利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法，首先取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質體懸浮液；將原生質體懸浮液涂布到培養皿中風干；將氮離子束脈沖注入到風干后的原生質體內，誘發菌體變異；將誘變后的原生質體加入山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS再生培養基平板中培養；將生長良好的單菌株接種于盛裝液體發酵培養基的搖瓶中進行振蕩培養，即可獲得赤霉酸高產菌株。本發明的優點在于利用氮離子束脈沖注入的方式對赤霉菌進行誘變，可選育出高產的赤霉菌突變株，采用本發明方法，突變株正突變率可達10%~40%，發酵效價比出發菌株提高30~90%。
【專利說明】利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物誘變技術，尤其是涉及一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉 酸高產菌株的方法。
【背景技術】
[0002] 赤霉酸（gibberellic acid)是一種屬于雙廠類化合物的植物生長調節劑，具有促 進種子發芽和植物生長、提早開花結果等作用，對農作物、蔬菜的產量和品質都有明顯的促 進作用，在農業生產和釀造業中有著廣泛應用。隨著農業技術的推廣和蔬菜水果種植業的 擴大，赤霉酸的需求量提高很快，生產量滿足不了市場實際需求量。
[0003] 赤霉酸主要依靠藤倉赤霉菌（Gibberella fujikuroi)發酵生產。赤霉酸的生產 至今已半個世紀的歷史，菌種的改良主要依靠 UV、X射線、同位素6tlCo照射和化學法誘變 等傳統的育種方法，一般的誘變劑效果并不明顯，未能取得較滿意的結果。另一方面，抗性 篩選菌株因具有代謝定向特性而受到重視，但是存在著目標不明確，費時費力而且收效不 明顯的問題。如：李武軍等對菌體原生質體進行誘變，原生質體融合重組選育；構建攜帶血 紅蛋白基因的藤倉赤霉菌工程株等；張金兒等應用氯霉素抗性篩選法，獲得赤霉素產量高 于出發菌20%的陽性氯霉素抗性突變株；王衛等采用制霉菌素抗性篩選獲得產赤霉素能力 提1? 16. 8%的菌株等。目如國內外赤霉素的生廣效價呈現出徘徊不如的狀態，而且有的生 產菌種出現退化。國內外大規模商業化的赤霉酸生產均通過赤霉菌經液態深層發酵后對發 酵液的提取而獲得，赤霉酸的發酵水平也參差不齊，約在I. 2~2g/L之間。因此，提高赤霉酸 的發酵效價，從現有菌種出發，通過誘變篩選出更加高產的菌株，進一步提高赤霉酸的發酵 水平十分必要。
[0004] 近些年來，離子束作為一種新的誘變源，在微生物誘變育種方面因其獨特的誘變 機理和生物學效應而發展迅速。與傳統誘變源相比，低能離子束注入是一種集物理與化學 誘變特性為一體的綜合誘變技術，它能夠在低劑量注入的情況下，引起染色體的畸變，導致 DNA鏈堿基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質在基因或分子水平上發生改變或缺失，明顯提高 變異的頻率，獲得對生物體生理損傷小、突變率高、突變譜廣、遺傳穩定的誘變效果。
[0005] 離子注入技術被應用于微生物優良菌株的選育和改良研究中，已選育出一些在工 業上具有較大應用前景的生物新品種，并取得了顯著的經濟和社會效益。而把低能離子束 注入法用于赤霉酸生產菌株的選育，則還未見有相關專利和文獻報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方 法，該方法可有效提高赤霉酸的產量。
[0007] 為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案： 本發明所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法，包括下述步驟： 第一步，原生質體的制備： 取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質體懸浮液； 第二步，氮離子注入誘變： 將第一步得到的原生質體懸浮液涂布到培養皿中，無菌狀態下風干；將能量IOlOkeV 的氮離子束脈沖注入到風干后的原生質體內，誘發菌體變異； 第二步，1?廣菌株的篩選和獲得： 將第二步誘變后的原生質體加入濃度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS 再生培養基平板中培養；將培養出的生長良好、直徑2~4_的單菌株接種于盛裝液體發酵 培養基的搖瓶中進行振蕩培養，即可獲得發酵效價I. 8~2. lg/L的赤霉酸高產菌株。
[0008] 第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。所用的PDAS固體再生培養基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 59Γ4. 1%，瓊脂 1. 5%?2%，ρΗ6· 0?6· 5。
[0009] 本發明的優點在于利用氮離子束脈沖注入的方式對赤霉菌進行誘變，可選育出高 產的赤霉菌突變株，采用本發明方法，突變株正突變率可達1〇%~40%，發酵效價比出發菌株 提高3(Γ90%。與其他傳統的物理化學誘變方法相比，本發明的優點體現在如下幾點： 1、 由于離子束注入誘變是一種集物理和化學誘變特征于一體的綜合誘變，具有對生物 細胞損傷小的特點，因此采用該方法誘變的菌株正突變率高，誘變效果好； 2、 采用本發明方法選育出的高產赤霉酸菌株，具有高產性狀穩定，不易丟失的優點，經 過10代以上轉接，效價仍能保持篩選后的水平，產赤霉酸量在I. 9~2. 3g/L之間。
[0010] 3、采用本發明誘變篩選的高產赤霉酸菌株，經過3m3發酵罐試驗，效價仍能保持較 高水平，產赤霉酸量在1.8~2. lg/L。見下表1。證明本發明方法篩選出的菌株有利于大規 模工業化生產。
[0011] 表1本發明選育的高產菌株與出發菌株的產量比較
【權利要求】
1. 一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法，其特征在于：包括下述 步驟： 第一步，原生質體的制備： 取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質體懸浮液； 第二步，氮離子注入誘變： 將第一步得到的原生質體懸浮液涂布到培養皿中，無菌狀態下風干；將能量KT20keV 的氮離子束脈沖注入到風干后的原生質體內，誘發菌體變異； 第二步，1?廣菌株的篩選和獲得： 將第二步誘變后的原生質體加入濃度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS 再生培養基平板中培養；將培養出的生長良好、直徑2~4mm的單菌株接種于盛裝液體發酵 培養基的搖瓶中進行振蕩培養，即可獲得發酵效價1. 8~2. lg/L的赤霉酸高產菌株。
2. 根據權利要求1所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法，其 特征在于：第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mm〇l/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。
3. 根據權利要求1所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產菌株的方法， 其特征在于：第三步中所用的PDAS固體再生培養基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 5%?4. 1%，瓊脂 1. 5%?2%，pH6. 0?6. 5。
【文檔編號】C12N15/01GK104388418SQ201410671197
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月21日 優先權日:2014年11月21日
【發明者】張一折, 張書杰, 朱朝印, 馬軒, 劉建華, 方業忠 申請人:鄭州大學, 孟州農達生化制品有限公司