一種雙重組位點的雙向啟動植物表達載體系統的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種雙重組位點的雙向啟動植物表達載體系統，由一個雙重組位點雙向表達植物表達載體pRGFL和兩個分別帶有特異重組位點的克隆載體p-FRT、p-loxp組成。本發明所提供的雙重組位點雙向表達植物表達載體pRGFL是經改造的含有特定DNA分子的植物表達載體，本發明所提供的兩個分別帶有特異重組位點的克隆載體是在出發載體的多克隆位點分別插入特定DNA分子的重組載體。本發明的克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp經過XcmI酶或EcorV酶消化后形成帶有T末端或平末端的載體，可以直接與目的基因的PCR產物連接達到克隆的目的。克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp上的目的基因在對應的重組酶的介導下，可以分別通過特異位點重組將雙重組位點雙向表達植物表達載體上的熒光蛋白報告基因替換，達到將目的基因轉移至植物表達載體的目的，過程中只需要重組酶介導，不需其它操作，簡便易行。
【專利說明】一種雙重組位點的雙向啟動植物表達載體系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及雙重組位點雙向表達植物表達載體及其構建系統。
【背景技術】
[0002]在植物轉基因研究中，兩個基因協同轉化是研究多基因間互作關系的理想方法。目前可以通過在載體上串聯基因或利用雙向啟動子的方法在同一個載體中攜帶兩個不同的基因，再轉化植物達到兩個基因協同轉化的效果。上述方法的載體構建中，多為采用酶切、連接的方法將目的基因逐個連接到載體上，載體序列限制了只有少數幾個酶切位點能用于構建，但如果目的基因內部剛好也帶有構建所需的酶切位點，則不能用酶切連接的方法進行構建，這就給上述方法的應用帶來了限制。
[0003]位點特異性重組是首先發現于原核生物中的一種DNA重組方式，它由重組酶介導在特定的成對序列之間完成DNA交換重組，并且這種重組只在特定的重組酶作用下，識別特定的成對序列并完成重組，所以重組酶及其特異識別的序列被稱為重組酶系統。Cre/1xP是從大腸桿菌噬菌體Pl中獲得的重組酶系統，在這個系統中，Cre重組酶催化兩個34bp的同源1xP序列間的重組。FLP/FRT則是源于釀酒酵母的重組酶系統，34bp的FRT序列是重組酶FLP的特異作用位點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種雙重組位點的雙向表達植物表達載體系統，由一個雙重組位點雙向表達植物表達載體PRGFL和兩個分別帶有特異重組位點的克隆載體p-FRT、p-loxp 組成。
[0005]本發明所提供的雙重組位點雙向表達植物表達載體pRGFL是以pBI121基礎改造的含有如下DNA分子的重組表達載體:
[0006]自5’末端依次含有NoS終止子、SalI酶識別序列、反向FRT序列、紅色熒光蛋白基因、反向FRT序列、SpeI酶識別序列、雙向啟動子、BamHI酶識別序列、反向1xP序列、綠色熒光蛋白基因、反向1xP序列、KpnI酶識別序列、NoS終止子。
[0007]所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第4356-7983位。
[0008]本發明所提供的兩個分別帶有特異重組位點的克隆載體是在出發載體PMD18T-Vector的多克隆位點分別插入特定DNA分子的重組載體。
[0009]克隆載體p-FRT在多克隆位點插入如下DNA分子:自5’末端依次含有正向FRT序列、XcmI酶識別序列、SpeI酶識別序列、EcorV酶識別序列、正向FRT序列。
[0010]克隆載體p-loxp在多克隆位點插入如下DNA分子:自5’末端依次含有反向1xP序列、XcmI酶識別序列、SpeI酶識別序列、EcorV酶識別序列、反向1xP序列。
[0011]克隆載體p-FRT和p-loxp中所包含的XcmI酶識別序列如下:ccacccttattctgg
[0012]以上所述的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。
[0013]本發明的克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp經過XcmI酶或EcorV酶消化后形成帶有T末端或平末端的載體，可以直接與目的基因的PCR產物連接達到克隆的目的。克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp上的目的基因在對應的重組酶的介導下，可以分別通過特異位點重組將雙重組位點雙向表達植物表達載體上的熒光蛋白報告基因替換，達到將目的基因轉移至植物表達載體的目的，過程中只需要重組酶介導，不需其它的酶切、連接操作，簡便易行且不受酶切識別序列限制。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1 為 Gm抗性基因序列 PCR擴增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為Gm抗性基因序列PCR擴增產物。
[0015]圖2 為陽性克隆菌落 PCR 驗證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗證擴增產物。
[0016]圖3為Xcm I酶切連載體連接效果圖。左:氨芐抗性平板；右:氨芐和慶大霉素雙抗性平板。
[0017]圖4 為 Gm抗性基因序列 PCR擴增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為Gm抗性基因序列PCR擴增產物。
[0018]圖5 為陽性克隆菌落 PCR 驗證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗證擴增產物。
[0019]圖6為EcoR V酶切連載體連接效果圖。左:氨芐抗性平板；右:氨芐和慶大霉素雙抗性平板。
[0020]圖7 為 GusA 基因序列 PCR 擴增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；1為GusA基因序列PCR擴增產物。
[0021]圖8 為陽性克隆菌落 PCR 驗證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗證擴增產物。
[0022]圖9 為菌落PCR驗證圖。M為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;I 為用 GusAl、GusA2引物進行PCR驗證結果；2為用GFP2、GFP2引物進行PCR驗證結果；3為用RED1、RED2引物進行PCR驗證結果；a為重組成功質粒模板PCR驗證結果；b為對照質粒模板PCR驗證結果。
[0023]圖10為農桿菌瞬時表達結果圖。a為農桿菌侵染葉片；b為對照。
[0024]圖11 為 GusA 基因序列 PCR 擴增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為GusA基因序列PCR擴增產物。
[0025]圖12 為菌落 PCR驗證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3 為陽性克隆PCR驗證擴增產物。
[0026]圖13為菌落PCR驗證圖。M為GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;I 為用GusAl、GusA2引物進行PCR驗證結果；2為用GFP2、GFP2引物進行PCR驗證結果；3為用RED1、RED2引物進行PCR驗證結果；a為重組成功質粒模板PCR驗證結果；b為對照質粒模板PCR驗證結果
[0027]圖14為農桿菌瞬時表達結果圖。a為農桿菌侵染葉片；b為對照。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例對本發明的一種雙重組位點的雙向表達植物表達載體系統進行進一步說明。
[0029]實施例1、應用克隆載體p-FRT通過XcmI酶消化并克隆目的基因
[0030]將克隆載體p-FRT質粒經過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產物回收。
[0031]以帶有慶大霉素抗性基因的pPHlJI質粒為模板，以Gl，G2為引物，用Taq酶PCR擴增得到帶有3’ A末端的慶大霉素抗性基因序列:
[0032]Gl: aattgacataagcctgttcggt,
[0033]G2: tgacaatttaccgaacaactcc。
[0034]PCR 擴增條件為:95°C 預變性 5mins; 95 °C 30s ；58°C 30s ；72°C Imin ；28 循環；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產物電泳結果如圖1所示，圖1中I為擴增產物，為800bp左右片段。
[0035]PCR產物回收后與消化過的p-FRT連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數配制。連接產物轉化E.coli涂布在含氨芐和慶大霉素的LA平板上進行篩選，同時涂布只含氨芐的平板統計連接效率。
[0036]在氨芐和慶大霉素雙抗生素平板上挑取菌落采用Gl、G2引物進行PCR驗證，電泳結果如圖2所示，圖2中1、2、3為菌落PCR擴增產物，為800左右片段，與預期相符。
[0037]含氨芐和慶大霉素的平板上菌落數為成功連接外源片段獲得慶大霉素抗性菌落，只含氨芐的平板的菌落數則為包含了載體自連的菌落數，統計連接效率，
[0038]連接效率=含氨芐和慶大霉素的平板菌落數/只含氨芐的平板的菌落數
[0039]平板菌落生長情況如圖3，計算連接效率=51/388=13.14%
[0040]實施例2、應用克隆載體p-loxp通過EcorV酶消化并克隆目的基因
[0041]將克隆載體p-loxp質粒經過EcorV酶消化，條件為37°C，12h，將產物回收。
[0042]以帶有慶大霉素抗性基因的pPHlJI質粒為模板，以Gl，G2為引物用/7/1/酶PCR擴增得到帶有平末端的慶大霉素抗性基因序列:
[0043]Gl: aattgacataagcctgttcggt,
[0044]G2: tgacaatttaccgaacaactcc。
[0045]PCR 擴增條件為:95°C 預變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C Imin ；28 循環；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產物電泳結果如圖4所示，圖4中I為擴增產物，為800bp左右片段。
[0046]PCR產物回收后與消化過的p-loxp連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數配制。連接產物轉化E.coli涂布在含氨芐和慶大霉素的LA平板上進行篩選，同時涂布只含氨芐的平板統計連接效率。
[0047]在氨芐和慶大霉素雙抗生素平板上挑取菌落采用Gl、G2引物進行PCR驗證，電泳結果如圖5所示，圖5中1、2、3為菌落PCR擴增產物，為800左右片段，與預期相符。
[0048]含氨芐和慶大霉素的平板上菌落數為成功連接外源片段獲得慶大霉素抗性菌落，只含氨芐的平板的菌落數則為包含了載體自連的菌落數，統計連接效率，
[0049]連接效率=含氨芐和慶大霉素的平板菌落數/只含氨芐的平板的菌落數
[0050]平板菌落生長情況如圖6，計算連接效率=91/1296=7.02%
[0051]實施例3、重組酶FLP介導⑶S基因重組替換紅色熒光蛋白基因
[0052]將克隆載體p-FRT質粒經過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產物回收。
[0053]以帶有⑶S基因的pBI 121質粒為模板，以Gusl，Gus2為引物，用Taq酶PCR擴增得到帶有3’ A末端的GUS基因序列:
[0054]GUSl: atgttacgtcctgtagaaacc,
[0055]GUS2: tcattgtttgcctccctg。
[0056]PCR 擴增條件為:95°C 預變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C 2min ；28 循環；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產物電泳結果如圖7所示，圖7中I為擴增產物，為1800bp左右片段。
[0057]PCR產物回收后與消化過的p-FRT連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數配制。連接產物轉化E.coli涂布在含氨芐LA平板上進行篩選，挑取菌落采用GUSl和載體上多克隆位點下游的測序引物M13-47引物進行PCR驗證，目的是挑選插入方向正確的重組載體。電泳結果如圖8所示，圖8中，1、2、3為菌落PCR擴增產物，為1800左右片段，與預期相符。
[0058]將純化后的雙重組位點雙向表達植物表達載體pRGFL和帶有⑶S基因的p_FRT載體按摩爾比1:2配制反應體系，將純化的FLP蛋白與上述底物在反應緩沖液(2mMMgC12, 70mM NaCl, 50mMTris-HCl, pH7.5)中 30°C反應 lh，反應產物轉化E.coli 涂布含卡納霉素的LA平板篩選。
[0059]隨機挑選菌落用GUS1，GUS2引物進行PCR驗證，重組成功的載體應該擴增得到1800左右⑶S基因片段，而未成功重組的載體則擴增不到目的片段，同時使用RED1、RED2引物驗證，未成功重組的載體應擴增到SOObp左右的紅色熒光蛋白基因片段，而重組成功的載體應該不能擴增得到目的片段，
[0060]REDl:ctaggttagtggtgg
[0061]RED2:atgaagcttgcctcc
[0062]驗證電泳結果如圖9，圖中a為重組成功的載體，b為對照。
[0063]根據PCR驗證結果統計重組率:
[0064]重組率=陽性克隆數/驗證總菌落數=2/768=0.26%
[0065]重組質粒導入農桿菌LBA4404，將重組農桿菌侵染煙草葉片進行瞬時表達，將侵染后的煙草葉片用熒光顯微鏡觀察檢測熒光蛋白的表達，同時GUS組織染色檢測GUS基因的表達，以未侵染煙草作為對照。
[0066]結果如圖10，a為侵染葉片，b為對照。在侵染葉片中觀察到綠色熒光蛋白以及GUS顯色反應，但未觀察到紅色熒光蛋白。說明按照本發明的方法成功將⑶S基因重組到pRGFL上，替換掉了原有的紅色熒光蛋白基因，并且⑶S基因可以正常表達，重組率為0.26%。
[0067]實施例4、重組酶CRE介導⑶S基因重組替換綠色熒光蛋白基因
[0068]將克隆載體p-loxp質粒經過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產物回收。
[0069]以帶有⑶S基因的pBI 121質粒為模板，以Gusl, Gus2為引物，用Taq酶PCR擴增得到帶有3’ A末端的GUS基因序列:
[0070]GUSl: atgttacgtcctgtagaaacc,
[0071]GUS2: tcattgtttgcctccctgο
[0072]PCR 擴增條件為:95°C 預變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C 2min ；28 循環；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產物電泳結果如圖11所示，圖11中I為擴增產物，為1800bp
左右片段。
[0073]PCR產物回收后與消化過的p-loxp連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數配制。連接產物轉化E.coli涂布在含氨芐LA平板上進行篩選，挑取菌落采用GUSl和載體上多克隆位點下游的測序引物M13-47引物進行PCR驗證，目的是挑選插入方向正確的重組載體。電泳結果如圖12所示，圖12中，1、2、3為菌落PCR擴增產物，為1800左右片段，與預期相符。
[0074]將純化后的雙重組位點雙向表達植物表達載體pRGFL和帶有⑶S基因的p-loxp載體按摩爾比1:2配制反應體系，將純化的CRE蛋白與上述底物在反應緩沖液(2mMMgC12, 70mM NaCl, 50mMTris-HCl, pH7.5)中 30°C反應 lh，反應產物轉化E.coli 涂布含卡納霉素的LA平板篩選。
[0075]隨機挑選菌落用GUS1，GUS2引物進行PCR驗證，重組成功的載體應該擴增得到1800左右⑶S基因片段，而未成功重組的載體則擴增不到目的片段，同時使用GFP1、GFP2引物驗證，未成功重組的載體應擴增到SOObp左右的綠色熒光蛋白基因片段，而重組成功的載體應該不能擴增得到目的片段，
[0076]GFPl:atggtgagcaagg
[0077]GFP2:ttacttgtacagctc
[0078]驗證電泳結果如圖13，圖中a為重組成功的載體，b為對照。
[0079]根據PCR驗證結果統計重組率:
[0080]重組率=陽性克隆數/驗證總菌落數=11/384=2.86%
[0081]重組質粒導入農桿菌LBA4404，將重組農桿菌侵染煙草葉片進行瞬時表達，將侵染后的煙草葉片用熒光顯微鏡觀察檢測熒光蛋白的表達，同時GUS組織染色檢測GUS基因的表達，以未侵染煙草作為對照。
[0082]結果如圖14，a為侵染葉片，b為對照。在侵染葉片中觀察到紅色熒光蛋白以及⑶S顯示反應，但未觀察到綠色熒光蛋白。說明按照本發明的方法成功將⑶S基因重組到pRGFL上，替換掉了原有的綠熒光蛋白基因，并且⑶S基因可以正常表達，重組率為2.86%。
【權利要求】
1.一種DNA分子，自5’末端依次含有含有NoS終止子、SalI酶識別序列、反向FRT序列、紅色熒光蛋白基因、反向FRT序列、SpeI酶識別序列、雙向啟動子、BamHI酶識別序列、反向1xP序列、綠色熒光蛋白基因、反向1xP序列、KpnI酶識別序列、NoS終止子。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其特征在于核酸序列為序列表中序列I自5’端4356-7983 位。
3.一種在出發載體的多克隆位點插入如下序列的DNA分子:自5’末端依次含有正向FRT序列、XcmI酶識別序列、SpeI酶識別序列、EcorV酶識別序列、正向FRT序列。
4.根據權利要求3所述的DNA分子，其特征在于核酸序列包含序列表中序列2。
5.—種在出發載體的多克隆位點插入如下序列的DNA分子:自5’末端依次含有反向1xP序列、XcmI酶識別序列、SpeI酶識別序列、EcorV酶識別序列、反向1xP序列。
6.根據權利要求3所述的DNA分子，其特征在于核酸序列包含序列表序列3。
7.根據權利要求3、4所述的DNA分子，其特征在于XcmI酶識別序列如下:ccacccttattctgg。
8.權利要求1、3、4的所述載體在植物表達中的應用。
【文檔編號】C12N15/84GK104450696SQ201410721269
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月5日 優先權日:2015年1月5日
【發明者】蔣湘寧, 陳博雯, 蓋穎, 王文棋, 張春曉 申請人:北京林業大學, 蔣湘寧, 蓋穎