一種金花菌固態發酵青刺尖茶的制備及其降血脂的產品的制作方法

本發明屬于一種“金花菌”固態發酵青刺尖茶的制備及其降血脂的產品。

背景技術：

高血脂癥是因體內血脂代謝異常而引發的一種慢性疾病，高血脂是引起人類脂肪肝、動脈粥樣硬化性疾病的最主要危險因素之一。臨床治療高血脂癥的西藥長期服用對人體有一定程度的毒副作用。

青刺尖茶是薔薇科扁核木屬植物青刺尖Prinsepia utilis Royle的嫩莖葉按照綠茶工藝制作的代用茶，青刺尖始載于《滇南本草》。我們的研究發現青刺尖茶提取物具有抑菌作用，也具有降低血脂，青刺尖種籽油有抗缺氧活性。金花菌(冠突散囊菌，Eurotium cristatum)是茯磚茶上的優勢菌種，其與茯磚茶的降血脂功效有緊密的聯系，有研究表明：“金花菌”能產生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等酶，同時具有調節脂質代謝、維持血脂水平的生物活性物。但關于“金花菌”發酵青刺尖茶后，提取物的降血脂功效得到加強，該研究尚未見文獻報道。

因此，將“金花菌”發酵青刺尖茶的提取物作為功能保健食品或藥品的物料，不僅符合綠色健康的理念，也可滿足當今社會人們對功能食品或藥品多元化的要求，本實驗研究將為青刺尖植物的開發利用提供新的依據。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種青刺尖發酵茶及其制備方法。

一種青刺尖發酵茶的制備方法，它包括如下步驟：

(1)取青刺尖茶，加25％—34％重量的水，滅菌，然后冷卻到室溫；

(2)按照5/300～10/300(v/w)的比例，在青刺尖茶中加入冠突散囊菌孢子混懸液；

(3)25℃-30℃條件下培養5d-12d，干燥，即可。

步驟(1)中，所述青刺尖茶是以青刺尖莖葉為原料，按照綠茶工藝制備而成。

所述青刺尖茶按照如下方法制備：

(1)取青刺尖新鮮嫩莖葉，攤晾4小時-12小時；

(2)100℃熱蒸汽殺青20-30秒，風冷卻10分鐘；

(3)在通入80-95℃熱風的條件下，粗揉10-30分鐘；攤涼5-10分鐘，再揉捻10-20分鐘；

(4)60-80℃烘到含水量達5-7％；攤涼冷卻，得青刺尖茶；

或者按照如下方法制備：

a、取青刺尖新鮮嫩莖葉，攤晾4小時-12小時；

b、200-300℃殺青5-8分鐘；

c、投入殺青葉6kg-8kg，揉捻15-30分鐘；

d、100℃-140℃炒干25分鐘-30分鐘，攤晾15-30分鐘，得青刺尖茶。

步驟(1)中，所述滅菌是在121℃下滅菌20min。

步驟(2)中，所述冠突散囊菌孢子混懸液的濃度為1×10⁶～10⁷個/mL。

本發明還提供了前述方法制備得到的青刺尖發酵茶。

本發明還提供了種青刺尖發酵茶的提取物，其特征在于：它是由前述青刺尖發酵茶經乙醇提取得到。

其中，提取的方法為：取青刺尖發酵茶，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，過濾，濃縮，即可。

本發明還提供了前述提取物的方法其特征在于：步驟如下：取青刺尖發酵茶，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，過濾，濃縮，即可。

本發明還提供了前述青刺尖發酵茶、前述提取物在制備降血脂的功能性食品或藥物中的用途。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施實例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1青刺尖茶的制備工藝。

圖2各試驗組小鼠肝臟組織的病理顯微結構(HE染色，x200)。

具體實施方式

下面以實施實例作進一步說明，但本發明不局限于這些實施實例。

本發明所用的實驗材料與儀器如下：

冠突散囊菌(E.cristatum)，即“金花菌”：購自北納創聯生物技術研究院，BNCC146559，即中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號為CGMCC3.448的冠突散囊菌菌種；

6cr-25型茶葉揉捻機，四川省井研縣飛亞機械制造有限公司；35型揉捻機，四川省井研縣飛亞機械制造有限公司；α-ASTREE電子舌，法國Alpha MOS公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；S-433D氨基酸分析儀，德國Sykam公司；WSL-2比較測色儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司；Sartorius BP211D型電子天平，北京塞多利斯儀器系統有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

實施例1本發明青刺尖茶的制備

一、制備未發酵的青刺尖茶

按綠茶的炒青或蒸青工藝，制備成青刺尖茶，具體按照如下方法(流程圖如圖1所示)如下：

(1)取青刺尖新鮮嫩莖葉，攤晾4小時-12小時；

(2)100℃熱蒸汽殺青20-30秒，風冷卻10分鐘；

(3)在通入80-95℃熱風的條件下，粗揉10-30分鐘；攤涼5-10分鐘，再揉捻10-20分鐘；

(4)60-80℃烘到含水量達5-7％；攤涼冷卻；

(5)得青刺尖蒸青茶。

二、冠突散囊菌種子液的制備

取4℃保存的冠突散囊菌菌種，接種于沙氏液體培養基上，28℃、150r/min搖床培養24h，挑取適量菌絲接種于沙氏斜面培養基中，培養7d后，向斜面試管中加入適量無菌水，反復吹洗斜面，制成孢子懸浮液并轉移至100mL無菌三角瓶中，以血球計數板法調節其孢子濃度為10⁶～10⁷個/mL，即得種子液。

三、固態發酵法制備發酵青刺尖茶

青刺尖茶300克放入2500mL三角瓶，加蒸餾水75mL(按25％含水量計算)，在121℃下滅菌20min，然后冷卻到室溫；

取濃度1.0×10⁶個/mL的冠突散囊菌孢子混懸液10mL，接入上述三角瓶；

放入25℃恒溫培養箱中，培養12d，將樣品烘干，即可。

實施例2本發明青刺尖茶的制備

一、制備未發酵的青刺尖茶

按綠茶的炒青或蒸青工藝，制備成青刺尖茶，具體按照如下方法(流程圖如圖1所示)如下：

(1)取青刺尖新鮮嫩莖葉，攤晾4小時-12小時；

(2)滾筒式連續殺青機升溫200-300℃，投葉殺青5-8分鐘；

(3)投入殺青葉6kg-8kg，揉捻15-30分鐘；

(4)滾筒炒干機100℃-140℃，投15kg-20kg揉捻葉，25分鐘-30分鐘，攤晾15-30分鐘；

(5)得青刺尖炒青茶。

二、冠突散囊菌種子液的制備

取4℃保存的冠突散囊菌菌種，接種于沙氏液體培養基上，28℃、150r/min搖床培養24h，挑取適量菌絲接種于沙氏斜面培養基中，培養7d后，向斜面試管中加入適量無菌水，反復吹洗斜面，制成孢子懸浮液并轉移至100mL無菌三角瓶中，以血球計數板法調節其孢子濃度為10⁶～10⁷個/mL，即得種子液。

三、固態發酵法制備發酵青刺尖茶

青刺尖茶300克放入2500mL三角瓶，加蒸餾水約100mL(按34％含水量計算)，在121℃下滅菌20min，然后冷卻到室溫；

取濃度1.0×10⁷個/mL的冠突散囊菌孢子混懸液5mL，接入上述三角瓶；

放入30℃恒溫培養箱中，培養5d，將樣品烘干，即可。

以下用試驗例的方式，說明本發明的有益效果：

實驗例1本發明青刺尖發酵茶的制備及其功能\功效

1實驗材料

1.1實驗動物

雄性昆明小鼠105只，體重18～22g，合格證號：SCXK(川)2013-24，成都達碩實驗動物公司提供。

1.2動物飼料

普通飼料(成都達碩實驗動物公司)、高脂飼料(配方：基礎飼料75％、蛋黃粉15％、豬油10％)。

1.3儀器與設備

TC6010L全自動生化分析儀、TGL-20M臺式高速冷凍離心機、Multlskan Mk3型酶標儀、轉輪式切片機(徠卡-2016)、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀、數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital)、圖像分析軟件Motic Images Advanced等。

1.4實驗材料和主要試劑

青刺尖茶(產地四川鹽源縣左所鄉，采摘的青刺尖莖葉按照綠茶工藝制作)、茯磚茶(中茶湖南安化茶廠有限公司)、血脂康粉(北京北大維信生物科技有限公司)、Mouse Apo-A1ELISA kit(貨號：Rm1760XL)、Mouse Apo-B ELISA kit(貨號：Rm0743XL)、Mouse LP-a ELISA kit(貨號：Rm0742XL，規格：96孔/盒，Abcam公司生產，北京永輝生物科技有限公司進口分裝)。

2實驗方法

2.1“金花菌”固態發酵青刺尖茶及其提取物的制備方法

“金花菌”固態發酵青刺尖茶：按照實施例1的方法制備的青刺尖發酵茶。

“金花菌”固態發酵青刺尖茶的提取物：稱取青刺尖發酵茶300g，以料液比1:20加入45％-65％(v/v)的乙醇6000mL，80℃--90℃回流提取25min--45min，過濾，濾液減壓濃縮并定容至500mL，得濃度為60g/mL(以生藥計)的提取物，按照灌胃劑量0.3mL/20g制備9.0、6.0、2.0g/kg·bw高、中、低劑量的青刺尖發酵茶提取物混懸液。

青刺尖茶(青刺尖非發酵茶)提取物：用上述提取方法，稱取青刺尖茶，按照灌胃劑量0.3mL/20g制備出9.0g/kg·bw的青刺尖茶(青刺尖非發酵茶)的提取物懸液。

2.2小鼠高脂血癥模型的建立

小鼠適應性喂養3天，105只小鼠稱重后隨機分成基礎飼料組和高脂飼料組，兩組小鼠間體重的差異沒有顯著性。高脂飼料組90只小鼠飼喂高脂飼料(配方：基礎飼料75％、蛋黃粉15％、豬油10％)，其余15只小鼠飼喂普通飼料。28天后，禁食不禁水12h，斷尾取血，37℃恒溫水浴1h，3000r/min離心15min，分離血清，再測定血清中的膽固醇TC、TG、HDL-C、LDL-C。

2.3實驗設計

確定造模成功后，將患高脂血癥小鼠隨機分成5組：青刺尖“金花菌”發酵茶的提取物高劑量組(9.0g/kg·bw)、中劑量組(6.0g/kg·bw)、低劑量組(2.0g/kg·bw)、青刺尖茶非發酵提取物組(茶青刺尖組，9.0g/kg·bw)、血脂康組(0.3g/kg·bw)與模型組。處理組連續給藥28天，空白組和模型組給予等量的蒸餾水，每3天給小鼠稱一次體重，調整劑量。末次給藥后禁食不禁水12h，先稱重，再用戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，分離血清方法同2.2。

用SPSS20.0進行數據處理，組間比較用t檢驗，多重比較采用LSD法。

2.4測定方法

利用全自動生化分析儀測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；通過試劑盒測定載脂蛋白-AI(Apo-AI)，載脂蛋白-B(Apo-B)，脂蛋白A(LP-a)的水平。取血后，剝離小鼠的肝臟后，用生理鹽水洗去污血，再用濾紙吸干、稱重(計算肝臟指數，肝臟指數＝臟器質量/小鼠質量(g/g))后，按病理檢驗的SOP程序進行脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等，最后鏡檢。

3結果與分析

3.1高血脂模型小鼠的建立

小鼠經過3天適應性飼養，再用不同飼料處理28天，普通飼料、高脂飼料對小鼠的影響，結果見表1。

表1高脂飼料對小鼠血脂水平、體重增長的影響

注：與普通飼料組比較，#p＜0.05差異顯著；##p＜0.01；差異極顯著。

從表1可看出：不同飼料處理28天后，與普通飼料組比較，高脂飼料組小鼠的體重增長差異性顯著(p<0.05)，而且，TC、TG、HDL-C、LDL-C指標均極顯著性升高(p<0.01)，表明小鼠高血脂癥模型建立成功。

3.2青刺尖發酵茶提取物對高血脂小鼠血脂的影響

灌胃期間各組小鼠取食正常，毛潔白而具光澤，無排稀便現象。灌胃28天后，青刺尖發酵茶提取物對高血脂癥小鼠血脂水平的影響，結果見表2。

表2青刺尖發酵茶提取物對高血脂癥小鼠血脂水平的影響

注：與空白組比較，#p＜0.05，差異顯著；##p＜0.01，差異極顯著。

與模型組比較，*p＜0.05，差異顯著；**p＜0.01，差異極顯著。

與陽性組比較，△p＜0.05，差異顯著；△△p＜0.01，差異極顯著。

與青刺尖茶組比較，■p＜0.05，差異顯著；■■p＜0.01，差異極顯著。表3，表4同。

從表2可看出：與模型組(高血脂小鼠組)比較，青刺尖“金花菌”發酵茶提取物的低、中和高3個劑量組小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量均降低，其中，低劑量組的TC、TG含量均有顯著的差異(p<0.05)，中劑量組的TC、TG含量有極顯著的差異(p<0.01)；低、中和高劑量組的HDL-C含量均具有極顯著差異(p<0.01)；低劑量組的LDL-C含量有顯著的差異(p<0.05)，而中劑量組的LDL-C含量有極顯著的差異(p<0.01)。現代醫學認為：血清LDL-C含量的升高容易導致冠心病、動脈粥樣硬化等的發生，而血清HDL-C含量的升高有助于降低TG，防止冠心病、動脈粥樣硬化等的發生。

與青刺尖茶組比較，青刺尖發酵茶提取物的低、中和高劑量組小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量均有降低，其中，高劑量組的TC、TG達到顯著差異(p＜0.05)，青刺尖發酵茶提取物的中、高劑量組小鼠血清中HDL-C的含量均比青刺尖茶組高。與陽性組比較，青刺尖發酵茶提取物的低、中和高3個劑量組小鼠的血清指標差異性都不顯著。

上述試驗結果說明：青刺尖發酵茶的提取物具有降低高血脂小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的功能，其與血脂康相當，而高劑量組降低TC、TG的功能比青刺尖茶的強，且有顯著差異(p＜0.05)，說明本發明發酵工藝可以顯著提高青刺尖茶的降脂功效。

3.3青刺尖發酵茶提取物對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響

青刺尖茶經過“金花菌”的發酵，其提取物對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響，結果見表3。

表3青刺尖發酵茶提取物對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B及LP-a的影響

由表3可知：與模型組比較，青刺尖發酵茶提取物的低、中和高劑量組的血清Apo-AI濃度均高于模型組，中劑量組達極顯著(p<0.01)，高劑量組顯著(p<0.05)；青刺尖發酵茶提取物的低、中和高劑量組的Apo-B濃度均低于模型組，中劑量組達極顯著(p<0.01)，低、高劑量組的差異顯著(p<0.05)；各劑量組Apo-B/Apo-AI的值均低于模型組，中劑量組的差異顯著(p<0.05)；各劑量組LP-a濃度均低于模型組。

與青刺尖茶組比較，青刺尖發酵茶提取物的中、高劑量組小鼠血清中的Apo-AI濃度均高，其中，中劑量組達到顯著(p<0.05)；青刺尖發酵茶提取物的中等劑量組Apo-B濃度顯著(p<0.05)低于青刺尖茶提取物組；青刺尖發酵茶提取物低、中和高劑量組的Apo-B/Apo-AI值均低于青刺尖茶提取物組；青刺尖發酵茶提取物中、高劑量組的LP-a均低于青刺尖茶提取物組。

與陽性組比較，青刺尖發酵茶提取物各劑量組的血清Apo-AI、Apo-B和LP-a濃度差異均不顯著。

現代醫學研究認為：血清Apo-AI與HDL-C呈明顯正相關，可代表HDL-C水平，而血清HDL-C含量的升高有助于降低TG，防止冠心病、動脈粥樣硬化等的發生；血清Apo-B與血清LDL-C水平呈明顯正相關，主要代表LDL-C的水平，血清LDL-C含量的升高容易導致冠心病、動脈粥樣硬化等的發病；高Lp-a是冠心病的危險因素之一。

上述試驗結果說明：青刺尖發酵茶的提取物降低高血脂小鼠血脂的功能，可能是通過升高血清Apo-AI(載脂蛋白AI)的濃度，從而增加了血清的HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)的含量，同時，也降低血清Apo-B(載脂蛋白B)的濃度，而降低了血清的LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)的含量，而且LP-a的濃度也降低。與青刺尖茶比較，青刺尖發酵后的提取物升高Apo-AI和降低Apo-B的能力都明顯增強，還可能具有降低血清LP-a的能力，且有顯著差異(p＜0.05)，說明本發明發酵工藝可以顯著提高青刺尖茶的降脂功效。

3.4青刺尖發酵茶對小鼠體重及肝臟指數的影響

連續灌胃28天后，青刺尖發酵茶提取物對小鼠體重及肝臟指數的影響，結果見表4。

表4青刺尖發酵茶提取物對小鼠體重及肝臟指數的影響

由表4可知：與空白組比較，模型組體重有一定的增長，但差異不顯著，模型組的肝臟指數的升高差異極顯著(p<0.01)；青刺尖發酵茶提取物的低、中和高劑量組體重增長量均極顯著(p<0.01)降低；青刺尖發酵茶低、中和高劑量組、青刺尖茶組和陽性組的肝臟指數，與空白組比較差異均不顯著。

與模型組比較，青刺尖發酵茶提取物組的體重增長量、肝臟指數兩項指標均降低，體重增長量降低的差異性達極顯著(p<0.01)，低、中劑量組肝臟指數的差異性達極顯著(p<0.01)，高劑量組的差異性顯著(p<0.05)。

與青刺尖茶組比較，青刺尖發酵茶提取物低、中和高劑量組的肝臟指數差異均不顯著，但是，低劑量組的體重增長量顯著(p<0.05)的低于青刺尖茶組。

3.5青刺尖發酵茶對小鼠肝臟組織的影響

青刺尖發酵茶對小鼠肝臟組織的影響，肝臟組織病理顯微結構，見圖2。

由圖2可知，空白組小鼠肝小葉結構完整，未見增生及假小葉形成，小葉中央靜脈未見淤血，肝細胞未見變性及壞死，也未見肝細胞增生、纖維化，肝細胞內及細小膽管內無膽汁淤積；模型組小鼠肝小葉結構欠清，肝細胞可見中度彌漫性水腫變性，可見脂肪變性；青刺尖發酵茶提取物低、中劑量組小鼠肝小葉結構清晰，肝索呈放射狀排列，可見散在脂肪小滴肝細胞及輕度水腫變性；青刺尖發酵茶提取物高劑量組、青刺尖茶組及陽性組的水腫程度都較低、中劑量組輕，可見極少散在脂肪小滴肝細胞。

從小鼠肝臟的病理切片可知：青刺尖茶經“金花菌”發酵后，其高劑量組的肝臟組織只有極少、散在的脂肪小滴，肝細胞病變程度較低，說明青刺尖發酵茶具有控制高血脂小鼠肝臟發生脂肪積累的功效。

4結論

實驗研究結果表明，經過“金花菌”發酵的青刺尖茶提取物，處理高血脂小鼠28天后，其體重增長量明顯低于空白組和模型組，呈一定的劑量效應。與高脂模型組比較，青刺尖發酵茶提取物組的體重增長量、肝臟指數兩項指標均降低，體重增長量降低極顯著，低、中劑量組肝臟指數的降低極顯著，高劑量組的降低顯著。與青刺尖茶組比較，青刺尖發酵茶提取物低劑量組的體重增長量降低顯著；但是，低、中和高劑量組肝臟指數的差異均不顯著。

青刺尖發酵茶的提取物具有降低高血脂小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的功能，其與血脂康相當，而高劑量組降低TC、TG的功能比青刺尖茶的強。

青刺尖發酵茶的提取物降低高血脂小鼠血脂的功能，可能是通過升高血清Apo-AI(載脂蛋白AI)的濃度，從而增加了血清的HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)的含量，同時，也降低血清Apo-B(載脂蛋白B)的濃度，而降低了血清的LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)的含量，而且LP-a的濃度也降低。與青刺尖茶比較，青刺尖發酵后的提取物升高Apo-AI和降低Apo-B的能力都明顯增強，還可能具有降低血清LP-a的能力。與青刺尖茶相比，青刺尖發酵茶可有效降低TC、TG和LDL-C水平，同時控制HDL-C的過度增高。

從小鼠的肝臟病理切片看，青刺尖茶經“金花菌”發酵后，其高劑量組小鼠的肝臟組織只有極少、散在的脂肪小滴，肝細胞病變程度較低，且與陽性組無顯著差異，說明青刺尖發酵茶具有控制高血脂小鼠肝臟發生脂肪積累性肝病變的功效。

綜上所述，經過“金花菌”的發酵后，青刺尖發酵茶的提取物具有良好控制高血脂小鼠體重增長、降低血脂各項指標、控制肝臟脂肪積聚的功效，且效果顯著優于未經發酵的青刺尖茶，說明本發明發酵工藝可以顯著提高青刺尖茶的降脂功效。

本發明的青刺尖發酵茶，有效成分含量高，可以有效控制高血脂，青刺尖茶發酵后比不發酵的青刺尖茶有更好的效果，因此，青刺尖發酵茶具有更好的應用前景。