轉基因苜蓿草j101品系特異性定性pcr檢測用引物及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了轉基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測用引物及檢測方法。本發明針對針對我國農業部未頒發農業轉基因生物安全證書的轉基因苜蓿草品系J101，根據其基因組DNA序列5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區，首次設計和提供一對特異性引物，并成功建立定性PCR檢測體系。結果表明，本發明定性PCR檢測方法特異性良好，檢測的最低DNA濃度為80pg，相當于50拷貝的基因組DNA；適合于J101品系快速、穩定的定性檢測。
【專利說明】轉基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測用引物及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地，涉及一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性的定性PCR檢測用引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002]目前我國存欄數為1500萬頭奶牛，對優質飼草需求最非常大。轉基因苜蓿通過飼料進入動物養殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉基因食品，可能對于人的健康產生影響。根據《農業轉基因生物標識管理辦法》，凡是在中國境內銷售的轉基因生物，必須進行標識。為保障消費者的知情權，轉基因產品標識制度在30多個國家和地區應用。中國目前實施無閥值的強制性標識制度。
[0003]對轉基因產品標識需要檢測方法的支撐。目前對轉基因產品的檢測主要包括對蛋白質和核酸檢測兩大類，后者均以PCR為基礎的檢測技術，PCR技術具高的靈敏度、特異性和穩定性，檢測周期短，成本較低。能過普通凝膠電泳觀察條帶的有無判定擴增產物的有無，通過電泳條帶的濃度可以分析檢測方法的靈敏度。一方面中國目前實施無閥值的強制性標識制度，可采用普通定性PCR滿足對轉基因檢測的需求，另一方對普通定性PCR對操作者技術水平要求較低，僅需價格低廉的簡單PCR儀即可進行，適用于基層實驗推廣應用。
[0004]根據擴增目標片段位置的不同，基于核酸基礎上的PCR檢測又可以分為4種檢測策略:1)篩查法:對轉基因產品中的啟動子、終止子等通用基因進行篩查；2)基因特異性檢測:對轉基因產品中的外源目的基因進行檢測；3)構建特異性檢測:對外源目的基因與啟動子或終止子的特異連接序列進行檢測；4)品系特異性/轉化事件特異性檢測:對外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進行檢測。
[0005]品系特異性檢測方法是基于外源插入片段和宿主基因接合區的邊界序列建立特異性的檢測方法。品系性特異性PCR檢測方法可以對轉基因產品品系進行判定，被認為是最適合轉基因標識的檢測判定方法。zimmmermanm等首次使用inverse PCR策略獲得Btll的接合區序列并建立品系特異性檢測方法。
[0006]轉基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司開發的耐除草劑的轉基因品系，2005年美國和加拿大批準環境釋放和作為飼料應用，目前我國尚批準其進口。還未獲得我國轉基因生物安全證書，目前未見到有該作物品系特異性定性PCR檢測方法相關文獻。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是針對現有轉基因苜蓿草尚無品系特異性檢測方法、不能準確的對轉基因苜蓿草的品系進行識別，無法對轉基因產品進行標識的技術不足，提供一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物，其具有較高特異性和靈敏度及良好的穩定性，基于所述引物，可成功建立轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，實現對轉基因苜蓿草JlOl品系進行定性檢測。
[0008]本發明要解決的另一技術問題是提供轉基因苜蓿草JlOl品系進行定性檢測的方法。
[0009]本發明的上述目的通過以下技術方案予以實現:
本發明通過創造性地分析和大量實驗研究總結，在轉基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區序列，結合序列生物學信息的分析，設計得到一對特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測條件，建立特異性強、靈敏度高、穩定性良好的轉基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測方法。
[0010]具體地，提供一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物J101-1和J101-2，其序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’，
SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’。
[0011]同時提供一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，包括以步驟:
51.提取DNA作為反應的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進行定性PCR檢測；
其中，S2所述定性PCR檢測的反應體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0012]S2所述定性PCR檢測的反應程序為:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個循環；擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0013]本發明采用以下方法驗證本發明方法的特異性、靈敏度等:
采用引物J101-1和J101-2對7種常見作物進行定性PCR檢測，測試檢測體系特異性。
[0014]采用引物J101-1和J101-2對不同濃度的JlOl基因組DNA進行定性PCR檢測，測試檢測體系靈敏度。
[0015]上述定性PCR檢測的反應體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和J101-2 引物分別為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0016]上述定性PCR檢測的反應程序為:98°C 10s, 60°C 30s，72°C 30s, 30個循環。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0017]本發明可以很好地應用于鑒別轉基因苜蓿草JlOl品系與其他作物，尤其優選應用于轉基因苜蓿草J1i品系與轉基因玉米品系MIR162、轉基因玉米品系89034、轉基因玉米品系NK63、轉基因玉米品系BT11、轉基因大豆轉基因大豆GTS40-3-2、非轉基因大葉苜蓿等作物的鑒別檢測。
[0018]與現有技術相比，本發明的有益效果在于:
目前對轉基因產品的檢測主要包括對蛋白質和核酸檢測兩大類，而后者主要采用PCR技術為基礎的檢測體系，因為操作簡便、穩定性好以及易于推廣等優點被廣泛應用。根據擴增目標片段位置的不同，基于核酸基礎上的PCR檢測又可以分為4種檢測策略，即篩選檢測、基因特異性檢測、構建特異性檢測和品系(轉化事件)特異性檢測(徐茂軍，2001)，其中品系特異性檢測由于可以鑒定出具體的轉基因作物品系，因此是特異性最高的檢測方法。但由于進境農作物特別是含多種品系的作用，有的只有一部分品系允許進口，另一些可能尚未曾頒發證書，采用篩選檢測、基因特異檢測、構建特異性檢測均無法區分具體的品系，無法對進境產品的轉基因成份進行標識。因此目前是采用啟動子、終止子或EPSPS結構特異性基因或其組合的篩查檢測策略，這只能鑒定苜蓿草是否為轉基因，但是不能準確的檢測其具體的轉基因苜蓿草品系，出入境檢驗監管部門無法對同一作物具多個轉基因品系的轉基因作物進行標識管理。公眾也無法具體知道其轉基因的具體情況。此外，采用多個基因聯合篩查的方式會使人力物力大量增加。
[0019]本發明首次設計和提供了一對特異性引物，基于所述引物，本發明成功建立了JlOl品系特異性定性PCR檢測方法。本發明基于外源插入片段FMV35S啟動子和轉基因苜蓿JlOl基因組DNA的5’端旁鄰序列建立了轉基因苜蓿草JlOl品系特異性(event-specific)定性PCR方法，可以通過成功地擴增可特異性的鑒別區分目前尚未批準的轉基因苜蓿草JlOl品系，滿足對轉基因產品的閥值標識需求，對我國進境轉基因苜蓿JlOl的監管和標識提供有力的技術支撐。
[0020]本發明檢測方法操作簡單、檢測結果準確、重復性好。通過對苜蓿草JlOl等農作物進行的特異性試驗表明，本發明建立的定性PCR檢測方法僅對苜蓿草JlOl品系的檢測結果為陽性；大量實驗結果表明，定性PCR方法特異性良好，檢測的最低DNA濃度為80pg，相當于50拷貝的基因組DNA，能夠快速、準確、穩定的用于JlOl品系定性和定量檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是轉基因苜蓿JlOl品系外源插入片段示意圖。A為擴增區域。
[0022]圖2是JlOl品系特異性定性PCR特異性試驗結果，其中7為J101，1-6為6種非JlOl作物。
[0023]圖3是JlOl品系特異性定性PCR靈敏度試驗結果，其中，1-6分別為100ng、16ng、1.6ng、0.16ng、0.08ng 和 0.016ng 的 JlOl 基因組 DNA 模板。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明方法。下述實施例和附圖僅用于示例性說明，不能理解為對本發明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的生物材料、試劑原料為常規市購或商業途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規使用的方法和設備。
[0025]實施例1:建立JlOl品系特異性定性PCR檢測體系設計引物:
本發明通過創造性地分析和大量實驗研究總結，在轉基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區序列，結合序列生物學信息的分析，設計得到一對特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測條件，建立特異性強、靈敏度高、穩定性良好的轉基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測方法。
[0026]具體地，提供一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物J101-1和J101-2，其序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’。
[0027]SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’
所述弓I物可采用本領域常規方法合成。本實施例應用的弓I物委托寶生物合成。
[0028]本發明實施例所述實時熒光PCR檢測使用的儀器為B1RAD S1000。
[0029]本實施例基于上述引物，提供一種JlOl品系特異性定性PCRR檢測方法，包括以下步驟:
51.提取DNA作為反應的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進行定性PCR檢測；
其中，S2所述定性PCR檢測的反應體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0030]S2所述定性PCR檢測的反應程序為:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個循環；擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0031]其中，SI提取DNA具體方法為:稱取100 mg左右研磨成干粉的樣品，使用天根植物基因組DNA提取試劑盒并按照其操作說明書提取基因組DNA。提取的基因組DNA用微量分光光度計nanOdrOp2000c測定濃度。提取的DNA溶液在_20°C保存備用。
[0032]S2 所述定性 PCR 反應體系為 25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，J101-1/2 分別0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L ；
S2所述定性PCR反應程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，30個循環。擴增產物經
1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0033]實施例2 JlOl定性PCR的特異性試驗
本發明采用多種農作物進行特異性實驗，以下以7種農作物作為舉例進行說明。以轉基因玉米品系MIR162、轉基因玉米品系89034、轉基因玉米品系NK63、轉基因玉米品系BT11、轉基因大豆轉基因大豆GTS40-3-2、非轉基因大葉苜蓿、(均來自常規隨機取樣后儲存，并不因此限定本發明范圍)和苜蓿草JlOI基因組DNA為模板，采用本發明建立的轉基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進行擴增，檢測本發明建立的定性PCR方法的特異性。實驗結果見附圖2所示，經PCR擴增后電泳分析觀察有無170bp條帶。實驗結果表明，只有JlOl有特征性擴增170bp長度的片段，其他作物均無條帶出現。表明本發明建立的JlOl品系特異性的定性PCR方法特異性良好。
[0034]定性PCR 反應體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0035]實施例3 JlOl定性PCR的靈敏度試驗
采用本發明建立的轉基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進行擴增，采用10ng/μ L、16ng/ μ L、0.16ng/ μ L、0.08ng/ μ L、0.016ng/ μ L 及 0.008ng/ μ L 的 JlOl 品系的基因組DNA為模板進行檢測，實驗結果如圖3所示。在模板量不少于0.08ng時，特異性201bp的片段能擴增出來。表明其靈敏度為0.08ng基因組DNA，相當于50拷貝的基因組DNA。
[0036]定性PCR 反應體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
【權利要求】
1.一種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物，其特征在于，其DNA序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.權利要求1所述轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物在轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方面的應用。
3.—種轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.提取DNA作為反應的模板； 52.采用權利要求1所述的引物進行定性PCR檢測； 其中，S2所述定性PCR檢測的反應體系為25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，權利要求1所述的引物各為0.5 μ L，DNA模板I μ L，ddH20 10.5 μ L ； S2所述定性PCR檢測的反應程序為:98°C 10s，60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環；擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
4.權利要求3所述轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法在轉基因苜蓿草JlOl品系與其他作物的檢測鑒別方面。
5.根據權利要求4所述轉基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法的應用，其特征在于，應用于轉基因苜蓿草JlOl品系與轉基因玉米品系MIR162、轉基因玉米品系89034、轉基因玉米品系NK63、轉基因玉米品系BT11、轉基因大豆轉基因大豆GTS40-3-2、非轉基因大葉苜蓿的檢測鑒別方面。
【文檔編號】C12N15/11GK104372088SQ201410631655
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】盧麗, 劉二龍, 呂英姿, 蔣湘, 唐婕, 樊武疆, 姚柏輝, 王定國, 林惠嬌, 鄭高彬, 林學勤, 秦焯敏 申請人:中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局