本發明涉及一種復合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制備方法。
背景技術：
螺旋藻含有大量蛋自質、甘油三酯、色素、多糖等活性物質。其蛋白質在食品、醫藥、飼料等領域具有重要應用價值；而其甘油三酯，不但可作為重要營養保健品，且可作為生物能源(生物柴油)重要油料來源。螺旋藻所含的優質蛋白質和多種活性營養成分，其營養價值和保健功能已被廣泛認同。螺旋藻蛋白由18種氨基酸組成并含有8種必需氨基酸，除作為營養補充劑之外，還有提高免疫力和抗腫瘤功效。螺旋藻富含長鏈多不飽和脂肪酸如DHA、EPA等，這些物質有利于人類生理健康調理和維護，補充營養，防止疾病的發生。DHA是一種重要的生物活性物質，有利于智力開發，尤其對于嬰幼兒，而EPA可降低血液低密度脂蛋白膽固醇及甘油三酯的含量。市場流通的螺旋藻商品主要以干粉形式直接應用于食品行業，針對當前流行的保健品螺旋藻片“包治百病”的不合理性，我們采用復合酶法將螺旋藻中的活性油脂和活性蛋白分離，制成具有不同的生物活性的保健品原料，便于不同功效保健品的后續開發。
國內外對于螺旋藻成分的功效研究和有效成分提取分離已經有大量的研究，但是大多還是在實驗室研究階段，不適合規模化生產，而且也只對其中的某一活性成分提取而舍棄其他有效成分，造成資源浪費，以保健品工業原料為目的的活性油脂及活性蛋白有效成分分離提取研究并同時利用未見報道。本發明采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶等生物酶按比例組成復合酶，用安全無毒的溶劑（乙醇）提取螺旋藻活性油脂，水解分離活性蛋白，在提取油脂的同時利用蛋白，使資源利用最大化，而且技術工藝條件溫和、高效、低成本，適合產業化，這應該是螺旋藻資源充分利用的一個大趨勢。
現有技術未有同步提取螺旋藻活性蛋白和活性油脂方法，對于螺旋藻有效成分提取大多只對其中的某一成分提取而舍棄其他成分，造成資源浪費。目前螺旋藻主要以干粉形式直接應用于保健食品行業，由于其溶解性的局限性，其應用受到一定的限制，同時利用螺旋藻活性蛋白質和活性油脂，充分利用資源是螺旋藻應用的一個關鍵問題。
由于螺旋藻細胞較小、且具細胞壁結構，油脂都包裹在微藻細胞內，因此采用細胞破壁后進行提取是目前利用油脂一個難點。現有技術對螺旋藻油脂提取的傳統方法是通過破壁后用有機溶劑提取，主要有機械超微粉碎破壁、熱化學破壁提取、超臨界流體提取、亞臨界流體提取、超聲波、微波輔助提取法、脈沖電磁場法等技術。也有學者用水酶法對其他微藻油脂進行提取，但是未見螺旋藻油脂酶法提取的完整報道。
對于螺旋藻蛋白質的提取主要有用水作為溶劑控制溫度和pH值進行提取，也有用胃蛋白酶、堿性蛋白酶或木瓜蛋白酶等單一酶種進行提取。
國內外對于螺旋藻成分的功效研究和有效成分提取分離已經有大量的研究，但是大多還是在實驗室研究階段，不適合規模化生產，大多也只對其中的某一活性成分提取而舍棄其他有效成分，造成資源浪費，未見有以保健品工業原料為目的的活性油脂及活性蛋白有效成分分離提取并同時利用的研究。
細胞破壁后用有機溶劑提取油脂的方法，由于細胞內存在脂蛋白和脂多糖，不僅阻礙油脂的提取，而且這些復合物本身會對油分子起包埋作用，傳統的熱處理難以打破這種包埋，熱處理也會降低油脂的生物活性。單一酶種提取油脂雖然能夠降解部分包埋復合物，但是對于細胞中的多糖類物質降解不充分，出現一定的乳化現象，影響油脂提取率。用單一蛋白酶提取蛋白質也是由于對多糖類物質降解不完全，影響工具酶的作用力而降低小分子的高活性多肽和氨基酸生成。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明目的是提供一種能較完全的提取活性油脂類物質，油脂品質好，提取率高。酶解條件溫和，蛋白質不變性，水解更加徹底，小分子蛋白質活性更高，更易被吸收。將活性物質分成油脂和水解蛋白兩部分，其產品更具針對性和競爭力。使用食用乙醇作為油脂提取溶劑，避免了毒性溶劑殘留的風險，產品更安全的復合酶法同步提取螺旋藻油脂和水解蛋白的制備方法。
本發明包括以下步驟：
步驟1.配制復合酶：準確稱取商品工業酶纖維素酶（80000～100000U/g）、果膠酶（80000～100000U/g）和木瓜蛋白酶（80000～100000U/g），按纖維素酶:果膠酶:木瓜蛋白酶=1:1:2的重量比例混合均勻作為復合酶備用；
步驟2.酶解反應：稱取螺旋藻干粉，置于控溫酶解反應罐中，按比例添加0.8-1.2%重量的復合酶，按螺旋藻干粉加10倍重量的水，用10%的氫氧化鈉或10%的鹽酸調節pH值至6.5-7.5之間，調節反應溫度為35-45℃，保溫酶解反應20-24小時；
步驟3.滅活：將控溫酶解反應罐溫度調升至80-90℃，保持15-20分鐘，關閉加熱器，打開出料蓋，自然降溫至室溫，得到糊狀的酶解物；
步驟4.真空干燥：將步驟3得到糊狀的酶解物裝于真空干燥盤中，放進真空干燥箱中開機干燥，調節溫度為50-60℃、壓力-80～-100KPa，待物料基本成為固體時關機翻動物料以提高干燥速度并使物料干燥均勻， 干燥3-5小時后關機取樣測定物料水分含量，水分含量低于5%則視為干燥完成，取出物料裝于密閉容器中備用；
步驟5、滲漉提取：把上述干料用破碎機打粉，過12目篩網，裝于滲漉筒中，用95%食用乙醇滲漉提取，收集滲漉液，至漉出液接近無色為提取完全；
步驟6.回收乙醇，收油除雜質：滲漉液蒸餾回收乙醇至粘稠狀，裝于開口鍋中用水浴攪拌揮去多余的乙醇，剩余液體裝于不銹鋼容器中，加等容量的2-3%鹽水攪拌均勻，以洗除油脂中的水溶性雜質，靜置60-72小時，吸取上層近透明的液體即為螺旋藻油脂成品，分裝于密閉容器中；
步驟7.真空干燥粉碎，收集水解蛋白：取滲漉殘渣于真空干燥箱中，調節溫度為50-60℃、壓力-80～-100KPa,干燥至水分含量低于3-5%，粉碎過100目篩，密閉分裝即為螺旋藻水解蛋白粉。
本發明所述的百分比，除特別說明外，均為質（重）量百分比。
本發明的有益效果是，由于采用上述技術方案，本發明經過酶解和提油后得到螺旋藻活性油脂油和活性水解蛋白兩大類物質，活性油脂經過進一步提取分離得到DHA和EPA等長鏈不飽和脂肪酸，可以作為食品添加劑或醫藥保健品原料直接銷售，也可以把油脂直接制成保健品螺旋藻油軟膠囊或其他功能制品。活性水解蛋白可以直接制成螺旋藻水解蛋白片或口服液等保健品制劑，也可以作為如嬰幼兒奶粉、米粉等食品添加劑。螺旋藻活性油脂因含有長鏈不飽和脂肪酸而具有降血脂、抗氧化衰老、抗輻射等作用；活性水解蛋白能有效清除自由基對組織細胞的損害，提高免疫功能，預防疾病而促進人體健康。這兩類活性物質因其營養價值和特有的功效作為食品添加劑和保健品原料具有廣闊的應用前景。實驗結果表明用復合酶能有效降解螺旋藻細胞壁，打破脂蛋白和脂多糖對油脂的包埋作用，消除蛋白果酸和磷脂等兩性物質的乳化作用，提高油脂收率，油脂回收率達到90%以上；復合酶對螺旋藻蛋白也有顯著的水解效果，水解率達到80%以上。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明的技術方案做進一步說明
實施例1：準確稱取纖維素酶0.5克（80000～100000U/g），果膠酶0.5克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶1.0克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，搖晃混合均勻，配制為復合酶。另稱取螺旋藻干粉200克，與復合酶一起置于2500毫升燒杯中，量取2000毫升（或稱重2000克）蒸餾水緩慢加入燒杯中，邊加邊用玻璃棒攪拌均勻，用pH試紙測試pH值，如果不在6.5-7.5范圍內，則必須滴加10%的氫氧化鈉或10%的鹽酸試劑調節pH值至7.0，開口封蓋牛皮紙，將燒杯移進恒溫箱中，開啟恒溫箱電源，把溫度表刻度調至35℃，恒溫保持酶解反應20小時。酶解時間到達終點后，把恒溫箱溫度調節至80℃保持15分鐘將酶活性滅失。關閉電源，取出燒杯，打開紙封，自然降溫至室溫，得到糊狀酶解物。將上述糊狀的酶解物裝于真空干燥盤中，放進真空干燥箱中開機干燥，調節溫度為50℃、壓力-80KPa，待物料基本成為固體時關機翻動物料以提高干燥速度并使物料干燥均勻，約3-5小時關機取樣測定物料水分含量，如水分含量低于5%則視為干燥完成。干料破碎，過12目篩網，裝于滲漉筒中，用95%食用乙醇滲漉提取，收集滲漉液，至漉出液接近無色為提取完全；滲濾液蒸餾回收乙醇，滲漉液回收乙醇至粘稠狀，裝于燒杯中用水浴攪拌揮去多余的乙醇，加等容量的2%鹽水（重量比）攪拌均勻，以洗除油脂中的水溶性雜質，靜置60小時，吸取上層近透明的液體即為螺旋藻油脂成品，分裝于密閉容器中。取滲漉殘渣于真空干燥箱中，調節溫度為50℃、壓力-100KPa,干燥至水分含量低于3%，粉碎過100目篩，密閉分裝即為螺旋藻水解蛋白粉。
實施例2：準確稱取纖維素酶2.5克（80000～100000U/g），果膠酶2.5克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶5.0克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，搖晃混合均勻，配制為10克的復合酶。另稱取螺旋藻干粉1000克，與復合酶一起置于15升不銹鋼桶中，稱重10公斤蒸餾水緩慢倒入桶中，邊加邊攪拌均勻，用pH試紙測試pH值，如果不在6.5-7.5范圍內，則必須添加10%的氫氧化鈉或10%的鹽酸試劑調節pH值至7.0，疊加桶蓋，將桶移進恒溫箱中，開啟恒溫箱電源，把溫度表刻度調至45℃，恒溫保持酶解反應24小時。酶解時間到達終點后，把恒溫箱溫度調節至90℃保持20分鐘將酶活性滅失。關閉電源，取出燒杯，打開紙封，自然降溫至室溫，得到糊狀酶解物。將上述糊狀的酶解物裝于真空干燥盤中，放進真空干燥箱中開機干燥，調節溫度為60℃、壓力-100KPa，待物料基本成為固體時關機翻動物料以提高干燥速度并使物料干燥均勻， 5小時關機取樣測定物料水分含量，如水分含量低于5%則視為干燥完成。干料破碎，過12目篩網，裝于滲漉筒中，用95%食用乙醇滲漉提取，收集滲漉液，至漉出液接近無色為提取完全；滲濾液蒸餾回收乙醇，滲漉液回收乙醇至粘稠狀，裝于燒杯中用水浴攪拌揮去多余的乙醇，加等容量的3%鹽水（重量比）攪拌均勻，以洗除油脂中的水溶性雜質，靜置72小時，吸取上層近透明的液體即為螺旋藻油脂成品，分裝于密閉容器中。取滲漉殘渣于真空干燥箱中，調節溫度為60℃、壓力-80KPa,干燥至水分含量低于3%，粉碎過100目篩，密閉分裝即為螺旋藻水解蛋白粉。
實施例3：準確稱取纖維素酶50克（80000～100000U/g），果膠酶50克（80000～100000U/g），木瓜蛋白酶100克（80000～100000U/g），置于具塞玻璃三角瓶中，搖晃混合均勻，配制為200克的復合酶。另稱取螺旋藻干粉20公斤，與復合酶一起置于控溫酶解反應罐中，稱重200公斤蒸餾水緩慢倒入罐中，邊加邊攪拌均勻，用pH試紙測試pH值，如果不在6.5，則必須添加10%的氫氧化鈉或10%的鹽酸試劑調節pH值至7.0，把罐蓋蓋上，開啟反應罐電源，把溫度表刻度調至40℃，恒溫保持酶解反應22小時。酶解時間到達終點后，把溫度調節至85℃保持17分鐘將酶活性滅失。關閉電源，使溫度降至室溫，得到糊狀酶解物。將酶解物倒裝于真空干燥盤中，放進真空干燥箱中開機干燥，調節溫度為55℃、壓力-85KPa，待物料基本成為固體時關機翻動物料以提高干燥速度并使物料干燥均勻，4小時關機取樣測定物料水分含量，如水分含量低于5%則視為干燥完成。干料破碎，過12目篩網，裝于滲漉筒中，用95%食用乙醇滲漉提取，收集滲漉液，至漉出液接近無色時為提取完全；滲濾液蒸餾回收乙醇，滲漉液回收乙醇至粘稠狀，裝于不銹鋼桶中用水浴攪拌揮去多余的乙醇，加等容量的2.5%鹽水（重量比）攪拌均勻，以洗除油脂中的水溶性雜質，靜置66小時，吸取上層近透明的液體即為螺旋藻油脂成品，分裝于密閉容器中。取滲漉殘渣于真空干燥箱中，調節溫度為55℃、壓力-90KPa,干燥至水分含量低于4%，粉碎過100目篩，密閉分裝即為螺旋藻水解蛋白粉。
本發明的原理是：應用復合酶降解螺旋藻細胞壁，打破脂蛋白和脂多糖對油脂的包埋作用，消除蛋白果酸和磷脂等兩性物質的乳化作用，提高油脂收率，提高蛋白質水解度。本發明能較完全的提取活性油脂類物質，油脂透明無雜質，提油率達到90%以上。酶解條件溫和，蛋白質不變性，水解更加徹底，水解蛋白為小分子的蛋白質、多肽和氨基酸的混合物質，更易被吸收。將活性物質分成油脂和蛋白兩部分，其產品更具針對性和競爭力。使用乙醇作為油脂提取溶劑，避免了毒性溶劑殘留的風險。