成，一般16h后完成顯色反應；拍照：顯色結束后以TE終止，用 掃描儀獲取圖像，保存結果。分析結果如圖6所示。
[0087] 由圖6可知，1是沒有轉化但接種TYLCV的番茄，檢測結果表明該番茄體內含有大 量TYLCV ;3是沒有轉化也沒有接種TYLCV的番茄，該番茄中也沒有檢測到TYLCV ;2是轉化 嵌合基因的番茄，該番茄中沒有檢測到TYLCV，說明轉化了多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉 基因番茄對TYLCV具有高抗性，從而篩選出高抗TYLCV番茄。
【權利要求】
1. 一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟： 1) 將TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3,并構建反向重復序列的RNAi載體；其中，AVI、ACl和AC3基因片段的核苷酸 序列分別如SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，多基因嵌合體AV1-AC1-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 2) 利用農桿菌介導法將RNAi載體在番茄上瞬時表達得到轉化多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3的轉基因番茄； 3) 轉基因番茄經過TYLCV系統性侵染、鑒定抗病性，獲取對TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
2. -種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟： 1) 以感病番茄中提取的總DNA為模板，利用三對引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/ AC3R分別進行PCR擴增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVUACl和AC3 基因片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；引物AVlF/ AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具體為： AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA 2) 將PCR產物混合，以引物AVlF和AClR進行PCR擴增，得到多基因嵌合體 AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合體AV1-AC1-AC3與載體 pGEM-T Easy Vector 連接，得到質粒 pGEM-T-AVl-ACl-AC3; 3) 使用限制性內切酶XbaI和BamHI雙酶切質粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆載體 pBluescript II SK(-)-RTMl，將酶切片段和載體進行連接，得到重組質粒pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl ； 4) 使用限制性內切酶SacI和NotI雙酶切質粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3-RTM1和質粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3,將酶切片段和載體進行連接，得到 重組質粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r); 5) 將構建的干擾片段AV1-AC1-AC3從重組質粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性內切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表 達載體 PBIN19 上，構建 RNAi 載體 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r); 6) 通過農桿菌介導法將RNAi載體pBIN19-AVl-ACl-AC3(i/r)注射到番茄幼苗，再用含 有TYLCV侵染質粒的農桿菌侵染番茄植株，將TYLCV基因組導入番茄植株內；通過提取番茄 DNA、斑點雜交檢測TYLCV含量來篩選出對TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。
3. 如權利要求1或2所述的培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的應 用。
【文檔編號】C12N15/84GK104313051SQ201410547125
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】孫勝, 邢國明, 邢曉娟, 亢秀萍, 陳志峰, 李興桃, 許小勇 申請人:山西農業大學