本發明屬于飼料添加劑領域，具體涉及三硝酸甘油酯的應用。
背景技術：
瘤胃甲烷生成不僅導致5～7％的反芻動物飼料能量損失，還是溫室氣體的重要來源，羊每年平均產10～16kg甲烷，牛平均為60～160kg。因此，對反芻動物甲烷抑制劑的研究應用，不僅能提高動物的能量利用效率和生產性能，還具有良好的生態效益。雖然已有各種各樣的飼料添加劑(如天然植物提取物、離子載體、多鹵素化合物、電子受體、油脂等)被研究開發，但均存在不同的問題，如長效性、安全性和微生物耐受性等問題。這些缺陷限制了已有添加劑的廣泛應用。硝酸鹽是近年來研究較多的，也是較有應用前景的瘤胃甲烷抑制劑，但其在瘤胃中代謝的中間產物亞硝酸鹽，能夠經瘤胃壁進入血液引起高鐵血紅蛋白血癥，危害動物健康。雖然安全應用硝酸鹽的研究已經開展，但仍有較長一段路要走。因此，一種新的，高效的反芻動物甲烷抑制劑是社會所亟需的。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供三硝酸甘油酯在制備甲烷菌抑制劑中的應用，已解決現有技術存在的長效性、安全性和微生物耐受性不足等問題。
本發明還要解決的技術問題是提供三硝酸甘油酯作為動物飼料添加劑的應用。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
三硝酸甘油酯在制備甲烷菌抑制劑中的應用。
三硝酸甘油酯的結構式如下：
其中，所述的甲烷菌為瘤胃甲烷菌。
其中，所述的甲烷菌抑制劑為反芻動物甲烷菌抑制劑。
三硝酸甘油酯作為動物飼料添加劑的應用也在本發明的保護范圍之內。
其中，所述的動物為反芻動物。
其中，所述的應用是指三硝酸甘油酯作為動物飼料添加劑在抑制動物瘤胃甲烷中的應用。
有益效果：
與現有技術相比，本發明具有如下優勢：
硝酸甘油酯能夠通過自身的硝酸酯官能團(-O-NO2)氧化甲烷菌甲基輔酶M還原酶的鎳(+1)活性中心。甲基輔酶M還原酶是甲烷菌甲烷生成途徑中的關鍵酶，它的失活將阻斷甲烷生成。實驗證明硝酸甘油酯具有長期抑制瘤胃甲烷生成的能力。
與目前研究較廣的瘤胃甲烷抑制劑硝酸鹽相比，其安全性更高，因為硝酸甘油酯在瘤胃代謝過程中，不易導致亞硝酸鹽過量積累。在實施的體外實驗和動物體內實驗中均未檢出亞硝酸鹽離子累積。此外，硝酸甘油酯作為人類長期使用的心臟病治療藥物，其藥理性質已非常明確，不會對動物和人類健康造成未知危害。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例1
1材料方法
1.1實驗材料
1.1.1試驗動物及瘤胃液采集
試驗動物為4頭裝有永久性瘤胃瘺管的湖羊。飼喂苜蓿干草，自由飲水。每天08:00和16:00分兩次飼喂。試驗當天，在晨飼前半小時取瘤胃液，從4頭瘺管羊取得新鮮瘤胃液迅速裝入預先通入二氧化碳的保溫瓶帶回實驗室。
1.1.2人工瘤胃發酵液制備
發酵液的配制參照Menke和Steingass(1988)的方法。將采集的新鮮瘤胃液用4層紗布過濾，量取1250mL的瘤胃液迅速倒入已準備好的3750mL的人工緩沖液中，瘤胃液與緩沖液按1:3(v/v)的比例混合，制成混合人工瘤胃培養液。將混合后的發酵液分裝到180mL發酵瓶中，整個過程的溫度保持在39℃，持續通入純二氧化碳以保持厭氧環境(以刃天青變成無色來判斷)，用磁力攪拌器攪拌以保持瘤胃液與緩沖液混合均勻。發酵瓶中預先添加0.5g粉碎苜蓿干草和0.5g玉米粉以及不同劑量的甲烷菌抑制劑置于39℃的恒溫培養箱中預熱30min。然后向發酵瓶中通入二氧化碳以保證發酵瓶中為厭氧環境。分裝完畢后，在恒溫振蕩器39℃，100r/min條件下培養24小時。
1.1.3甲烷菌抑制劑
三硝酸甘油酯(Nitroglycerin，NG)
1.1.4厭氧真菌培養基制備
培養基制備參照Davies等(1993)的方法配制：由緩沖液、基礎培養基、無細胞瘤胃液、還原劑和氧化還原指示劑組成。底物為水稻秸稈，直徑約為1mm，添加量為1％(w/v)。
1.2試驗方法
1.2.1試驗設計
實施例1：試驗設3個組，對照組(不添加任何藥物)，硝酸甘油組1(6.6μm/L)和硝酸甘油組2(33μm/L)。
實施例2：試驗設4個組，對照組(不添加任何藥物)，硝酸甘油組1(6.6μm/L)，硝酸甘油組2(13.2μm/L)和硝酸甘油組3(19.8μm/L)。
1.2.2化學分析
發酵結束時，立即測定總產氣量，H2和CH4和pH。取2mL發酵液，13 000r/min和4℃條件下離心10min取1.5mL上清液，加入0.2mL 25％偏磷酸固定，靜置15min后，-20℃保存，后續用于揮發性脂肪酸的測定。
總產氣量的測定參照Theodorou等(1994)的方法,用氣壓轉換儀測定發酵瓶內產氣量。
H2和CH4使用安捷倫7890B氣相色譜儀測定。汽化室溫度：200℃；色譜柱(Porapak Q packing&MolSieve 5A packing，Agilent)，柱溫80℃；TCD檢測器：200℃；載氣為N2。
揮發性脂肪酸參照Pontes等[13]方法檢測。采用安捷倫7890B氣相色譜儀。汽化室220℃；色譜柱為FUSED SILICA毛細管柱(Supelco)，柱溫40℃，4min；40-110(40℃/min)；110℃，2min；110-150(40℃/min)；150℃,5min梯度升溫。氫離子火焰檢測器FID：250℃。載氣為氮氣。樣品經偏磷酸酸化，內標為巴豆酸。
乳酸參照Barker&Summerson(1941)方法測定。
干物質消失率參照朱偉云等(2001)方法測定。
1.2.3微生物濃度測定
微生物濃度定量分析采用Premix Ex TagTM(TaKaRa)試劑，Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System。利用含有目的基因片段的質粒制備標準曲線，計算目的基因在樣品中的濃度。本文中使用的PCR引物如下所列。
本文中使用的PCR引物
1.3數據統計處理
數據采用SPSS 20.0軟件中的One-way ANOVA(Tukey)進行分析，置信區間為95％。
由表1可見，與對照組(未添加組)相比，添加6.6μm/L的硝酸甘油酯能夠減少33.2％的甲烷生成量，添加33.0μm/L的硝酸甘油酯能夠完全抑制甲烷生成。對短鏈脂肪酸的檢測顯示(表2)，添加硝酸甘油酯改變了短鏈脂肪酸的組成，乙酸濃度降低，丙酸和丁酸濃度升高，但總短鏈脂肪酸的濃度沒有顯著變化。
表1發酵24小時氣體產生量
表2發酵24小時短鏈脂肪酸生成量
由表3所示，添加33.0μm/L的硝酸甘油顯著降低了甲烷菌數量，但沒有顯著影響瘤胃厭氧真菌的數量、瘤胃原蟲和細菌的數量。在瘤胃中，細菌和原蟲是降解飼料的主要菌群，而厭氧真菌是首先定殖到植物片段的菌群之一，他們在瘤胃植物細胞壁降解過程中起著重要作用。試驗結果表明硝酸甘油對瘤胃甲烷菌的抑制具有專一性。
表3添加硝酸甘油酯對瘤胃甲烷菌、細菌、真菌和原蟲的影響
實施例2硝酸甘油酯直接作用于甲烷菌的驗證試驗
試驗采用厭氧真菌和甲烷菌的共培養物驗證。由表4可見，6.6μm/L的硝酸甘油酯完全抑制共培養物的甲烷生成，同時積累了大量的氫氣。氫氣的大量積累暗示硝酸甘油沒有抑制厭氧真菌的活性，而是直接作用于甲烷菌。甲烷菌活性受到抑制后，導致氫氣大量積累，氫氣累積反饋抑制了厭氧真菌的能量代謝通路，導致總產氣量和底物消失率的降低。硝酸甘油酯直接作用于甲烷菌，抑制其生成甲烷的活性，這與抑制劑的設計篩選目標相符。隨著硝酸甘油劑量的增加，總產氣量、底物消失率和氫氣積累量均顯著降低，暗示大劑量的硝酸甘油酯能夠抑制厭氧真菌的活性。這一結果要求硝酸甘油酯的使用要嚴格控制劑量。
表4硝酸甘油對厭氧真菌和甲烷菌體外共培養發酵稻草的影響