一種提高植物耐鋁能力的載體及構建方法

專利名稱：一種提高植物耐鋁能力的載體及構建方法
技術領域：
本發明具體涉及一種在植物體內構建新的檸檬酸合成途徑以提高植物耐鋁能力的載體及構建方法，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
鋁是地表上第三大元素，對植物的毒性很強。當土壤溶液酸化后PH值下降到一定值時，鋁離子就會從硅酸鹽或氧化物中釋放出來，溶解到土壤溶液中(Ma JF, Furukawa J. 2003. Recent progress in the research of external Al detoxification in higher plants: a minireview. J Inorg Biochem. 97:46-51)。可溶性的鋁可以分為以下幾類自由鋁或是Al (H2O)63+、聚合鋁々113及低分子量鋁化合物。隨著土壤pH值的上升，Al (H2O)63+轉變為A1(0H)2+、A1(0H)2+。在中性土壤中，主要以難溶的Al (OH)3形式存在。在堿性條件下主要是以鋁酸鹽陰離子Al (OH)4—形式存在(Matsumoto H. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. Int Rev Cytol. 200:1-46)。不同形態的鋁對植物的毒性有明顯的差異。目前一般認為在PH值低于4. 5的酸性土壤中，鋁主要是以 Al (H2O)63+形態存在的，即通常所說的Al3+，這一形態的鋁被認為是對植物毒性最強的形態。鋁并不是植物礦質營養中的必需元素，鋁毒被認為是酸性土壤上影響作物生長的主要的限制因子。微摩爾水平的鋁離子即可對植物產生毒害，而酸性土壤溶液中Al3+的濃度約為 10-100 μ mol/L (Ma JF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants. Plant Cell Physiol. 41:383-390)。鋁對根的毒害作用部位是根尖，包括根冠與根分生區，因此植物發生鋁毒害的最主要癥狀是其根生長受到快速受阻，這可能是鋁通過一種未知的信號傳導途徑間接抑制根的生長。此外，鋁離子交換量占土壤中陽離子交換總量的20% 80%，容易導致土壤陽離子流失，如造成磷、鉀、鈣、鎂、硼、 鉬等營養元素的缺乏。鋁也可以和磷酸基、羥基等極性基團結合，因此它可以與細胞質及膜蛋白結合，影響膜的結構和功能。同時鋁可以和ATP形成Al-ATP復合物，使植物細胞能量代謝過程受到限制。全世界有39. 5億hm2酸性土壤，其中可耕地土壤面積為1. 79億hm2，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區，尤其是發展中國家(Kochian LV. 1995. Celluar .Mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plant. Annu Rew Plant physiol plant mol Biol. 46:137)。我國酸性土壤遍及南方15個省區，總面積為2030萬hm2，約占全國土地總面積的21%。一直以來，人們通常靠大量的施用石灰，來提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀，解除鋁毒害。但是這種方法難以徹底解決土壤酸度問題，它只能對表層土壤進行改良，對深層土壤的酸性沒有多大的作用，同時還存在著潛在的環境問題。因此，篩選和培育耐鋁作物品種是提高酸性土壤上的作物產量有效且可持續的方法。許多實驗表明，植物可以通過分泌螯合劑如有機酸或磷酸將離子態的鋁變成螯合態的鋁從而解除鋁毒害。Miyasaka等人首先發現，在鋁脅迫條件下，耐鋁的菜豆品種向根際環境分泌的檸檬酸比敏感品種高10倍(Miyasaka SC, Buta JG, Howell RK, Foy CD.
31991. Mechanisms of aluminum tolerance in snapbeans: root exudation of citric acid. Plant Physiol. 96(3) : 737-743)。Pellet等發現在鋁脅迫條件下耐鋁玉米品種分泌的檸檬酸比敏感品種高7倍(Pellet DM, Grunes DL, Kochian LV. 1995. Organic acid exudation as an aluminum-tolerance mechanism in maize {Zea mays L. ). Planta. 196(4) : 788-795)。Delhaize等從單一的主基因座(Altl)水平上對鋁有不同耐受能力的一對近似同源的小麥品系進行研究，發現鋁敏感品系根尖積累的鋁為耐性品系的3-8倍， 而耐性品系蘋果酸的分泌比敏感性品系高出10倍左右，這些結果說明小麥通過蘋果酸螯合鋁離子，減少鋁離子的毒害保護根尖(Delhaize E, Craig S, Beaton CD, Bennet RJ, Jagadish VC, Randallet PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.) : I. Uptake and distribution of aluminum in root apices. Plant Physiol. 103(3): 685 - 93； Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.): II. Aluminum-stimulated excretion of malic acid from root apices. Plant Physiol. 103(3) : 695 - 702)。此后，研究者對鋁誘導的有機酸分泌和植物耐鋁能力作了大量深入的研究和探索。有機酸的分泌也被認為是植物耐鋁的重要機制之一。目前已證實鋁脅迫下根系分泌蘋果酸、草酸和檸檬酸。這3種有機酸都可以和鋁螯合，但他們對鋁離子的螯合能力并不相同，螯合能力由大到小依次為檸檬酸、草酸、蘋果酸。有機酸解除鋁毒的能力主要與它們的化學結構有關，即-OH、-C00H官能團在主 C 鏈上的位置(Hue NV, Craddock GR, Adams F. 1986. Effect of organic acids on aluminum toxicty in subsoils. Soil Sci Am J. 50:28-34)。植物體內檸檬酸的合成主要通過檸檬酸循環中檸檬酸合酶(CS)的作用完成，CS 催化來自糖酵解或其它異化反應的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合合成檸檬酸。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4植物CO2固定的一個重要酶，也是有機酸代謝中的一個關鍵酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HC03_生成草酰乙酸(OAA)和無機磷酸(Pi)的不可逆反應。 很多研究結果證明通過在植物中過量表達^增加植物中CS的酶活性，可以提高轉基因植物對鋁的耐受性，這也說明在植物中過量表達α是一種提高植物耐鋁能力的有效手段。過量表達玉米C4型全長的轉基因水稻葉片中PEPC的活性顯著增加，從而導致葉中和根中有機酸含量的增加，耐鋁能力顯著增強(Begum HH, Osaki Μ, Watanabe Τ, Shinano Τ. 2009. Mechanisms of aluminum tolerance in phosphoenolpyruvate carboxylase transgenic rice. J Plant Nutr. 2(1) : 84-96)。這些研究結果說明PEPC的過量表達也能提高植物抗鋁毒能力。在大豆和菜豆的耐鋁型栽培種中已經發現CS和PEPC的活性在鋁脅迫下增加，這有助于有機酸的合成和分泌，增強植物的耐鋁能力。切除莖的植物及在黑暗條件下生長的植物有機酸的分泌量顯著減少，這說明光合作用和植物在鋁脅迫下有機酸的分泌活動 W^ffi^ (Range 1 AF, Rao IM, Braun H-P, Horst WJ. 2010. Aluminium resistance in common bean {Phaseolus vulgaris) involves induction and maintenance of citrate exudation from root apices. Physiol Plant. 138(2): 176-190; Yang ZM, Nian H, Sivaguru M, Tanakamaru S, Matsumoto H. 2001. Characterization of aluminium-induced citrate secretion in aluminium-tolerant soybean {Glycine max) plants. Physiol Plant. 113(1) : 64-71)。1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表達量最大的蛋白質，這種蛋白質的含量占植物細胞中可溶性蛋白的40-50%。控制rbcS 基因表達的啟動子為光誘導型啟動子(PrbcS)，PrbcS的作用有很強的組織特異性，需要光信號的誘導，在葉片中的表達最強，常被用來實現目的基因在葉片中的高水平表達。現有的一些研究通過在在轉基因植物中過量表達有機酸代謝相關酶的基因都能增加有機酸的分泌，從而提高植物耐鋁能力。但這些研究都是在植物中過量表達一種基因， 目前還沒有在植物中過量表達兩個或以上基因大幅提高植物耐鋁能力的報道。此外，現有的研究都利用組成型啟動子在轉基因植物中過量表達有機酸代謝相關基因，有些轉基因植物在正常條件下生長時個體比對照植物小，這種現象被認為可能是由于有機酸不斷分泌到植物體外而消耗大量碳源引起的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種在植物體構建新的檸檬酸以提高植物耐鋁能力的方法利用PrbcS啟動子在煙草葉片細胞質中同時表達cs和ρ印c，通過PEPC的作用利用糖酵解產生的PEP生成更多的草酰乙酸，而草酰乙酸含量的增加使CS有更多的底物合成檸檬酸，這樣可在細胞質中構建一條檸檬酸合成途徑，以期增加檸檬酸的合成，從而進一步提高植物對鋁的抗性。同時提供過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體，該載體是含有嗜熱藍藻(Synechococcus vulcanus)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(即PEPC基因)的植物表達載體。為了實現本發明的上述目的，本發明通過下列技術方案實現
本發明所提供的用于提高植物耐鋁毒能力的載體，是具有光誘導啟動子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因來源于嗜熱藍藻(Synechococcus vulcanus)0 所述的來源于嗜熱藍藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC (登錄號為AB057454)的一個突變體(889位的Lys被突變成了 Ser)，該突變體PEPC對蘋果酸的反饋抑制不敏感。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游為Rubisco小亞基的光誘導型啟動子。所述載體中，用于構建所屬植物表達載體的起始載體為pH2GW7 (購自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本發明的上述植物表達載體pH2-35S-PrbcS-PEPC由下述方法構建而成
(1)從GenBank中查找嗜熱藍藻PEPC的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘
ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘ 5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點；3’端引物ρ印c3， 末端加損ol酶切位點；以本申請人構建的一個入門質粒載體pENTR 2B-KsPEPC (Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)為模板擴增得到PEPC突變體的全長編碼區的DNA片段；
(2)回收并純化PEPC全長基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pUCm-PEPC ；
(3)構建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP (pENTR*-PrbcS-*T-GFP的構建方法見申請號為200710066422. 9的申請)和pUCm-PEPC，回
5收載體pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后連接、轉化、抽提質粒進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重組質粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；
(4)構建植物表達載體pH2-35S-PrbcS-PEPC，通過Gateway技術的LR反應把 PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達載體pH2GW7 (Gateway的目的載體)中，獲得PEPC基因的植物表達載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC。本發明利用光誘導型啟動子PrbcS構建PEPC基因的植物表達載體，同時在植物中轉化PPZP211-PrbcS-cs植物表達載體(pPZP211-PrbcS-cs的構建方法見申請號為 200710066419. 7的申請)，以便在轉基因植物葉片的細胞質中同時過量表達PEPC基因和CS 基因，在植物細胞之中構建新的檸檬酸合成途徑。直接利用光合作用產物通過糖酵解途徑產生的碳骨架合成檸檬酸，使之分泌到細胞外，最后通過根系進入到土壤中，螯合土壤中的鋁離子，解除酸性土壤中高濃度的鋁對植物的毒害，提高轉基因植物耐鋁毒的能力。將植物表達載體pH2-35S-PrbcS-PEPC通過農桿菌介導或其它物理、化學方法導入植物組織并整合到植物基因組中，再將植物表達載體pPZP211-PrbcS-cs導入含有PEPC 基因的植物組織并整合到轉基因植物基因組中，得到含PEPC和CS的轉基因植物。本發明的專用載體旨在用于提高植物對鋁毒的耐受能力，對單子葉和雙子葉植物都適用，如煙草、 水稻、大豆、小麥等。本發明轉PEPC和CS基因的煙草植株檸檬酸合成酶活性是野生型煙草的2. 4 2. 6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型煙草的2. 2 2. 4倍。用13C NMR分析 NaH13CO3在轉基因植物中的代謝譜，結果顯示在鋁脅迫條件下，同時轉和G基因煙草中來自NaH13CO3的13C代謝流進入葡萄糖或果糖后通過糖酵解途徑進入有機酸如0AA(PEPC 反應的產物)和檸檬酸(CS反應的產物)及蘋果酸的流量都高于野生型煙草和單轉CS的煙草，說明在轉基因煙草中基因和^基因的過量表達成功地構建了一條新的檸檬酸合成途徑，使轉基因煙草中檸檬酸的合成量顯著增加。在受到鋁脅迫時，轉和^基因的煙草檸檬酸的分泌量是野生型的3. 8 4倍，根系生長良好，能提高植物對鋁毒的抗性。本發明的專用載體能在提高植物(如煙草)對鋁毒的耐受性方面發揮很大作用，特別是在中國南方酸性紅壤中，可顯著促進植物對鋁毒的耐受能力，因而也為植物品種改良提供了一條新途徑。


圖1為在轉基因植物細胞質中構建新的檸檬酸合成途徑策略； 圖2為中間載體的構建策略；
圖3為中間載體的檢測
A 重組質粒的 PCR 檢測1 :DNA Marker III ；2_3 以 pUCmjiffl/7 為模板，用
引物pepc5和pepc3擴增到的PCR產物；
B -.Hind IlWEcoR I 分別酶切檢驗 pUCm-/ ^1。1 =PUCiiitcEdC 重組質粒；2-3 -.Hind III 酶切 pUCm-Z^/T 重組質粒；4_5 -.EcoR I 酶切 pUCm-Z^/T 重組質粒；6 :DNA Marker III ；
C -.Nco I 和損ο I 雙酶切檢驗 pUCm-/^/^。1 :DNA Marker III ；2 -.Nco I 和損ο I 雙酶切PUCmTcE^重組質粒；3重組質粒。圖4為入門克隆載體pENTR*-PrbcS_/忍/C的構建策略；圖5為入門克隆載體pENTR*-PrbcS-/ T的檢測
A 重組質粒 pENTR^-PrbcS-Z^/T的 PCR檢測；1_5 以 pENTR^-PrbcS-/^/^質粒為模板， 利用ρ印c5和ρ印c3引物擴增得到的PCR產物；6 =DNA Marker III ；
B 用 BatnHl 和 Sma\ 雙酶切檢驗 pENTI^-PrbcS-/^/^ ;1 :DNA Marker III ；2-5 -.BamHl 和 Smal 雙酶切 pENTt^-PrbcS-Z^/T重組質粒；6 :pENTR*-PrbcS-Z^CMi ； 圖6為用Gateway的LR反應構建/^/C基因的植物表達載體策略； 圖7為PEPC植物表達載體pH2-35S-PrbcS-/^/T的檢測和農桿菌菌落的PCR檢測 A M BamHl 和 Smal 雙酶切檢驗 pffi-SSS-PrbcS-/^/^ ； 1_2 M BamHl 和 SmaY 雙酶切 Pffi-SSS-PrbcSTcST 質粒；3 :DNA Marker III ；
B 轉化 Pffi-SSS-PrbcSTcST 質粒的農桿菌 PCR 檢測；1 :DNA Marker III ；2 以 pH2-35S-PrbcS-/忍/C質粒為模板，利用ρ印c5和ρ印c3引物擴增得到的PCR產物；3 以 PH2GW7質粒為模板，利用pepc5和ρ印c3引物擴增得到的PCR產物；4 以農桿菌菌落為模版，利用P印c5和ρ印c3引物擴增得到的PCR產物；
圖8為PEPC和CS在轉基因煙草中的插入情況以及轉錄水平檢測 A Southern blot檢測轉基因煙草中α基因插入情況；以CS基因的寡居核苷酸片斷為探針作Southern blot分析；pcsl, pcs4, pcsl4 -難PEPC^cs的雙轉基因煙草；rcsl, rcs4, rcsl4 只轉α的單轉基因煙草；WT 未轉基因的野生型煙草(負對照)；
B =Southern blot檢測轉基因煙草中/^/T基因插入情況；以PEPC基因的寡居核苷酸片斷為探針，作Southern blot分析；ρ印c2，pepcl4, ρ印cl7 只轉基因的單轉基因煙草，其他株系的名稱與A中的描述相同；
C =RT-PCR檢測煙草中CS基因的轉錄水平；Marker =DNA Marker III ；cs 正對照(以質粒pPZP211-PrbcS-cs為模板擴增得到的PCR產物；
D :RT-PCR檢測煙草中PEPC基因轉錄水平；Marker =DNA Marker III ；pepc 正對照(以質粒pH2-35S-PrbcS-/忍/C為模板擴增得到的PCR產物； 圖9為PEPC和CS在轉基因煙草中的酶活性測定 A =CS在轉基因煙草中的酶活性測定； B =PEPC在轉基因煙草中的酶活性測定；
圖10為IO13C-NMR分析50 μ mol · L-1鋁脅迫24h后轉基因煙草中NaH13C03代謝譜； 圖11為13C-NMR分析沒有鋁脅迫時轉基因煙草中NaH13C03代謝譜； 圖12為轉基因煙草檸檬酸分泌量的測定 A 轉基因煙草在無鋁脅迫條件下檸檬酸的分泌量； B 轉基因煙草在30 μ mol/L的AlCl3脅迫下檸檬酸的分泌量； 圖13為PEPC和CS雙轉基因煙草在鋁毒脅迫下根相對生長率的測定； 圖14為轉基因煙草在有鋁毒脅迫的沙質土壤中地上部分的生長情況及株高；A和B轉基因煙草在有鋁脅迫的沙質土壤中的生長狀況C轉基因煙草在有鋁脅迫的沙質土壤中生長時的株高；
圖15為轉基因煙草在有鋁脅迫的沙質土壤中根部的生長情況及根干重； A 轉基因煙草在有鋁脅迫的沙質土壤中根的生長情況； B 轉基因煙草在有鋁脅迫的沙質土壤中根的干重。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1 基因擴增及TA克隆
/WT基因DNA編碼區的擴增及TA克隆策略如圖2所示，首先根據PEPC基因序列設計一對引物，序列如下
ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘
5，端引物ρ印c5末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點；3，端引物ρ印c3 末端加損ο I酶切位點。以構建的一個含有嗜熱藍藻突變體基因的入門載體pENTR 2B-KsPEPC(Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)為模板，用PEPC特異引物ρ印c5和ρ印c3擴增得到突變體 Λ57Τ全長基因的編碼區DNA片段(3. 0Kb)，回收并純化PEPC全長基因片段，并將其連接到 PUCm-T載體上，轉化大腸桿菌感受態DH5 α，采用堿裂解法提取質粒DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。以重組質粒為模板，用引物P印c5和ρ印c3引物擴增得到3. Okb的PCR產物(圖3A)。根據/^/T片段上的酶切位點，用BernHl和Sma\雙酶切重組質粒，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的PEPC插入片段(圖2B)。根據陽性重組質粒pUCm-PEPC載體兩端的多克隆位點，用AfcoI和損ol雙酶切重組質粒，經瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的DNA插入片段(圖 3C)。實施例2 入門克隆載體pENTR*-PrbcS_PEPC的構建策略
Λ57Τ基因入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC的構建策略如圖4所示，首先用NcoI和XhoI 切開純化的質粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-PEPC，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后產生的載體片斷 pENTR*-PrbcS (4. Okb)及 pUCm-PEPC 被切割產生的 PEPC 基因的 DNA 片斷(3. Okb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR*_PrbcS和/^/C基因的DNA片斷產生入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC。用連接反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態細胞 DH5 α，把轉化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50 mg/ml)的平板上，于37°C過夜培養，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質粒，選出連接成功的質粒載體 pENTR*-PrbcS-PEPC，用/^/C上下游的特異性引物ρ印c5和ρ印c3進行PCR擴增，所選的質粒都能擴增出一條3. Okb的PEPC條帶(圖5A)。用NcoI和XhoI雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上有3. O kb的/^/C基因片段(圖5B)。確認是連接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 α，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒pENTR*-PrbcS-PEPC。實施例3 =PEPC基因植物表達載體pH2-35S-PrbcS_PEPC的構建策略
通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達載體pH2GW7 (Gateway 的目的載體)中(圖6)。具體的做法是用質粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pH2GW7， 在 Gateway 的 LR反應體系中加 pENTR*-PrbcS-PEPC和 pH2GW7 各 150 ng, 1 μ 1 LR ClonaseII Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25°C反應過夜，通過整合酶的作用把PrbcS-PEPC整合到pH2GW7中獲得PEPC的植物表達載體質粒pH2-35S-PrbcS-PEPC (圖6)。用反應混合物轉化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態細胞DH5 α，把轉化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素 (Spe,50 mg/ml)的平板上，于37°C過夜培養，篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質粒，選出大小和理論預測值相符的整合質粒pH2-35S-PrbcS-PEPC進行檢測， 用基因內部的酶切位點用BamHl和SmaY雙酶切重組質粒pH2-35S-PrbcS_PEPC，可以得到2. 5 kb的片段(圖7A)。確認是整合成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 α，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒。PH2GW7攜帶的篩選標記基因為潮霉素抗性基因 (Hgr)，這樣可用加有潮霉素的平板篩選轉基因植物。實施例4 用基因的植物表達載體轉化農桿菌
制備農桿菌的感受態細胞，用電脈沖法將上述構建好的植物表達載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC轉入農桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉化子。取少量質粒加入農桿菌感受態細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預冷的電轉化杯中， 輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉化杯置于電轉化儀(BIO-RAD)滑槽中，用1 mm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數進行電擊，電擊后立即取出電轉化杯，迅速加入 0.5ml SOC培養基，混勻，轉移到1.5 ml的離心管中；28°C,200 rpm搖床培養3_5h ；室溫下， 7500 rpm離心1 min，棄大部分上清，保留100 μ 1將細胞懸浮；把農桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe，50 mg/ml)的LB固體培養基上，28°C培養2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農桿菌菌落放入20 μ 1 ddH20中，98°C處理5分鐘后取出5 μ 1農桿菌裂解液作為PCR反應的模板。用/^化基因的上下游的特異性引物P印c5和ρ印c3進行PCR擴增，所選的菌落能擴增出一條3. 0 kb的條帶(圖7B)，經菌落PCR確認的轉化子菌落用于轉化植物。實施例5 用含有基因植物表達載體的農桿菌轉化煙草
挑取攜帶有質粒pH2-35S-PrbcS-PEPC的農桿菌單菌落接種于50 ml的LB培養基中(含 Spe, 100 mg/ml)，180rpm，28。C 培養 24 h，待菌液 OD6tltl 至 1. 0 左右，離心 10 min(3000rpm), 沉淀菌體。再用10 ml左右的MS液體培養基懸浮，離心10 min (3000rpm)，沉淀菌體。重復以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。 制備煙草OVicoiiaaa tabacum cv. Xanth)的無菌苗，通過農桿菌介導，用葉盤法轉化煙草，然后通過組織培養獲得小苗，進一步篩選獲得所需的轉基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農桿菌菌液中浸染15-20 min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養基MSl (MS+NAA 0.21 mg/ml+BAP 0. 02 mg/ml)上黑暗共培養2天，將外植體轉移至含潮霉素(25 mg/ml)的芽誘導培養基MS4 (MS+NAA 0.53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml) 上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉入含潮霉素(25 mg/ml)的MS培養基上進行根的誘導。實施例6 含有α基因植物表達載體的農桿菌轉化含有/^/C的轉基因煙草
挑取攜帶有質粒pPZP211-PrbcS-CS的農桿菌單菌落(見本申請人的另一項專利申請， 申請號為200710066419. 7)接種于50 ml的LB培養基中(含Spe，100 mg/ml)，搖菌及懸浮方法同實施例5。制備Λ57Τ轉基因煙草的無菌苗，通過農桿菌介導，用葉盤法轉化已插入 /WT基因的煙草，愈傷組織的培養同實施例5，將外植體轉移至含潮霉素(25 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ml)的芽誘導培養基MS4 (MS+NAA 0. 53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉入含潮霉素05 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ ml)的MS培養基上進行根的誘導。實施例7 M和/ 1基因在轉基因煙草中的插入情況及轉錄水平檢測 為了確認通過潮霉素和卡那霉素篩選的轉基因煙草株系確實含有導入的目的基因的
DNA片段，用PCR方法對篩選到的轉基因煙草作進一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片100 mg左右置于1.5 ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入 900 “1預熱到65。(的2\07^緩沖液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB觀)，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，離心10 min (7500 rpm)后轉移上清至1.5 ml EP管；再次加入500 μ 1 氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，離心10 min (7500 rpm);取出上清置于新的EP管中，加 Λ 1/10體積3Μ ρΗ5· 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20 min( 12000 rpm);棄上清，用75%乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組 DNA樣品。用Kpn I消化20 mg基因組DNA，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分離消化后的DNA， 用0.4 mol L—1 NaOH作Southern印跡，通過毛細管作用把酶切的基因組DNA轉移到尼龍膜 (Hybond-N+ membrane)上。檢測α基因的Southern雜交用生物素標記的含有α基因編碼區特異的寡核酸探針 5 ‘ -Biotin-AGACCAGAAGAGGTTTGGACTTGAAGCCACCGCACAG AGT-3 ‘ 作雜交試驗。檢測/ 1基因的Southern雜交用生物素標記的含有/ 1基因編碼區特異的寡核酸探針為 5' -Biotin- GAGGATCTCAAGCACGCCCCAGCGGTGCTGACCCAACTATT-3 ‘。在 37。C 預雜交液中預雜交6 h后，加入適量探針進行過夜雜交。雜交結束后，用洗膜液(2X SSC和 0. 1% SDS)于37°C洗膜2次，每次15 min。然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，再加入偶聯有辣根過氧化物酶的生物素抗體(Invitrogen)孵育1 h。用化學發光底物試劑盒(SuperSignal Western Blotting Kits，Pierce)檢測雜交信號。對cs的Southern雜交結果如圖8A所示，3 個 C1S 和雙轉基因煙草株系(pcsl, pcs4, pcsl4)和 3 個 pPZP211-PrbcS-cs 轉基因株系(rcsl，rcs4, rcsl4)都有2條以上的雜交帶，而野生型(WT)只有一條雜交帶，這說明所轉的^基因cDNA已成功插入轉基因煙草的基因組中。對PEPC的Southern雜交結果如圖8B所示，pcsl、pcs4和pcsl4雙轉基因株系和3個pH2-35S-PrbcS-pepc轉基因株系(P印c2，pepcl4, ρ印cl7)都有雜交帶，而野生型則沒有，這說明所轉的/ 1基因已成功插入轉基因煙草的基因組中。為了考察目的基因在轉基因煙草株系中的轉錄情況，從轉基因植物中抽取總RNA， 反轉錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測G和/ ’/C基因在轉基因植物中的轉錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA，取植物嫩葉約 0. 1 g，加入 1 ml 的 TRIzoL 提取液在研缽中研磨，室溫靜置5 min后移入離心管，再加入0. 2 ml氯仿，振蕩混勻，離心15 min (12000 rpm)，轉移上清液至新管，加入0.5 ml異丙醇，混勻室溫放置10 min，4°C離心10 min( 12000 rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇1 ml清洗，4°C離心5 min(7500 rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測質量和濃度。使用Reverse Transcriptase進行cDNA的合成，取植物總RNA約 0.1 μ g-5 μ g,oligo (dT) 50 ng, 10 mM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC處理水補足至 10 μ ，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5 min，冰浴10 min，加入反應混合物9 μ (5Xreaction buffer 4 μ 1,25 mM MgCl2 4 μ 1,0. IM DTT 2 μ 1，RNA酶抑制劑 1 μ 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫2 min，加入1 μ M-MuLV Reverse Transcriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫20 min,然后42°C 保溫70 min，合成cDNA。以cDNA為模板，檢測cs用編碼區的兩個上下游引物cs5 (5'-ATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3 ‘)和 cs3(5' -TCATGCTTTCTTGCAATGGTTC-3 ‘)，檢測 ρ印c 用位于編碼區內的兩個上下游引物P印cp5 (5' -ATTAGCTCACGGCCAACACG-3‘)和ρ印cp3 (5' -TTAGCCTGTATTGCGCAT CCC-3‘)。用煙草 18s rRNA 作為內參，擴增 18s rRNA cDNA所用上下游引物為 18S5(5' -GGGCATTCGTATTTCATAGTCAG-3‘)和 18S3(5' -AAGGGATACCTCC GCATAGC-3')。對α的RT-PCR分析結果如圖8C所示，pcsl、pcs4、pcsl4雙轉基因株系和 rcsl、rcs4、rcsl4轉基因株系α基因的轉錄水平均明顯高于野生型。%ρ印c的RT-PCR 分析結果如圖8D所示，pcsl、pcs4、pcsl4雙轉基因株系和ρ印c2、ρ印cl4、ρ印cl7轉基因株系可擴增出與正對照相同的目的條帶，而以野生型煙草則沒有明顯的目的基因條帶。這些結果說明轉入的^和/^/C基因在轉基因植物中有較高的轉錄水平。實施例8 轉基因煙草中CS和PEPC的活性分析
選取經RT-PCR分析表明有目的基因的轉錄物的轉基因煙草植株測定檸檬酸合成酶的活性。從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取0.2 g煙草葉片，加1 ml蛋白抽提液[100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ； 10% (V/V)甘油；10 mM 巰基乙醇；1 mM PMSF ；5%(ff/V) PVP]研磨，轉移至EP管中，13000 r/min離心25 min (4°C)。將上清移到新的EP管中，用Bradford方法測定植物上清中的蛋白質濃度。檸檬酸合成酶的活性測定按Anoop等(Anoop VM, Basu U, Mccammon MT, McAlister-Henn L, Taylor GJ. 2003. Modulation of citrate metabolism alters aluminium tolerance in yeast and transgenic canola overexpressing a mitochondrial citrate synthase. Plant Physiol, 132(4) : 2205—2217)的方法進fiS 原理為L-蘋果酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成草酰乙酸，而草酰乙酸極不穩定，在檸檬酸合成酶和乙酰輔酶A的作用下，能夠生成檸檬酸。在該反應中，通過測定波長為340 nm處 NADH的增加量從而獲得CS的相對酶活性。測定CS酶活性的反應體系為0.05 M Tris-HCl (pH 7. 5)，10 mM L-Malate, 10 U MDH, 0. 5 mM NAD，在 Iml 的反應體系中加入 100 μ g 煙草蛋白樣品。在紫外分光光度儀上測其340 nm處的吸收值(0D值)，待讀數穩定后，加入 10 μ L 4 mM CoA (乙酰輔酶A)，在Imin之內檢測340 nm處的吸收值。計算兩次讀數的差值，得到CS酶活性數據。其中rcsl、rcs4和rcsl4轉基因株系的CS酶活性是野生型的 2-2. 4倍，pcsUpcs4和pcsl4雙轉基因煙草的CS酶活性是野生型的2. 4-2. 6倍(圖9A)。PEPC酶活測定參照Ku等(Ku MSB, Agarie S, Nomura Μ, Fukayama H, Tsuchida H, Ono K, Hirose S, Toki S, Miyao Μ, Matsuoka Μ. 1999. High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nature Biotechnology, 17(1) : 76-80)的方法進行。反應體系為 50 mM Tris-HCl ( pH 8· O )， IOmM MgSO4,10 mM KHCO3, 5 mM 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，0. ImM NADH，蘋果酸脫氫酶(MDH， 約IOU )，反應液總體積1 ml，30°C水浴預溫10 min，以加入酶粗提物來啟動反應，迅速檢測 340 nm下每隔60 s吸光度的下降速率。結果顯示ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉基因株系的 PEPC酶活性是野生型的2. 1-2. 3倍，pcsl、pcs4和pcsl4雙轉基因煙草的PEPC酶活性是野生型的2. 2-2. 4倍(圖9B)。這也說明pcsl、pcs4和pcsl4雙轉基因煙草葉中CS和PEPC
11的酶活性都增強。實施例9 =NaH13CO3標記試驗和13C-NMR分析
為了確定在煙草葉片中過量表達的M和/確實能利用光合作用合成的糖通過糖酵解產生的PEP增加檸檬酸的合成，首先將煙草植株浸入150 mL的NaH13CO3處理液(5 mmol Γ1 NaH13CO3,0. 1% MES (w/v, pH 5. 7))中，在 25° C 條件下持續光照(100 Mmol πΓ2 s — 1) 并振蕩培養(100 rpm)5 h，然后取出煙草植株用蒸餾水洗盡植物表面的殘留的NaHuCO3，再分別置于 150 mL 含 50 μ mol Γ1 AlCl3 和不含 AlCl3 的 CaCl2 (0.5 mmol ΛρΗ4·3)溶液中，于25°C恒定光照(100 mmol m_2 s—1)下處理M h，用預冷無菌蒸餾水沖洗植物表面的處理液后，用吸水紙吸去表面水分后將葉片在液氮中速凍并在研缽中磨成粉末，加入4 mL 100 mmol L—1磷酸鉀緩沖液(KPB，pH 7. 4)抽提。抽提液在沸水浴處理3 min使酶失活后離心(12000 X g) 10 min去除細胞碎片。上清液被冷凍抽干后溶于0. 5 mL的100 mmol Γ1 KPB緩沖液中，再轉移樣品至5 mm核磁管，加入2H2O至5% (ν/ν)，并將封入毛細管的甲酰胺插入核磁管中作為內參與樣品一起進行13C-NMR分析。13C-NMR分析方法參照Chen等 (Chen LM, Yurimoto H, Li KZ, et al. Assimilation of formaldehyde in transgenic plants due to the introduction of the bacterial ribulose monophosphate pathway genes. Biosci Biotechnol Biochem, 2010，74(3) : 627-635)的方法進行，"C NMR 數據通過布魯克核磁共振儀(DRX 500-MHz)獲得，參數如下寬帶質子去耦，5-ms (90° )脈沖， 譜寬37594 Hz，采樣時間0.5 s，延滯時間1.2 s，樣品溫度保持在25° C，每個樣品采集 32000個數據點，掃描1200次，處理數據時線寬為4 Hz0樣品中各[13C]共振峰的化學位移參照馬來酸亞甲基碳原子共振峰(130. 66 ppm)。在計算不同樣品中[1-13C]代謝物的相對含量時，目標共振峰以甲酰胺為內參進行積分。用13C-NMR分析有鋁脅迫下和無鋁脅迫轉基因煙草株系(pCSl，rCSl)中CS和PEPC 催化的反應底物和產物的含量變化。用未經任何處理的野生型煙草作為對照檢測煙草葉片中各種背景1弋-NMR共振信號的水平(圖10E和圖11D)，根據預實驗結果，首先用NaHuCO3做 5 h的標記實驗，通過光合作用的CO2同化途徑使葡萄糖和果糖的碳原子被13C標記上(圖 10D)，然后再進行有鋁(圖10)和無鋁脅迫(圖11)的處理16 h，觀察進入糖的1V在有機酸中的分布。結果發現在有鋁脅迫下，在雙轉^和/76 ^基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10B) 中，PEPC反應的產物OAA的共振信號峰(22. 52 ppm)比WT (圖10C)和單轉CS基因煙草 (圖10A)的強。同時在α和/76·/^雙轉基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10B)中，CS反應的產物檸檬酸(Cit)的共振信號峰(70. 13 ppm)也比WT (圖10C)和CS轉基因煙草(圖10A) 的強，說明^的過量表達增加其合成量，使PEPC反應產生的OAA被有效轉化成Cit。在α 和/7印c雙轉基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10Β)中，蘋果酸Mal的共振信號峰(64. 93 ppm) 也比WT (圖10C)和α轉基因煙草(圖10Α)的強，說明PEPC的過量表達也增加其合成量， 可能是由于PEPC的作用生成較多的OAA也有助于Mal的合成。在無鋁脅迫下，α和/76·/^ 雙轉基因煙草的13C-NMR共振譜(圖11Α)與WT (圖11C)和CS轉基因煙草(圖11Β)相比差別不大，但是在WT的13C-NMR共振譜中發現丙酮酸(ΡΑ，15.17 ppm)比較強，而在轉基因煙草中沒有這兩種共振峰。實施例10 轉基因煙草植株根分泌檸檬酸的測定
選取形態大小相對均一的小苗，分別置于50 mL含300 μ mol Γ1 AlCl3和不含AlCl3的 CaCl2 (0.5 mmol Γ1，pH4. 3)溶液中，于 25°C 恒定光照(100 μ mol m2 下處理 72 h， 每天更換新鮮的處理液，收集處理液濃縮干燥后溶于1 mL蒸餾水中，檸檬酸的分泌量用高效液相色譜(HPLC)測定。對轉基因煙草和野生型煙草檸檬酸分泌量的分析結果如圖12所示，在無鋁脅迫的酸性條件下，rcsl、rcs4和rcsl4轉基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的 1. 8-1. 9倍，ρ印c2、pepcl4和ρ印cl7轉基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 4倍， pCSl、pCS4和pcsl4雙轉基因植株的檸檬酸分泌量是野生型的2. 5-2. 7倍(圖12A)。在300 μ mol L-1AlClJ辦迫的酸性條件下，rcsl、rcs4和rcsl4轉基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的2. 7-3. 3倍，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 5 倍，pcsUpcs4和pcsl4雙轉基因煙草的檸檬酸分泌量是野生型的3. 8-4倍(圖12B)。實施例11 轉基因煙草植株在鋁毒脅迫下根伸長速率的測定
根的相對伸長率(Al3+處理與對照(無Al3+處理)的根系伸長量的百分比。)是衡量植物耐Al性強弱的重要指標，因此我們還測定在鋁毒脅迫下轉基因煙草植株根相對生長率。 將大小均勻一致的轉基因煙草和野生型煙草幼苗，分別置于AlCl3濃度為30 μ mol/L的 CaC12溶液中。處理24小時之后，測量供試植株根的生長量，重復5次。結果表明30 μ mol Γ1的AlCl3處理煙草植株24 h后，野生型煙草根相對伸長量為39%，rcsl、rcs4和rcsl4 轉基因植株根相對伸長量為84-90%，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉基因植株的根相對伸長量為57-64%, pcsl、pcs4和pcsl4雙轉基因煙草的根相對伸長量為102-115% (圖13)。由此可見轉雙基因植株的鋁抗性比單基因煙草和野生型煙草強，其根生長不受抑制。實施例12 轉基因煙草植株在鋁毒脅迫的沙質土壤中的生長情況分析 將大小均勻一致且生根良好的轉基因煙草幼苗以及野生型煙草幼苗移載到新的珍珠
巖基質中，在溫室內進行盆栽試驗，每星期澆灌含有0.5 mM A1C13的Blaydes培養基營養液兩次，六周后觀察其生長狀況，用卷尺測定株高。用清水將根部的細沙沖洗干凈后觀測根部生長狀況，將根部烘干后測定根部干重。結果顯示rcsl、rcs4轉基因植株和pcsl、pcs4雙基因植株生長良好，并且已經出現花蕾。然而野生型煙草植株生長明顯受阻，植株矮小，發育遲緩(14A)。P印c2、p印cl4轉基因株系和野生型并沒有太明顯的差異(圖14B)。通過對煙草植株高度的測量發現rcsl、 rcs4轉基因煙草的株高為野生型煙草的1. 4-1. 5倍，ρ印c2、pepcl4轉基因煙草的株高為野生型煙草的1-1. 2倍，pcsl、pcs4雙轉基因煙草的株高為野生型煙草的1. 7-1. 8倍(圖 14C)。用清水將煙草根部沖洗干凈后觀察根部的長勢，發現rcsl、rcs4轉基因煙草和 pcsl、pcs4雙轉基因煙草根部的生物量明顯高于野生型煙草(圖15A)。將根烘干后測定其干重發現，rcsl、rcs4轉基因煙草的根部干重是野生型的2. 4 2. 5倍，ρ印c2、pepcl4轉基因煙草的根部干重是野生型的1. 2 1. 3倍，pcsl、pcs4雙轉基因煙草的根部干重是野生型的3. 4 3. 7倍(圖15B)。
1權利要求
1.一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體，其特征在于是具有光誘導啟動子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因來源于嗜熱藍藻。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述的來源于嗜熱藍藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC的一個突變體。
4.根據權利要求1或2或3所述的載體，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游為Rubisco小亞基的光誘導型啟動子。
5.根據權利要求1或2或3所述的載體，其特征在于所述載體中用于構建所屬植物表達載體的起始載體為PH2GW7。
6.一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體的構建方法，其特征在于包括下列技術方案(1)從GenBank中查找嗜熱藍藻PEPC的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點；3’端引物ρ印c3， 末端加損ol酶切位點；以本申請人構建的一個入門質粒載體pENTR 2B-KsPEPC為模板擴增得到PEPC突變體的全長編碼區的DNA片段；(2)回收并純化PEPC全長基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pUCm-PEPC ；(3)構建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP 和pUCm-PEPC，回收載體pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后連接、轉化、抽提質粒進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重組質粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；(4)構建植物表達載體pH2-35S-PrbcS-PEPC，通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達載體PH2GW7中，獲得PEPC基因的植物表達載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC0
全文摘要
本發明提供一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體及構建方法，該載體是具有光誘導啟動子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體；通過從GenBank中查找嗜熱藍藻PEPC的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物；回收并純化PEPC全長基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上；構建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC；構建植物表達載體pH2-35S-PrbcS-PEPC。本發明轉PEPC和CS基因的煙草植株檸檬酸合成酶活性是野生型煙草的2.4～2.6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型煙草的2.2～2.4倍。本發明的專用載體能在提高植物對鋁毒的耐受性方面發揮很大作用，特別是在中國南方酸性紅壤中，可顯著促進植物對鋁毒的耐受能力，因而也為植物品種改良提供了一條新途徑。
文檔編號C12N15/82GK102199620SQ201110056779
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月10日 優先權日2011年3月10日
發明者易瓊, 李昆志, 玉永雄, 王奇峰, 胡清泉, 趙玥, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學, 西南大學