一種冠突散囊菌的分生孢子的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種冠突散囊菌的分生孢子的制備方法。
【背景技術】
[0002]“金花菌”，即冠突散囊菌，是茯磚茶生產的優勢菌，在茯磚茶上長有大量金黃色顆粒，俗稱“金花”。“金花”是茯磚茶獨特風味的主要影響因素，長年飲用茯磚茶有調理腸胃、促進消化、降血糖、降血脂、增強人體體質及延緩衰老等功效，而這些功效與“金花菌”的作用是密不可分的。人們通常根據“金花菌”的質量和數量來判斷茯磚茶品質的好壞。齊祖同、溫瓊英等對茯磚茶優勢菌進行了培養鑒定，發現該優勢菌最主要的特征是具冠狀突起及表面明顯粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子，是產生有性型(子囊孢子階段)和無性型(分生孢子階段)孢子的全型真菌，并以子囊孢子和分生孢子為主要依據正式將該菌有性型鑒定為冠突散囊菌。
[0003]茯磚茶加工中的“發花”過程是形成茯磚茶獨特品質的關鍵工藝，“發花”的實質是通過控制一定的外界條件，促使微生物優勢菌-冠突散囊菌(Eurotium cristatum)的生長繁殖，產生金黃色的閉囊殼。由于冠突散囊菌等微生物的大量參與，形成了特有的菌花香，并由于這些微生物的作用以及在加工過程中的高溫高濕作用下，茶多酚的氧化、縮合，蛋白質和纖維素等大分子的分解，氨基酸、糖類和咖啡堿等各成分之間的聚合、縮合等一系列的復雜反應，形成了茯磚茶獨特的品質特征。
[0004]目前，我國茯磚茶的生產幾乎都是靠自然接種發酵，行業內對冠突散囊菌的生物學特性研究并不深入，對此菌的生長發育特性了解不夠，發花條件掌握不好，冠突散囊菌無法在培養前期形成優勢菌，會造成其他雜菌污染嚴重(比如黑曲霉、酵母和青霉菌等)，最終產品不能形成大量“金花”，造成產品質量低劣，質量不穩定，不易銷售，甚至原料的極大浪費，產量低，周期長等不良現象，為此有必要進行人工接種生產。
[0005]人工接種可避免雜菌污染，但需大量接種物(孢子)。劉作易等(1991年，茯磚茶金花菌生長條件研究)研究結果表明，冠突散囊菌的子囊孢子和分生孢子的單孢子均能形成相似菌落，均能產生分生孢子和子囊孢子，孢子的有性型和無性型在特定條件下可以相互轉化，證明了該菌為同宗配合菌。當分生孢子作為接種物時，其能夠大量快速積累且孢子質量穩定性也較好，所以選擇分生孢子作為接種物更加適合。
[0006]中國專利申請CN102120964A “冠突散囊菌孢子懸浮液制備方法”中公開了一種冠突散囊菌孢子懸浮液的制備方法，金花孢子顆粒均勻，短期內能制備大量孢子懸浮液，用于茯磚茶的工業化生產。中國專利申請CN102965328A公開了一種金花菌孢子粉的制備方法，獲得的金花孢子粉既可以用于茯磚茶的工業化生產，也可以用于金花菌功能性成分的提取，縮短了茯磚茶生產周期，降低了發花失敗的風險。以上兩篇公開專利均是研究“金花”孢子，實質上是冠突散囊菌的分生孢子和子囊孢子的混合物。
[0007]因此，亟待建立一種快速、大量積累純種分生孢子的培養方法，將其作為人工接種物應用于茯磚茶的工業化生產。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種快速、大量積累純種分生孢子的方法，以用分生孢子作為接種物，克服現有技術中冠突散囊菌的有性孢子遺傳不穩定，進而造成茯磚茶產品質量不穩定的缺陷。
[0009]本發明的發明人在研究中發現，將冠突散囊菌株培養至產生菌絲但不產生孢子，然后在高滲、高溫和高濕中至少一種條件下繼續進行培養，即可實現快速、大量積累純種分生孢子的發明目的。
[0010]因此，為了實現上述目的，本發明提供了一種冠突散囊菌的分生孢子的制備方法，該方法包括:
[0011](1)將冠突散囊菌株培養至產生菌絲但不產生孢子；
[0012](2)在高滲、高溫和高濕中至少一種條件下繼續進行培養。
[0013]優選地，在高滲、高溫和高濕中的至少兩種條件下繼續進行培養。
[0014]優選地，步驟(2)中，所述高溫的條件為30_37°C。
[0015]優選地，步驟(2)中，所述高濕的條件為培養的空氣濕度為70-95%。
[0016]優選地，步驟(2)中，所述高滲的條件包括:當固體培養時,相對于直徑為100mm的圓形培養基，通過噴灑10-30mL的NaCl飽和溶液來提供；當液體培養時，通過向液體培養液中添加NaCl飽和溶液來提供，并使得以液體培養液的總重量為基準，NaCl的含量為1_6重量％。
[0017]采用本發明的方法能夠快速地制備純的冠突散囊菌的分生孢子，將其作為人工接種物應用于茯磚茶的工業化生產，能夠提高茯磚茶產品質量的穩定性。
[0018]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【具體實施方式】
[0019]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0020]本發明提供了一種冠突散囊菌的分生孢子的制備方法，該方法包括:
[0021](1)將冠突散囊菌株培養至產生菌絲但不產生孢子；
[0022](2)在高滲、高溫和高濕中至少一種條件下繼續進行培養。
[0023]在本發明中，步驟(1)和步驟(2)中的培養可以為固體培養或液體培養，本領域的技術人員應該理解的是，當培養為液體培養時，液體本身就提供了高濕的條件，因此，當培養為液體培養時，步驟(2)中，在高滲、高溫和高濕條件中至少一種條件下繼續進行培養是指在高滲和/或高溫條件下繼續進行培養。
[0024]在本發明中，步驟(2)中的繼續進行培養是指在原來的固體培養基上或液體培養液中繼續進行培養，即從步驟(1)的培養到步驟(2)的繼續進行培養的過程中，一直不更換培養基。
[0025]根據本發明所述的方法，其中，步驟(2)中，只要在高滲、高溫和高濕中至少一種條件下繼續進行培養即可，但是，為了進一步提高分生孢子的純度，優選地，在高滲、高溫和高濕中的至少兩種條件下繼續進行培養。
[0026]根據本發明所述的方法，其中，步驟(2)中，高溫的條件優選為30_37°C，在該高溫條件下繼續進行培養，能夠進一步提高分生孢子的純度。
[0027]根據本發明所述的方法，其中，步驟(2)中，高濕的條件可以為本領域常規的高濕條件，優選地，所述高濕的條件為培養的空氣濕度為70-95 %，在該濕度條件下繼續進行培養，能夠進一步提高分生孢子的純度。
[0028]根據本發明所述的方法，其中，步驟(2)中，高滲的條件可以為本領域常規的高滲條件，優選地，所述高滲的條件包括:當固體培養時，直徑為100mm的圓形培養基，通過噴灑10-30mL的NaCl飽和溶液來提供；當液體培養時，通過向液體培養液中添加NaCl飽和溶液來提供，并使得以液體培養液的總重量為基準，NaCl的含量為1-6重量％，在上述高滲條件下繼續進行固體培養或液體培養，能夠進一步提高分生孢子的純度。
[0029]優選地，步驟(2)中，當固體培養時，所述培養的時間為5-8天；當液體培養時，所述培養的條件包括:時間為24-72小時，通氣量為0-0.lvvm，攪拌速度為100_200rpm。
[0030]根據本發明所述的方法，其中，步驟(1)中，培養的條件可以為本領域常規的用于培養冠突散囊菌的條件，優選地，當固體培養時，培養的條件包括:溫度為28-29°C，空氣濕度為50-70%，時間為12-72小時；當液體培養時，培養的條件包括:溫度為28-29°C，通氣量為0.5-lvvm，攪拌速度為200-400rpm，培養時間為培養至1L液體培養液中冠突散囊菌的生物量干重為5-20g，從而能夠進一步提高分生孢子的純度。
[0031]根據本發明所述的方法，其中，對冠突散囊菌株的種類沒有特殊的限定，例如冠突散囊菌株可以為冠突散囊菌孢子和/或菌體培養物。在本發明中，菌體培養物指的是菌體孢子以外的菌體存活形式。
[0032]根據本發明所述的方法，其中，固體培養的固體培養基和液體培養的液體培養液可以為冠突散囊菌所需的常規的培養基或培養液，例如，當固體培養時，固體培養基可以包括:相對于1000g的固體培養基，糖類的含量為5-30g，黑茶提取物的含量為5-50g，瓊脂的含量為10-15g，余量為水；當液體培養時，液體培養液可以包括:相對于1000g的液體培養液，糖類的含量為5-30g，黑茶提取物的含量為5-50g，余量為水。
[0033]在本發明中，黑茶提取物可以為本領域常規的用于冠突散囊菌培養所需的黑茶提取物，例如可以采用下述方法制備:茯磚茶和水按照質量比1:20進行混合，并在常壓下煮沸30分鐘，然后過濾取濾液即得，其中，該茯磚茶可以為商購。
[0034]本領域的技術人員應該理解的是，在將冠突散囊菌接種于固體培養基上或者液體培養液中前，要對固體培養基和液體培養液進行滅菌，滅菌的條件可以為:溫度為115-121°C，時間為 10-30min。
[0035]在本發明中，可以通過在冠突散囊菌培養過程中是否產生了子囊果來確定最終制得的孢子是否為分生孢子，如果