一種衣藻乙醇提取物及其制備方法與應用與流程

本發明屬于海洋生物技術領域，尤其涉及一種衣藻乙醇提取物及其制備方法與應用。

背景技術：

微藻是一類于海洋、湖泊、河流等水體環境中獨立存在或成鏈狀、團狀存在的單細胞微觀藻類。微藻具有極大的生物多樣性，分布十分廣泛，地球上大約存在200000～800000種不同門類的微藻，其中約35000種已有描述，超過15000種從藻類生物物質中產生的新型化合物已進行化學鑒定。

微藻具有分布廣且不占用耕地、生物量大、光合效率高、環境適應能力強、生長周期短、油脂含量高和環境友好等特點，因此在生物柴油的開發中得到重視，目前大部分微藻的應用和研究都主要集中在高效產油方面。此外，由于微藻營養豐富，富含微量元素和各類生物活性物質，因此，其在醫藥、保健品、化妝品、水產養殖飼料和飼料添加劑等方面也具有廣闊的應用前景。但目前微藻在醫藥、保健品方面的應用研究較少，且這些方面的研究目前主要集中在螺旋藻、小球藻、鹽生杜氏藻和紫球藻等幾種常見的微藻，對于其他微藻則相對報道較少。

衣藻屬綠藻門綠藻綱團藻目衣藻科衣藻屬，藻體為單細胞，球形或卵形，前端有兩條等長的鞭毛，能游動。衣藻素有“綠色酵母”之稱，與酵母有許多共同之處，如生長周期簡單，生長快，世代時間短，可以在平板上形成單克隆，也能進行液體培養，以單倍體與二倍體兩種形式生長，能對其配子的發育過程進行四分子分析。衣藻的獨特之處在于其在光照和黑暗條件下均能生長，且能把外界提供的碳源與光合成的碳物質分開，是目前惟一能特異地對線粒體、葉綠體與核分別建立轉化系統的生物。目前對衣藻的研究主要集中在生物產油和生物制氫方面，對其抗氧化方面的生物活性研究則鮮有報道。因此積極開發具有抗氧化、抗衰老作用的衣藻提取物將對衰老相關疾病的預防和治療有重大意義。

技術實現要素：

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種衣藻乙醇提取物。本發明提供的衣藻乙醇提取物能夠顯著延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活時間和延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，同時，其能促進體內活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內活性氧自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發明的技術方案將通過下面的詳細描述來進一步體現和說明。

一種衣藻乙醇提取物，其制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融3～5次，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分數為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產物用一級水溶解，即得衣藻乙醇提取物。

優選地，步驟s2中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入乙醇進行超聲提取。

優選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優選地，步驟s2中每次超聲提取的時間為10～30min。

本發明所述衣藻(chlamydomonassp.)由中國科學院水生生物研究所提供，其在中國科學院淡水藻種庫中的編號為fachb-889。

本發明人在對微藻進行研究的過程中，進行了大量的試驗，意外發現對反復凍融，離心取上清后剩余的殘渣進行乙醇超聲提取制得到的衣藻乙醇提取物能夠顯著延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活時間和延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，同時，其能促進體內活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內活性氧自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發明衣藻乙醇提取物可單獨或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發明所述的抗氧化、抗衰老作用是指對以病理或生理條件下因發生氧化應激反應所產生的變化為主要特征的衰老及衰老相關疾病的防治作用。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

(1)在整體動物水平上以氧化應激模型及衰老相關模型進行試驗的試驗結果表明，本發明提供的衣藻乙醇提取物可以顯著延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時間，提高其存活率，同時還可以延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，具有顯著的抗衰老和抗氧化作用。

(2)本發明提供的衣藻乙醇提取物能促進體內活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內活性氧自由基(ros)水平，具有顯著的抗氧化作用。

(3)本發明提供的衣藻乙醇提取物的制備方法具有周期短，有機溶劑消耗少，工藝簡單，安全無毒，穩定高效等特點，適合工業化生產。

附圖說明

圖1衣藻乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2衣藻乙醇提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

圖3衣藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內ros水平的影響。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。

本發明實施例中所使用的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業途徑得到的試劑和材料。

本發明實施例中，衣藻由中國科學院水生生物研究所提供，其在中國科學院淡水藻種庫中的編號為fachb-889。

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃備用。

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實施例1衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融4次，在轉速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為80％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為25min，在轉速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產物用一級水溶解，調節其相對于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實施例2衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融5次，在轉速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為70％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為30min，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產物用一級水溶解，調節其相對于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實施例3衣藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的衣藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融4次，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為90％的乙醇超聲提取2次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產物用一級水溶解，調節其相對于衣藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示衣藻濕藻)，即得衣藻乙醇提取物。

實施例4衣藻乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

百草枯，學名甲基紫精，是一種強氧化劑，可誘導體內大量產生活性氧自由基(ros)，使機體處于氧化脅迫環境，進而出現早衰現象。

取實施例1制得的衣藻乙醇提取物，按終濃度100mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國明尼蘇達大學秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進行氧化脅迫造模，然后每隔12h統計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結果用kaplan-meier法進行分析。結果如圖1所示。

圖1結果顯示，衣藻乙醇提取物能夠延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時間，提高其存活率。試驗結果表明本發明提供的衣藻乙醇提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實施例5衣藻乙醇提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實施例1制備的衣藻乙醇提取物，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養，然后每隔1天統計秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結果用kaplan-meier法進行分析。結果如圖2所示。

圖2結果顯示，與對照組相比，衣藻乙醇提取物相能夠延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗結果表明本發明提供的衣藻乙醇提取物具有延緩衰老進程的作用。

實施例6衣藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內ros水平的影響

取24孔培養板，設試驗組和對照組，每組設兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的衣藻乙醇提取物，衣藻乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組衣藻乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續培養48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購于sigma公司，cas號：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標儀在485nm激發波長和538nm發射波長下檢測熒光強度，室溫檢測2h，每10min測一次。結果用f檢驗分析，結果如圖3所示。

圖3結果顯示，與對照組相比，經衣藻乙醇提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內ros水平顯著下降。試驗結果表明本發明提供的衣藻乙醇提取物能夠促進體內ros的清除，顯著降低體內ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。