本發明涉及生物保鮮技術領域，尤其是涉及一種利用魷魚加工廢棄物制備生物保鮮劑的方法。
背景技術：
水產品如魚、蝦、蟹等含有豐富的蛋白質和不飽和脂肪酸，水分含量高，在保藏的過程中易發生脂肪氧化和細菌繁殖，從而導致水產品腐敗變質，例如將新鮮大菱鲆魚低溫冷藏后，第10-13天時其揮發性鹽基氮大于30mg/100g。水產品保鮮歷來是制約水產行業發展的主要因素之一，目前國內外常用的水產品保鮮技術主要有低溫保鮮、化學保鮮、氣調保鮮盒輻照保鮮等。物理保鮮方法成本昂貴、局限性大；隨著人們環保意識的提高與保鮮技術的發展，化學保鮮的安全性也逐漸引起人們的擔憂；一些以天然無毒的生物原料制備的生物保鮮技術逐漸引起人們的關注，并開始應用于水產品的加工、貯藏、運輸與消費等過程中。將天然的生物保鮮劑應用于水產品的保鮮，不僅可以減少化學合成殺菌劑對人類健康的不良影響，并且可以有效的防止病原菌的抗藥性。生物保鮮劑被認為是食品添加劑研究領域最有前景的發展方向之一，是開發新型高效水產品保鮮劑的重要途徑。隨著水產行業的發展，水產品的保鮮在整個水產品加工、運輸、貯藏和消費等環節越來越重要，尤其是隨著水產品的國際化流通和人們對水產品來源的安全性和新鮮程度的越來越高的要求，生物保鮮劑成為水產品保鮮方面的研究熱點。
近年來，對水產品加工下腳料綜合利用的研究漸成熱點，主要是利用蛋白酶來提取蛋白水解物，用于調味料或食品添加劑的開發。魷魚加工下腳料中富含豐富的蛋白質，以及眾多對人體有益的營養素及鐵、鋅、銅等微量元素，利用生物酶解技術，將魷魚加工下腳料有效的加以開發利用，制備成為具有抗菌/抗氧化活性的雙功能生物保鮮劑，將大大提高其應用價值，有效增加了魷魚的經濟價值。
技術實現要素：
本發明是的提供了一種工藝步驟簡單，可操作性強，節能、高效、綠色環保的利用魷魚加工廢棄物制備生物保鮮劑的方法，實現了魷魚加工廢棄物資源的綜合利用，提高了其應用價值，有效增加了魷魚的經濟價值。
為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
一種利用魷魚加工廢棄物制備生物保鮮劑的方法，包括以下步驟：
（1）將魷魚加工廢棄物洗凈后勻漿，將勻漿液置于烘箱中于70~90℃下干燥10~14h，得勻漿料。勻漿后干燥進行控水以去除部分水分。魷魚加工廢棄物指魷魚皮、內臟、頭等。
（2）將勻漿料與水混合后，調節ph為2.5~3.0，在30~40℃水浴鍋中保溫10~20min，加入為勻漿料質量0.1~0.3%的胃蛋白酶，恒溫酶解1~2h后滅酶，得酶解液。采用為胃蛋白酶進行酶解，效果好，且便于操作，工藝穩定，節能、高效、綠色環保。
（3）待酶解液冷卻至室溫后，離心取上清液，并在上清液中加入等體積的質量含量為15%的三氯乙酸溶液，混勻后于室溫下靜置30~60min，離心取上清液，將上清液真空冷凍ing干燥，得固體魷魚活性肽。通過低溫離心和三氯乙酸處理方法，去除無活性及活性低的成分，提高魷魚活性肽的純度。
（4）將得到的固體魷魚活性肽配制成固形物濃度為1g/l的多肽溶液，加入d-阿拉伯糖至其固形物濃度為30g/l，調節ph至13~14，于100℃條件下反應20~30min，反應結束后冷卻至室溫，得美拉德肽溶液。通過美拉德反應，不僅提高了產物的抗菌/抗氧化活性，且有效的消除了魷魚加工廢棄物自身所帶有的腥味，使產物具有良好的風味特征，本發明中的還原多糖種類是關鍵，發明人發現只有加入d-阿拉伯糖，最終獲得的生物保鮮劑才具有較佳的保鮮效果。
（5）將食品級殼聚糖用食品級乙酸溶液溶解，制得濃度為質量濃度為1%的殼聚糖溶液。
（6）將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液混合，即得生物保鮮劑。
作為優選，步驟（2）中，勻漿料與水按質量比1：（1~2）混合。
作為優選，步驟（2）中，所述胃蛋白酶的酶活力為10000~15000u/g。
作為優選，步驟（3）中恒溫酶解時不斷攪拌。攪拌以使物料混合均勻，可采用磁力攪拌器或手動搖晃，采用間接攪拌也可行。
作為優選，步驟（3）中離心的工藝參數為：6000~10000rpm/min條件下離心10~15min。
作為優選，步驟（6）中，美拉德肽溶液與殼聚糖溶液按照體積比（3~7）：（93~97）混合。
因此，本發明具有如下有益效果：以魷魚加工廢棄物為原料，經酶解、低溫離心、三氯乙酸處理、真空冷凍干燥、美拉德反應得到美拉德肽溶液，再將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液復配得到生物保鮮劑，工藝合理，操作簡單可行，節能、高效、綠色環保，實現了魷魚加工廢棄物資源的綜合利用，減少了環境污染，提高了其應用價值，有效增加了魷魚的經濟價值。
具體實施方式
下面通過具體實施方式對本發明做進一步的描述。
以下實施例中所用的dpph清除率測定方法具體步驟為：
取1.5ml適當稀釋的雙功能生物保鮮劑溶液，加入3.0ml0.09mg/mldpph（95%乙醇溶液），混合均勻室溫避光放置5min，以95%乙醇為調零管，測定樣品在517nm處吸光值。其中空白對照用95%乙醇溶液替代樣品，標準品為抗壞血酸（aae）溶液，濃度為0.01、0.02、0.03、0.04mg/ml。結果以每g保鮮劑相當于抗壞血酸的mg數表示，即mgaae/g樣品。
以下實施例中所用瓊脂擴散法測定保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效力，具體步驟為：
培養皿中加入15ml營養瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，加入100μl活化好的大腸桿菌菌懸液（菌齡為18-24h，106-107cfu/ml）均勻涂布，將含有保鮮劑（過濾除菌）的6mm滅菌濾紙片輕放在平板表面，37℃培養24h，測定抑菌圈直徑。以氨芐青霉素作為保鮮劑抗菌效果的對照藥物，首先配制氨芐青霉素濃度為20μg/ml，然后采用2倍稀釋法將氨芐青霉素溶液用滅菌去離子水稀釋，根據上述實驗方法測定不同濃度氨芐青霉素對大腸桿菌的抑菌圈直徑，將保鮮劑的抑菌圈直徑與不同濃度氨芐青霉素形成的抑菌圈直徑進行比較，確定保鮮劑的抗菌效力。結果以每mg保鮮劑相當于氨芐青霉素的mg數表示，即mgamp/mg樣品。
實施例1
（1）將魷魚加工廢棄物洗凈后勻漿，將勻漿液置于烘箱中于70℃下干燥14h，得勻漿料；
（2）將勻漿料與水按質量比1：1混合后，用6m鹽酸調節ph為2.5，在30℃水浴鍋中保溫20min，加入為勻漿料質量0.1%、酶活力為15000u/g的胃蛋白酶，在攪拌狀態下恒溫酶解2h后滅酶，得酶解液；
（3）待酶解液冷卻至室溫后，6000rpm/min條件下離心15min取上清液，并在上清液中加入等體積的質量含量為15%的三氯乙酸溶液，混勻后于室溫下靜置30min，6000rpm/min條件下離心15min取上清液，將上清液真空冷凍干燥，得固體魷魚活性肽；
（4）將得到的固體魷魚活性肽配制成固形物濃度為1g/l的多肽溶液，加入d-阿拉伯糖至其固形物濃度為30g/l，用6m氫氧化鈉調節ph至13，于100℃條件下反應20min，反應結束后冷卻至室溫，得美拉德肽溶液；
（5）將食品級殼聚糖用質量濃度1%的食品級乙酸溶液溶解，制得濃度為質量濃度為1%的殼聚糖溶液；
（6）將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液按照體積比3：97混合，即得生物保鮮劑。
得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為64mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為4.2mgamp/mg樣品。
對比例1
本對比例與實施例1的不同之處在于：步驟（6）中采用葡萄糖，其余完全相同。
最后得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為14mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為1.1mgamp/mg樣品。與實施例1加入d-阿拉伯糖相比，其抗菌和抗氧化活性皆顯著下降。
對比例2
本對比例與實施例1的不同之處在于：步驟（6）中采用果糖，其余完全相同。
最后得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為13mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為0.9mgamp/mg樣品。與實施例1加入d-阿拉伯糖相比，其抗菌和抗氧化活性皆顯著下降。
對比例3
本對比例與實施例1的不同之處在于：步驟（6）中采用木糖，其余完全相同。
最后得到的雙功能生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為18mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為1.5mgamp/mg樣品。與實施例1加入d-阿拉伯糖相比，其抗菌和抗氧化活性皆顯著下降。
對比例4
本對比例與實施例1的不同之處在于：步驟（6）中采用蔗糖，其余完全相同。
最后得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為17mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為1.3mgamp/mg樣品。與實施例1加入d-阿拉伯糖相比，其抗菌和抗氧化活性皆顯著下降。
實施例2
（1）將魷魚加工廢棄物洗凈后勻漿，將勻漿液置于烘箱中于80℃下干燥12h，得勻漿料；
（2）將勻漿料與水按質量比1：1.5混合后，用6m鹽酸調節ph為2.8，在35℃水浴鍋中保溫15min，加入為勻漿料質量0.5%、酶活力為12000u/g的胃蛋白酶，在攪拌狀態下恒溫酶解1.5h后滅酶，得酶解液；
（3）待酶解液冷卻至室溫后，7000rpm/min條件下離心12min取上清液，并在上清液中加入等體積的質量含量為15%的三氯乙酸溶液，混勻后于室溫下靜置40min，7000rpm/min條件下離心12min取上清液，將上清液真空冷凍干燥，得固體魷魚活性肽；
（4）將得到的固體魷魚活性肽配制成固形物濃度為1g/l的多肽溶液，加入d-阿拉伯糖至其固形物濃度為30g/l，用6m氫氧化鈉調節ph至13.5，于100℃條件下反應25min，反應結束后冷卻至室溫，得美拉德肽溶液；
（5）將食品級殼聚糖用質量濃度1%的食品級乙酸溶液溶解，制得濃度為質量濃度為1%的殼聚糖溶液；
（6）將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液按照體積比4：95混合，即得生物保鮮劑。
得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，魷魚保鮮劑對dpph的清除效果為60mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為3.9mgamp/mg樣品。
在其他條件相同的情況下，將本實施例中d-阿拉伯糖用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖代替，得到的抗氧化活性測定結果與抑菌活性測定結果與對比例1~4的結果相近，故不在此贅述。
實施例3
（1）將魷魚加工廢棄物洗凈后勻漿，將勻漿液置于烘箱中于90℃下干燥10h，得勻漿料；
（2）將勻漿料與水按質量比1：2混合后，用6m鹽酸調節ph為3.0，在40℃水浴鍋中保溫10min，加入為勻漿料質量0.3%、酶活力為10000u/g的胃蛋白酶，在攪拌狀態下恒溫酶解1h后滅酶，得酶解液；
（3）待酶解液冷卻至室溫后，10000rpm/min條件下離心10min取上清液，并在上清液中加入等體積的質量含量為15%的三氯乙酸溶液，混勻后于室溫下靜置60min，10000rpm/min條件下離心10min取上清液，將上清液真空冷凍干燥，得固體魷魚活性肽；
（4）將得到的固體魷魚活性肽配制成固形物濃度為1g/l的多肽溶液，加入d-阿拉伯糖至其固形物濃度為30g/l，用6m氫氧化鈉調節ph至14，于100℃條件下反應30min，反應結束后冷卻至室溫，得美拉德肽溶液；
（5）將食品級殼聚糖用質量濃度1%的食品級乙酸溶液溶解，制得濃度為質量濃度為1%的殼聚糖溶液；
（6）將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液按照體積比7：93混合，即得生物保鮮劑。
得到的生物保鮮劑經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，保鮮劑對dpph的清除效果為36mgaae/g樣品；經抑菌活性測定，以氨芐青霉素當量表示，保鮮劑對大腸桿菌的抑菌效果為3.2mgamp/mg樣品。
在其他條件相同的情況下，將本實施例中d-阿拉伯糖用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖代替，得到的抗氧化活性測定結果與抑菌活性測定結果與對比例1~4的結果相近，故不在此贅述。
本發明以魷魚加工廢棄物為原料，經酶解、低溫離心、三氯乙酸處理、真空冷凍干燥、美拉德反應得到美拉德肽溶液，再將美拉德肽溶液與殼聚糖溶液復配得到生物保鮮劑，工藝合理，操作簡單可行，節能、高效、綠色環保，實現了魷魚加工廢棄物資源的綜合利用，減少了環境污染，提高了其應用價值，有效增加了魷魚的經濟價值。
以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。