本發明涉及屬于飼料領域，具體涉及一種膨化鯉魚飼料及其制備方法。
背景技術：
：微生態制劑是在微生態理論指導下，人工分離正常菌群，并通過特殊工藝制成的生物制劑，它具有補充、調整和維持動物腸道微生態平衡的功能。從而達到防治疾病、促進健康及提高生產性能的效果。它是一種綠色、環保、純生物制劑，無毒、無副作用，無殘留污染，不產生抗性，對水體不產生二次污染，因此近年來受到了廣泛的關注。以前的研究報道多見于普通顆粒飼料的添加，而在膨化飼料中添加微生態制劑的報道還沒有。主要是膨化制粒工藝需要經過膨化腔的高溫高壓過程，一般的微生態菌種存活率太低，起不到有效作用。技術實現要素：為了解決上述問題，本發明提供一種膨化鯉魚飼料。一種膨化鯉魚飼料，含有如下重量份的組分：魚粉5-10份、去皮豆粕20-40份、菜粕10-30份、面粉15-20份、米糠10-15份、豆油1-4份、膨潤土1-3份、磷酸二氫鈣1-3份、氯化膽堿0.1-0.5份、復合維生素0.1-0.5份、復合微量元素0.1-0.5份、粉狀微生態制劑0.1-0.5份和液體微生態制劑0.5-2份。在本發明優選的實施方案中，所述的膨化鯉魚飼料含有如下重量份的組分：魚粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨潤土2.1份、磷酸二氫鈣2份、氯化膽堿0.3份、復合維生素0.3份、復合微量元素0.3份、粉狀微生態制劑 0.1-0.2份和液體微生態制劑1-1.5份。其中，所述的粉狀微生態制劑中的活菌數優選為80-120億cfu/g。其中，所述的粉狀微生態制劑含有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。本領域技術人員可知，粉狀微生態制劑還可以含有本領域常規的保護劑、輔料、賦形劑等中的一種或多種。其中，所述的枯草芽孢桿菌優選為枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356，所述地衣芽孢桿菌優選為地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030，所述的短小芽孢桿菌優選為短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756。其中，所述的液體微生態制劑中的活菌數優選為10-20億cfu/ml。其中，所述的液體微生態制劑含有屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)。本領域技術人員應當知曉，液體微生態制劑還可含有其它輔料，如培養基成分、發酵次生代謝物等。其中，所述的屎腸球菌優選為屎腸球菌CGMCCNo.9134，所述的約氏乳桿菌優選為約氏乳桿菌CGMCCNo.4926。本發明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為申請人從鴨腸道中分離得到。其營養細胞桿狀，其芽孢為橢圓或長筒形，產生中生的橢圓形芽孢，孢囊膨大。革蘭氏染色為陽性。在牛肉膏蛋白胨培養基上形成白色，不透明，不規則菌落，邊緣毛發狀，無褶皺。接觸酶陽性，能利用丙酸鹽。能產生多種活性酶，如蛋白酶、纖維素酶等，提高飼料利用率，增強動物消化酶的活性，促進養殖動物的生長。本發明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)申請人已于2012年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.7030。本發明的地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030,能夠通過發酵產生高 活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進動物飼料中可以增加飼料中蛋白質、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營養成分利用率。本發明所用的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1，其顯著區別于現有的枯草芽孢桿菌，為申請人從福建蝦高位池池水中分離得到，其生物學特征如下：菌落表面光滑，半透明，呈污白色，菌落圓形，邊緣成鋸齒狀；菌落形態為桿狀，大小為0.8～1.2×1.5～4.0um，芽孢形態為橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。本發明中的枯草芽孢桿菌H8-1對濃度為2.5mg/L的氨氮、亞硝態氮降解率分別為81.72％、99.70％，能有效降解水體的氨氮和/或亞硝態氮水平。與現有的枯草芽孢桿菌區別于可以在0‰、3‰、15‰鹽濃度條件下均生長良好，可以耐受10-15℃低溫生長良好。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1已于2014年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.9356。本發明中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1為養殖水體改良微生態制劑提供了種源，以無污染和無殘留的方式降低水中有害物質如氨氮和亞硝態氮，提高養殖品質，提高養殖經濟效益，具有推廣價值。本發明中的枯草芽孢桿菌H8-1對濃度為2.5mg/L的氨氮、亞硝態氮降解率分別為81.72％、99.70％。本發明屎腸球菌分離自豬腸道，并經過紫外誘變篩選獲得。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134的特征為：(1)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液80℃處理5min，存活率為0.18％，相對出發菌株提高22倍。(2)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.3％的豬膽鹽處理3h，存活率為20.80％，相對出發菌株提高3.04 倍。(3)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.6％的豬膽鹽處理3h，存活率為21.6％，相對出發菌株提高27.69倍。將本發明的屎腸球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，登記號：CGMCCNo.9134。本發明的屎腸球菌新菌株經過10次以上的傳代培養不退化，具有遺傳穩定性，且抗逆性遠遠比出發菌株提高很多。本發明的約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)，是通過體外耐酸和耐膽鹽篩選得到的一株均有潛在益生功能的約氏乳桿菌，命名為約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCCNo.4926。本發明的膨化鯉魚飼料含有的微生態制劑能凈化水體，降低水體的氨氮和亞硝酸鹽含量，能補充鯉魚內源消化酶的不足，提高飼料轉化效率，增強鯉魚抗病能力，提高成活率。本發明制備的添加粉狀和液體微生態制劑的膨化鯉魚飼料，與對照組飼料相比，增長率增加8％以上，餌料系數顯著降低，促生長效果明顯。具體實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)CGMCCNo.4756菌粉制備短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756(公開于CN201110140925.2)種子液的制備：將保藏菌種接種至裝有100mlMNB培養基的錐形瓶中，30℃恒溫搖床中培養16h，搖床轉速為225rpm；將制備好的枯草芽孢桿菌種子液按照1％的接種量接種至裝有100mLMNB培養基 的錐形瓶中，30℃恒溫搖床中培養16h，搖床轉速為225rpm；所述的MNB培養基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸鎂，0.5g/L；硫酸錳，0.005g/L；pH7.0±0.2；通過發酵液的離心、濃縮、加入凍干保護劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數檢驗等生產程序，最終制備出粉狀活菌制劑。實施例2地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030發酵液酶活的測定將供試菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，30℃培養24h后挑取菌種，懸于0.85％生理鹽水中，血球計數板計數調節濃度約5.0×107個/mL在裝有20mL產酶培養基的100mL三角瓶內接入菌懸液2mL，自然補給氧30℃，170r/min條件下發酵培養24h,液體發酵液在5000r/min條件下離心分離15min,取上清液，即為粗酶液。纖維素酶產酶培養基配方為：蛋白胨0.9％，酵母膏1.0％，CMC-Na0.5％,pH8.0.蛋白酶產酶培養基配方為：蛋白胨1.0％,酵母膏0.5％,葡萄糖1.0％,可溶性淀粉0.5％,KH2PO40.2％,MgSO4·7H2O0.05％,CaCl2·2H2O0.02％,pH7.2。(1)纖維素酶活力測定纖維素酶活力測定：按照國標NY/T912-2004繪制標準曲線，采用DNS法測定發酵液中的纖維素酶活性。以1mL含1％(w/v)CMC-Na的pH8.0磷酸緩沖液為底物，加入0.2mL粗酶液，50℃保溫30min，然后加入2.5mLDNS試劑，沸水浴5min，冷卻至室溫后定容至5.0mL，利用分光光度計測定波長540nm處的吸光度；以煮沸滅活粗酶液加入上述底物反應液作為空白對照，以底物溶液作為陰性對照；將1mL酶液每分鐘產生1g葡萄糖量定義為1個酶活力單位，U/mL。經測定，地衣芽孢桿菌CGMCC7030的發酵粗酶液的纖維素酶 活為：230.5U/mL。(2)蛋白酶活力測定蛋白酶活力的測定：采用國標SB/T10317-1999蛋白酶活力測定法中的福林法繪制標準曲線。樣品測定：取15×100mm試管3支，編號1,2,3，每管內加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預熱2min，再各加入經同樣預熱的2％酪蛋白溶液(pH7.2)1mL,精確保溫l0min，時間到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以終止反應,繼續置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質沉淀后離心或過濾，然后另取15×150mm試管3支，編號l，2，3，每管內加入濾液1mL，再加0.4mol碳酸鈉5mL，已稀釋的福林試劑1mL搖勻，40℃保溫發色20min后在540nm下測定OD值。空白試驗也取試管3支，編號(1)，(2)，(3)，測定方法同上，唯在加2％酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入2％酪蛋白。蛋白酶活力單位定義為：1mL酶液在40℃，pH7的條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，以(U/ml)表示。福林試劑(Folin試劑)的配制方法:于200mL磨口回流裝置內，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g,鉬酸鈉(Na2MO4·2H2O)25g,蒸餾水700mL，85％磷酸50mL,濃鹽酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50g，蒸餾水50mL,混勻，加人幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅逐殘溴除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴澳液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL,用細菌濾器(2.2μm)過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。經測定，每毫升地衣芽孢桿菌CGMCC7030發酵粗酶液的蛋白 酶活力為1500U/mL。產酶試驗表明，本發明的地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030,能夠通過發酵產生高活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進動物飼料中可以增加飼料中蛋白質、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營養成分利用率，同時降低動物糞便中營養物質的含量，減輕對環境的污染，具有很高的飼用價值。實施例3地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030凍干粉的制備地衣芽孢桿菌菌粉的制備方法，包括如下的步驟(1)平板培養復壯：將地衣芽孢桿菌菌種接種于平板培養基上，于30℃培養18h，使地衣芽孢桿菌復壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種平板培養基上，30℃培養24h；所述平板培養基配方為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，瓊脂2％，pH7.0±0.2。(2)一級種子液的制備：將步驟(1)培養的地衣芽孢桿菌菌種轉接至裝有10mL培養基的試管中，30℃搖床培養16h，轉速為170rpm,使處于對數后期，得一級種子液；(3)二級種子液的制備：將步驟(2)制備的一級種子液按1％接種量接種于裝有75ml培養基的容量為250ml的錐形瓶中，30℃恒溫搖床培養16h，轉速為170rpm,得二級種子液；種子培養基配方為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，pH7.0±0.2。(4)地衣芽孢桿菌發酵液的制備：將步驟(3)中的種子液按接種量為1％接種到100L的發酵罐中，裝樣量20％，溫度30℃，轉速250rpm好氧培養至芽孢生成率80％以上，活菌數為1010CFU/ml以上,則放罐終止發酵，得地衣芽孢桿菌發酵液；所述的發酵培養基為：麩皮2％，玉米粉1％、豆粕2％,硫酸銨2％，硫酸鎂0.03％；檸檬酸銨0.5％，pH為7.0-7.4。(5)地衣芽孢桿菌凍干菌粉的制備：將步驟(4)制備的發酵液離心后，在菌泥中加入10％的凍干保護劑(凍干保護劑配方為：脫脂奶粉10％，乳糖10％，甘油0.5％，維生素C0.2％，蒸餾水79.3％)，混勻后冷凍干燥，得到水分含量＜5％的地衣芽孢桿菌菌粉，每克凍干菌粉中活菌數約為400億。實施例4枯草芽孢桿菌的篩選與鑒定取來自于天津武清、福建、江蘇魚塘和蝦塘的水樣和泥樣124個，取1mL水樣或泥樣1g于18ml試管的9mLLB液體培養基中，85℃水浴處理10min。將高溫處理后的試管放在溫度為30℃，180rpm的好氧條件下恒溫振蕩培養16h后得到富集培養液。采用倍比稀釋法將富集培養液進行梯度稀釋，涂布于LB固體培養基上，放置于30℃恒溫箱中進行培養20h，挑取平板上所生長的不同單菌落進行劃線，并純化兩次，獲得活的單菌落，共獲得275株菌。將純化兩次后的單菌落，用牙簽點種在新鮮的溶血板上，放置于30℃恒溫箱中觀察24h、48h、72h，是否出現溶血圈，根據使血細胞瓊脂溶血的能力分類：1)α溶血：草綠色溶血，菌落周圍培養基出現1～2mm的草綠色環，為高鐵血紅蛋白所致；2)β溶血：完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環，是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致；3)γ溶血：不溶血。將有溶血圈菌株淘汰。將無溶血性菌株在選擇性固體培養基上劃線，生長良好的菌株用LB液體培養，在30℃恒溫擴大培養16h。固體選擇性培養基為兩種：以NH4+-N為唯一氮源的氨氮選擇性培養基和以NO2--N為唯一氮源的亞硝態氮培養基；氨氮選擇性固體培養基為每L由(NH4)2SO40.5g，琥珀酸鈉 2.17g，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20g和余量的水組成，pH7.0-7.2，115℃高壓滅菌20min，所述維氏鹽溶液為每L由K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O2.5g，NaCl2.5g，FeSO4·7H2O0.05g，MnSO4·4H2O0.05g和余量的水組成；亞硝態氮選擇性固體培養基為每L由NaNO20.5g，琥珀酸鈉2.17g，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20g和余量的水組成，pH7.0-7.2，115℃高壓滅菌20min，所述維氏鹽溶液為每L由K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O2.5g，NaCl2.5g，FeSO4·7H2O0.05g，MnSO4·4H2O0.05g和余量的水組成。最終獲得無溶血圈且在氨氮和亞硝態氮選擇性固體培養基上生長良好的63株芽孢桿菌。在超凈臺中，將63株待測菌株菌液接入相應的篩選培養基中，接種終濃度為5×105CFU/mL，重復數為3；放入搖床中進行培養30℃，180r/min，培養48h；均勻取樣到1.5mL離心管中，12000rpm離心3min，取上清200μL加入96孔板；測定亞硝態氮時，在96孔板中加入待測樣上清液200μL后，每孔先后加入格里斯試劑A、B各20μL，于550nm比色測定；測定銨態氮時，每孔加入納氏試劑20μL，于450nm比色測定；篩選培養基為兩種：氨氮篩選培養基和亞硝態氮篩選培養基；氨氮篩選培養基為每50mL由(NH4)2SO4母液50μl，市售粉碎蝦料0.05g和余量的水組成，銨態氮濃度為：2.5mg/l；亞硝態氮篩選培養基為每50mL由NaNO2母液50μl，市售粉碎蝦料0.05g和余量的水組成，亞硝態氮濃度為：2.5mg/l。硫酸銨母液為稱取9g(NH4)2SO4加入1L模擬蝦池水，此時銨態氮濃度約為：2.5g/l；亞硝酸鈉母液為稱取3.75gNaNO2加入1L模擬蝦池水，此時亞硝態氮濃度約為：2.5g/l。選取氨氮降解率高于30％的10株菌(編號為A1-A10)或亞硝酸氮降解率高于70％的10株菌(編號為Y1-Y10)，以不接種任何菌株為陰性對照(CK)，進行重復測定。測定方法：在超凈臺中，將待測菌株菌液接入相應篩選培養基中，接種終濃度為5×105CFU/mL，重復數為3；放入搖床中進行培養30℃，180r/min，培養24h、48h；均勻取樣到1.5mL離心管中，12000r/min離心3min，取上清200μL加入96孔板。測定亞硝態氮時，在96孔板中加入待測樣上清液200μL后，每孔先后加入格里斯試劑A、B各20μL，于550nm比色測定；測定氨氮時每孔加入納氏試劑20μL，于450nm比色測定。定性測定：測定亞硝態氮時，溶液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等表示有亞硝酸鹽還原，反應為陽性，即顏色越淺說明降解效果越佳；測定銨態氮時，溶液變為橙色、黃色等為陽性反應，淺為佳。定量測定：制定亞硝態氮濃度(Y1)與測定OD值(X1)之間參考標準曲線及氨氮濃度(Y2)與測定OD值(X2)之間參考標準曲線。篩選培養基包括氨氮篩選培養基和亞硝態氮篩選培養基；氨氮篩選培養基：(NH4)2SO4母液50μl，蝦料0.05g，蒸餾水50mL，氨氮濃度約為：2.5mg/L，121℃滅菌。硫酸銨母液：稱取9g(NH4)2SO4加入1L蒸餾水，此時銨態氮濃度約為：2.5g/l。亞硝氮篩選培養基：NaNO2母液50μl，蝦料0.05g，蒸餾水50mL，亞硝氮濃度約為：2.5mg/l，121℃滅菌。亞硝酸鈉母液：稱取3.75gNaNO2加入1L蒸餾水，此時亞硝態氮濃度約為：2.5g/l。格里斯氏試劑(Griess)A：對氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光，4℃保存。格里斯氏試劑B：α萘胺0.1g，蒸餾水20mL,稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光4℃保存。納氏試劑：現購即可，4℃保存。結果如表1和表2所示，H8-1的平均氨氮降解率為81.72％，平均亞硝降解率為99.70％，降氮能力最高。表110株優選菌株氨氮降解率比較測定(A10號為H8-1)菌株號A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10ck24h氨氮34.09630.00019.78945.70237.72839.98559.57421.27775.48779.5720.01148h氨氮45.89735.78638.93156.97140.30244.81831.40540.62661.07983.8730.441表210株優選菌株亞硝態氮降解率比較測定(Y10號為H8-1)菌株號Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9Y10ck24h亞硝83.12174.37490.67192.33275.62974.50690.46795.71492.19699.6030.00248h亞硝83.01874.50890.12893.67175.45770.16592.46796.54194.46799.8062.443將篩選到的枯草芽孢桿菌H8-1于2014年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.9356。實施例5不同鹽濃度條件下H8-1生長情況比較使用鹽度分別為0‰、3‰、15‰的水配制LB固體培養基，用滅菌后的牙簽點種H8-1在不同鹽度的平板上，放置于30℃培養箱中培養16h，觀察平板上菌落生長情況。培養后發現，點種在三種鹽度不同的平板上的菌落生長均良好，生長完成后的菌落大小較一致，說明H8-1耐鹽性能強。LB培養基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化鈉10g/L；瓊脂粉15g/L。用鹽度計配制鹽度分別為0‰、3‰、15‰的水，進行培養基的配制。實施例6不同鹽濃度條件下H8-1降氮性能測定結果見表3，如表所示，在0‰、3‰、15‰鹽度下，H8-1的降氮性能有所差別，但受鹽度的影響很小。表3在不同鹽度下測定H8-1的降氮性能氨氮篩選培養基：(NH4)2SO4母液50μl，蝦料0.05mg，分別使用不同鹽度的水(0‰鹽度的水：蒸餾水；3‰和15‰鹽度的水:添加海鹽到蒸餾水中，用鹽度計測定，達到鹽度分別為3‰和15‰)50mL，氨氮濃度約為：2.5mg/L，121℃滅菌。硫酸銨母液：稱取9g(NH4)2SO4加入1L蒸餾水，此時銨態氮濃度約為：2.5g/l。亞硝氮篩選培養基：NaNO2母液50μl，蝦料0.05mg，不同鹽度的水50mL，亞硝氮濃度約為：2.5mg/l，121℃滅菌。亞硝酸鈉母液：稱取3.75gNaNO2加入1L蒸餾水，此時亞硝態氮濃度約為：2.5g/l。實施例7在低溫條件下H8-1生長情況用滅菌后的牙簽點種H8-1單菌落在LB固體平板上，分別放置在溫度為10℃、15℃、30℃培養箱中24h，觀察平板上菌落生長情況。培養后發現，在10℃和15℃培養箱中生長的平板上菌落大小相似，均為生長在30℃培養箱中平板上菌落大小的1/2，這說明H8-1在溫度較低的養殖環境中也能夠正常生長而發揮降氮功能。LB固體培養基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化鈉10g/L；瓊脂粉15g/L。實施例8枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356菌粉的制備：枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保藏菌種接種至裝有100mlMNB培養基的錐形瓶中，30℃恒溫搖床中培養16h，搖床轉速為225rpm；將制備好的枯草芽孢桿菌種子液按照1-3％的接種量接種至裝有100mLMNB培養基的錐形瓶中，30℃恒溫搖床中培養16h，搖床轉速為225rpm；所述的MNB培養基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0 g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸鎂，0.5g/L；硫酸錳，0.005g/L；pH7.0±0.2；通過發酵液的離心、濃縮、加入凍干保護劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數檢驗等生產程序，最終制備出粉狀活菌制劑。實施例9粉狀微生態制劑制備將制備的枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356的菌粉、地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030的菌粉，短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756的菌粉按重量比1:1:1混合后，即得本發明的分裝芽孢桿菌，粉狀微生態制劑中的活菌數約為110億cfu/g。實施例10約氏乳桿菌CGMCCNo.4926發酵液的制備1)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCCNo.4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于10mL深層MRS液體試管，37℃培養10小時后，以1％接種量轉接于250mLMRS液體培養基，培養10小時后作為種子液；2)以5％的接種量將步驟1)所得的種子液接種于5L的發酵罐中培養；3)發酵過程中維持發酵液pH值為6.0，當pH超過設定值時，補加料液；當pH低于設定值時，自動流加堿性中和劑氨水；在溫度37℃、轉速100rpm條件下發酵14小時，發酵過程通入N2，維持溶氧小于1％；4)當補加料液pH不再降低或發酵液在600nm波長下的吸光值(即OD600)不再增加時，終止發酵，即得約氏乳桿菌活菌數達1011cfu/ml以上的發酵液。實施例11屎腸球菌CGMCCNo.9134菌液制備1)培養基滅菌：培養基配方：10g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L 硫酸鎂、15g/LNaCl、15％CaCO3。配制培養基，注水(自來水即可)，滅菌溫度為115℃，時間為20min，調節pH值至6.8；2)穩定理化指標：發酵罐轉速50rpm，通風1:0.1vvm，罐壓維持在0.05MPa，液體理化指標穩定后，標定溶解氧。3)接種發酵：按照1％的比例接種，培養條件：溫度20℃，轉速50rpm，罐壓為0.01兆帕，通風量為1:0.1vvm。該狀態下，培養10h下罐，下罐時活菌數為1×109cfu/ml以上。實施例12液體微生態制劑制備將屎腸球菌CGMCCNo.9134的發酵液與約氏乳桿菌CGMCCNo.4926按體積比1:1的比例進行混合，即得本發明的液體微生態制劑，其中，活菌數約為20億cfu/ml。實施例13鯉魚膨化飼料制備魚粉10份、去皮豆粕40份、菜粕10份、面粉20份、米糠15份、豆油4份、膨潤土1份、磷酸二氫鈣3份、氯化膽堿0.1份、復合維生素0.5份、復合微量元素0.5份、粉狀微生態制劑0.5份和液體微生態制劑0.5份。按重量份稱取魚粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態制劑混合均勻后投入到超細微粉碎機中，粉碎成90％過80目的粉狀飼料，再進行膨化制粒；膨化制粒后通過后噴涂將液體微生態制劑添加到顆粒表面，烘干。實施例14鯉魚膨化飼料制備魚粉5份、去皮豆粕20份、菜粕30份、面粉15份、米糠10 份、豆油1份、膨潤土3份、磷酸二氫鈣1份、氯化膽堿0.5份、復合維生素0.1份、復合微量元素0.1份、粉狀微生態制劑0.1份和液體微生態制劑2份。按重量份稱取魚粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態制劑混合均勻后投入到超細微粉碎機中，粉碎成90％過80目的粉狀飼料，再進行膨化制粒；膨化制粒后通過后噴涂將液體微生態制劑添加到顆粒表面，烘干。實施例15鯉魚膨化飼料制備魚粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨潤土2.1份、磷酸二氫鈣2份、氯化膽堿0.3份、復合維生素0.3份、復合微量元素0.3份、粉狀微生態制劑0.2份和液體微生態制劑1.5份。按重量份稱取魚粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態制劑混合均勻后投入到超細微粉碎機中，粉碎成90％過80目的粉狀飼料，再進行膨化制粒；膨化制粒后通過后噴涂將液體微生態制劑添加到顆粒表面，烘干。試驗例1本試驗于2015年7月5日至9月5日在大北農集團唐山玉田水產試驗基地進行，共4組試驗，1個對照組和3個試驗組。試驗組1-3分別為實施例13-15制備的膨化鯉魚飼料，對照組其他成分同實施例15，區別在于不添加微生態制劑。每個試驗組設4個重復，共16個養殖桶(800L/桶)，每桶放30尾鯉魚(50.13±0.15克)。養殖期間日投飼率為體重的3％，上下午各投喂一次，每兩周稱重調整一次投喂量。每天下午換水1/3，以保證養殖水體符合漁業養殖水質標準要求，試驗結束后每桶隨機取5尾魚測定體長、體重等生長指標。試驗結束后各組鯉魚的成活率均為100％，其生長數據測定結果見表4：表4各試驗組生長指標組別魚體初重(g)魚體末重(g)增重率％餌料系數肥滿度％對照組50.28±0.0777.67±2.2854.48±3.60a2.15±0.18a2.56±0.05a試驗組150.10±0.2581.48±3.1562.63±4.25b2.03±0.21b2.48±0.11a試驗組250.08±0.1582.38±3.0764.49±4.19b1.98±0.25b2.53±0.13a試驗組350.06±0.1283.17±2.1266.14±3.59b1.86±0.21b2.64±0.12b注：同一列中具不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)。從增重率來看，本發明的3個試驗組的增重率均顯著高于對照組，其中試驗組1高于對照組8.15％，試驗組2高于對照組10.01％，試驗組3高于對照組11.66％；餌料系數方面，3個試驗組也顯著低于對照組；從肥滿度來看，試驗組3顯著高于對照組。由以上分析結果可知，膨化飼料中添加微生態制劑后，可以顯著提高鯉魚的生長速度，降低餌料系數。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3