一種高效海因酶表達菌固載化的方法
【專利摘要】本發明實施例提供了一種高效海因酶表達菌固載化的方法，涉及生產抗生素中間體的【技術領域】，可以加強細胞的各方面穩定性，同時能維持細胞中酶的活力而且使得高效海因酶表達菌的利用率顯著提高。所述方法包括：培養高效海因酶表達菌，然后每15mL質量分數為2.8-3.0％的海藻酸鈉溶液中加入90-100mg培養的高效海因酶表達菌；形成細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿質量分數為3％-4％的CaCl2溶液的平皿中緩慢滴入該懸浮液，形成直徑為2.8-3mm的凝膠小球；置于4℃溫度下固載化60-65min，使其固載硬化，濾去液體，得球狀顆粒，即獲得固載化的高效海因酶表達菌細胞。
【專利說明】一種高效海因酶表達菌固載化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生產抗生素中間體的【技術領域】，尤其涉及一種高效海因酶表達菌固載化的方法。
【背景技術】
[0002]D-對羥基苯甘氨酸(D-HPG)是目前國內供應較少的藥物中間體，當前微生物酶法是得到光學純D-HPG的主要方法，這里的微生物酶主要是指微生物海因酶。
[0003]目前國內需在有毒性的苯海因誘導劑存在的情況下才表達海因酶，且在生物轉化D-氨基酸過程中降低了酶的效率。
【發明內容】
[0004]本發明的實施例提供一種高效海因酶表達菌固載化的方法，可以加強高效海因酶表達菌細胞的各方面穩定性，同時能維持細胞中酶的活力而且使得高效海因酶表達菌的利用率顯著提高。
[0005]為達到上述目的，本發明的實施例采用如下技術方案:
[0006]一種高效海因酶表達菌固載化的方法，包括以下步驟:
[0007]S1、培養高效海因酶表達菌；
[0008]將在3.5_4°C中保存的高效海因酶表達菌于固體LB平板劃線，37_38°C溫度下過夜培養，第二天挑取單個菌落接種于95-100mL含磷酸鹽緩沖液的LB培養液中，37_38°C溫度下振蕩培養至0D600 0.6-0.8時，再以0.5-0.55%的接種量接種到三角瓶中，37_38°C溫度下擴大培養ll_12h，加入2-2.5%的對羥基苯海因并加入促溶劑二甲基亞砜DMS0，再在37-38°C溫度下繼續培養16-18h后，4950_5000r/min離心9-lOmin，并用中性ρΗ7.0-7.2的滅菌蒸餾水洗滌菌體，收集菌體；
[0009]S2、制備固載化的高效海因酶表達菌細胞；
[0010]取海藻酸鈉加熱溶于水中配成質量分數為2.8-3.0%的海藻酸鈉溶液，滅菌；
[0011]每15mL所述海藻酸鈉溶液中加入90-100mg步驟S1培養的高效海因酶表達菌；形成細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿CaCl2溶液的平皿中緩慢滴入該懸浮液，形成直徑為2.8-3mm的凝膠小球；置于4°C溫度下固載化60_65min，使其固載硬化，濾去液體，得球狀顆粒，即獲得固載化的高效海因酶表達菌細胞，所述CaCl2溶液的質量分數為:
3.0% -4.0%。
[0012]優選的,在步驟S2中，所述海藻酸鈉溶液的質量分數為3.0%, CaCl2溶液質量分數為4.0%，每15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量為95mg，固載化時間為60mino
[0013]上述技術方案中提供的高效海因酶表達菌固載化的方法，用海藻酸鈉包埋法對高效海因酶表達菌進行了固載化，并對其條件進行了優化。這不僅加強了細胞的各方面穩定性，同時能維持細胞中酶的活力而且使得高效海因酶表達菌的利用率顯著提高。為利用雙酶法生產D-對羥基苯甘氨酸的工業化應用鋪墊了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例提供的一種高效海因酶表達菌固載化的方法流程示意圖；
[0015]圖2為本發明實施例提供的海藻酸鈉質量分數對固載化細胞酶活力的影響曲線示意圖；
[0016]圖3為本發明實施例提供的CaCl2溶液質量分數對固載化細胞酶活力的影響曲線示意圖；
[0017]圖4為本發明實施例提供的加入的高效海因酶表達菌質量對固載化細胞酶活力的影響曲線示意圖；
[0018]圖5為為本發明實施例提供的固載化時間對固載化細胞酶活力的影響曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0020]本發明實施例提供了一種高效海因酶表達菌固載化的方法，如圖1所示，所述方法包括以下步驟:
[0021]S1、培養獲得高效海因酶表達菌。
[0022]將在3.5_4°C中保存的高效海因酶表達菌于固體LB平板劃線，37_38°C溫度下過夜培養，第二天挑取單個菌落接種于95-100mL含磷酸鹽緩沖液的LB培養液中，37_38°C溫度下振蕩培養至0D600 0.6-0.8時，再以0.5-0.55%的接種量接種到三角瓶中，37_38°C溫度下擴大培養ll_12h，加入2%的對羥基苯海因并加入促溶劑DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亞砜)，再在37-38°C溫度下繼續培養16-18h后，4950_5000r/min離心9.5-10min，并用中性PH7.0-7.2的滅菌蒸餾水洗滌菌體，收集菌體。
[0023]S2、制備固載化的高效海因酶表達菌細胞。
[0024]取海藻酸鈉加熱溶于水中配成質量分數為2.8-3.0%的海藻酸鈉溶液，滅菌；
[0025]每15mL所述海藻酸鈉溶液中加入90_100mg步驟S1培養的高效海因酶表達菌，形成細胞/海藻酸鈉懸浮液；用注射器在裝滿CaCl2溶液的平皿中緩慢滴入該懸浮液，形成直徑為2.8-3mm左右的凝膠小球；置于4°C溫度下固載化60_65min,使其固載硬化,濾去液體，得球狀顆粒，即獲得固載化的高效海因酶表達菌細胞，所述CaCl2溶液的質量分數為:
3.0% -4.0%。
[0026]優選的，海藻酸鈉質量分數為3.0%，0&(:12溶液質量分數為4.0%，高效海因酶表達菌的質量為每15mL海藻酸鈉溶液95mg高效海因酶表達菌，固載化時間變量60min。
[0027]以下用具體實施例來進行驗證:
[0028]1、海藻酸鈉溶液的質量分數為3.0%
[0029]分別取0.15g、0.3g、0.45g、0.6g、0.75g的海藻酸鈉，溶于15mL水中加熱，分別配成質量分數為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的海藻酸鈉溶液，標記為H_l、H_2、H_3、H-4、H-5，進行滅菌。將95mg的菌體細胞與5種不同質量分數的海藻酸鈉溶液均勻混合，形成細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿4.0% CaCl2溶液的5個平皿中緩慢滴入細胞/海藻酸鈉懸浮液，使成直徑約為3mm的凝膠小球。置于4°C中60min使其固載硬化。檢測各質量分數的海藻酸鈉溶液對固載化細胞酶活力的影響，結果如圖2，從圖2所示可知，海藻酸鈉溶液的質量分數為3.0%時固載化細胞酶活力最好。
[0030]2、〇&(:12溶液質量分數為4.0%
[0031]取5份0.3g海藻酸鈉，加熱溶于15mL水中配成質量分數為3.0%的海藻酸鈉溶液，進行滅菌。將95mg的菌體細胞與3.0%海藻酸鈉溶液均勻混合，形成細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿質量分數為1.0 %、2.0 %、3.0 %、4.0 %、5.0 %的CaCl2溶液的平皿C-l、C-2、C-3、C-4、C-5號中緩慢滴入細胞/海藻酸鈉懸浮液，使成直徑約為3mm的凝膠小球。置于4°C中60min使其固載硬化。檢測各質量分數的CaCl2溶液對固載化細胞酶活力的影響，結果如圖3,從圖3所示可知，0&(:12溶液質量分數為4.0%時固載化細胞酶活力最好。
[0032]3、15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量為95mg
[0033]取5份0.3g海藻酸鈉，加熱溶于15mL水中配成質量分數為3.0%的海藻酸鈉溶液，進行滅菌。分別將50mg、65mg、80mg、95mg、110mg的菌體細胞與3.0%海藻酸鈉溶液均勻混合，形成L-號、L-2、L-3、L-4、L-5細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿4.0% CaCl2溶液的5個平皿中緩慢滴入細胞/海藻酸鈉懸浮液，使成直徑約為3mm的凝膠小球。置于4°C中60min使其固載硬化。檢測15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量對固載化細胞酶活力的影響，結果如圖4，從圖4所示可知，15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量為95mg時固載化細胞酶活力最好。(圖4中的菌體包埋量即為15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量)
[0034]4、固載化時間為60min
[0035]取5份0.3g海藻酸鈉，加熱溶于15mL水中配成質量分數為3.0%的海藻酸鈉溶液，進行滅菌。將95mg的菌體細胞與3.0%海藻酸鈉溶液均勻混合，形成細胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器在裝滿4.0% CaC12溶液的5個平皿中緩慢滴入細胞/海藻酸鈉懸浮液，使成直徑約為3mm的凝膠小球。把S1-S5分別置于4°C中30min、45min、60min、75min、90min使其固載硬化。檢測各個固載化時間對固載化細胞酶活力的影響，結果如圖5，從圖5所示可知，固載化時間為60min時固載化細胞酶活力最好。
[0036]本發明實施例中對固載化細胞酶活的測定主要應用以下方法:取適量的固載化細胞，以對羥基苯海因為底物在45°C、200r/min、PH(7-8)為條件的無氧體系中做水解實驗。一段時間后取1ml的水解菌液，10000r/min離心lOmin后取上清液，然后用高效液相色譜進行分析，根據對羥基苯甘氨酸標準曲線計算固載化細胞的酶活力。
[0037]高效液相分析:在固載化細胞進行生物轉化的過程中，對底物DL-HPH以及產物D-HPG的濃度利用高效液相色譜儀(包括兩臺高壓輸液泵、紫外分光檢測器)進行檢測，色譜條件:以Kromasil-C18為固載相；流動相為乙腈:7jC:磷酸(85 % )(體積比為10: 90: 0.01);紫外檢測波長為210nm ;流速為1.0mL/min。
[0038]以海藻酸鈉為載體采用包埋法固載高效海因酶表達菌，海藻酸鈉質量分數3.0%、0&(:12質量分數4.0%、高效海因酶表達菌加量(以每15mL海藻酸鈉溶液計)95mg、固載化時間60min。該條件下得到的固載化細胞的最適反應溫度由原先的37°C提高到50°C ;經6批次連續反應，固載化細胞的酶活性仍然能夠保持在80%以上；其貯存半衰期可達到過12d。該固載化細胞在耐熱性、重復使用等方面都有較大提高。
[0039]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應所述以權利要求的保護范圍為準。
【權利要求】
1.一種高效海因酶表達菌固載化的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、培養高效海因酶表達菌； 將在3.5-4 V中保存的高效海因酶表達菌于固體LB平板劃線，37-38 V溫度下過夜培養，第二天挑取單個菌落接種于95-100mL含磷酸鹽緩沖液的LB培養液中，37-38 °C溫度下振蕩培養至0D6000.6-0.8時，再以0.5-0.55 %的接種量接種到三角瓶中，37-38°C溫度下擴大培養ll_12h，加入2-2.5%的對羥基苯海因并加入促溶劑二甲基亞砜DMSO，再在37-38°C溫度下繼續培養16-18h后，4950_5000r/min離心9-lOmin，并用中性ρΗ7.0-7.2的滅菌蒸餾水洗滌菌體，收集菌體； 52、制備固載化的高效海因酶表達菌細胞； 取海藻酸鈉加熱溶于水中配成質量分數為2.8-3.0%的海藻酸鈉溶液，滅菌； 每15mL所述海藻酸鈉溶液中加入90-100mg步驟SI培養的高效海因酶表達菌，形成細胞/海藻酸鈉懸浮液；用注射器在裝滿CaCl2溶液的平皿中緩慢滴入該懸浮液，形成直徑為2.8-3mm的凝膠小球；置于4°C溫度下固載化60_65min，使其固載硬化，濾去液體，得球狀顆粒，即獲得固載化的高效海因酶表達菌細胞，所述CaCl2溶液的質量分數為:3.0% -4.0%。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟S2中，所述海藻酸鈉溶液的質量分數為3.0%，0&(:12溶液質量分數為4.0%，每15mL海藻酸鈉溶液中加入的高效海因酶表達菌質量為95mg，固載化時間為60min。
【文檔編號】C12N11/04GK104480099SQ201410725375
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】賀瑩, 喬元彪, 趙建英, 高平, 褚盼盼, 焦紅英, 張江濤, 蘆莎 申請人:呂梁學院