本發明屬于微生物應用和飼料調制加工領域，具體涉及一株植物乳桿菌及其在制備青貯飼料中的應用。
背景技術：
苜蓿是我國第一大栽培牧草，隨著我國畜牧業的快速發展和農村種植業結構的不斷調整，苜蓿大面積種植及產業化開發正在快速發展。我國苜蓿產業以苜蓿干草為加工基礎，但是雨淋或潮濕易引起生產和貯存過程中營養物質的損失，嚴重限制了苜蓿產業健康發展，因此尋求新的途徑，解決苜蓿加工貯存問題十分必要。青貯是解決上述問題較為理想的措施。青貯是指在密封條件下使青綠飼料發酵以能夠在相當長的時間內保持其質量相對穩定的一種保鮮技術，即微生物利用植物組織中的糖類作為底物，并把它們轉化為有機酸從而實現作物保鮮貯藏的過程。
苜蓿蛋白質含量高、緩沖性高、可溶性碳水化合物含量低，同時苜蓿莖組織中空，有大量空氣存在，使苜蓿青貯難以調制。為保證青貯效果，在苜蓿青貯中常常添加青貯添加劑，傳統青貯添加劑如甲酸、甲醛具有一定的腐蝕性，存在家畜采食安全隱患、添加量較大、成本高和操作不便等缺陷。近年微生物添加劑的研究引起了學術界的廣泛關注。
大量研究表明，青貯能否成功，很大程度上取決于乳酸菌能否迅速而大量地繁殖。乳酸菌是一種兼性厭氧菌，可以加速青貯料發酵，快速產生乳酸，迅速降低ph值，從而抑制腐敗菌活動，減少營養成分損失，使青飼料養分可以較好地保存。添加乳酸菌，一方面可以提高青貯飼料的營養價值和安全性；另一方面，大量的活性乳酸菌隨青貯飼料進入瘤胃，對家畜還有益生作用。青貯飼料調制用的乳酸菌添加劑對發酵品質的改善已經得到廣泛認可，但是市售菌劑在苜蓿青貯過程中產酸少，生長慢，因此，飼料調制加工領域高機能性乳酸菌及動物消化道內具有保健治療效果的益生乳酸菌的探索及應用具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術中青貯飼料制備過程中乳酸菌成長慢、產酸低而導致青貯品質低下的問題，提出一種可以快速降低ph值，加快發酵過程，有效提高苜蓿青貯品質的植物乳桿菌。
為此，本發明的具體技術方案如下：
一種植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214，保藏號為cgmccno.13609。
一種青貯飼料添加劑的活性成分為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214。
所述的青貯飼料添加劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214在mrs培養基上培養，得到青貯飼料添加劑。
所述的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214在青貯飼料制備中的應用。
上述應用中，所述青貯飼料為苜蓿青貯飼料。
一種青貯飼料的制備方法，包括如下步驟：
1)將待發酵飼料切斷，混合均勻；
2)向步驟1)中加入權利要求1所述的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214；
3)將步驟2)中飼料真空密封，貯藏，發酵產物即為青貯飼料。
步驟1)中待發酵飼料為苜蓿。
步驟1)中待發酵飼料切斷長度為1～2cm。
步驟2)中每克待發酵飼料接種5～8logcfu所述的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214。
步驟3)中貯藏條件為：溫度15～45℃，時間30～60d。
本發明的有益效果：
1、本發明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214可用于制備青貯飼料，尤其是制備苜蓿青貯飼料。
2、本發明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214可以快速降低ph值，加速發酵過程，提高青貯速率；可抑制不良微生物的繁殖，提高苜蓿青貯品質，較好的保存苜蓿營養，增加了青貯飼料的體外消化率，克服了苜蓿發酵困難的問題。
3、用本發明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214制備的添加劑青貯效果比現有市售乳酸菌添加劑更佳，且成本低、安全、易于利用。
生物材料保藏證明
分類命名：lactobacillusplantarum；菌株編號：cau-a214
保藏機構：中國普通微生物菌種保藏管理中心
保藏機構簡稱：cgmcc
地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
保藏日期：2017年1月13日
保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13609
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明，但不限于本發明。下述實施例中如無特殊說明，均為常規方法。
gfg(商業菌劑)，購自四川高福記生物科技有限公司，fg1(商業菌劑)，由日本畜產草地研究所提供。培養基均從北京奧博星生物科技有限公司(北京)購買。
實施例1：植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214的分離與菌株鑒定
1、菌株的分離
采用稀釋平板法分離植物乳桿菌：將10g苜蓿青貯60天的樣品加入到90ml滅菌蒸餾水振蕩均勻，10倍梯度稀釋，然后分別取10-1、10-3和10-5倍樣品稀釋液各20μl涂布在mrs培養基上，30℃恒溫培養箱培養48h；依據菌落大小、形態和顏色等特征，挑取典型菌落，進行過氧化氫酶活性測定、革蘭氏染色和鏡檢試驗。凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株即可初步確定為乳桿菌，將其在mrs培養基上劃線純化兩次，然后保存在1ml加入10％二甲基亞砜的nb培養基中，在-80℃超低溫冰箱保存。
mrs培養基為：蛋白胨(proteosepeptoneno.3)10.0g；牛肉膏(beefextract)10.0g；酵母提取物(yeastextract)5.0g；葡萄糖(dextrose)20.0g；吐溫(polysorbate80)1ml；檸檬酸銨(ammoniumcitrate)2.0g；醋酸鈉(naac)5.0g；硫酸鎂(mgso4·7h2o)0.1g；硫酸錳(mnso4·4h2o)0.05g；磷酸氫二鉀(k2hpo4)2.0g；蒸餾水(h2o)1000ml，固體培養基再加20g/l瓊脂(agar)，121℃，滅菌20min。
2、篩選高產酸、生長速度快的乳桿菌
對從苜蓿自然青貯60天的飼料中分離的乳桿菌，結合生理生化方法及苜蓿榨汁培養方法篩選出產酸速度快、耐酸能力強且生長旺盛的植物乳桿菌cau-a214。菌株的生理性狀測定包括：耐鹽(nacl)濃度、ph范圍生長、溫度范圍生長試驗等；生化性狀測定包括：過氧化氫酶試驗、發酵葡萄糖產氣試驗(同型或異型發酵試驗)、碳源發酵試驗等。
生理生化試驗方法如下：
(1)革蘭氏染色參照東秀珠主編的《常見細菌系統鑒定手冊》。
(2)植物乳桿菌生長ph調節使用2mol/lnaoh和2mol/lhcl。
(3)過氧化氫酶測定試驗：將實驗菌株接種在mrs培養基上并在厭氧培養箱培養48h，挑取單菌落涂布在滴加了3％(w/w)過氧化氫溶液的培養皿上，觀察是否有氣泡產生，產生氣泡的為過氧化氫酶陽性，不產生氣泡的則為陰性。
(4)發酵葡萄糖產氣測定試驗：將實驗菌株接種在mrs培養基上并在厭氧培養箱培養48h，挑取單菌落接種于含有5mlmrs液體培養基(ph6.5)的試管中(杜氏小管倒扣在試管內)，放置于普通恒溫培養箱30℃培養48h，觀察并記錄結果。
(5)碳源發酵測定試驗：對于革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的實驗菌株，采用含有49種碳源，一個對照的analyticalprofileindex(api50ch，biomerieux，france)試驗條件下進行測試，實驗方法根據說明書進行操作，培養于30℃普通恒溫培養箱。48h記錄實驗結果，陽性結果為培養基中所含溴甲酚紫指示劑變黃所示的產酸作用，七葉靈測定(25號管)由紫變黑為陽性。
(6)苜蓿榨汁培養方法：將切碎的新鮮苜蓿與蒸餾水按照1：3的比例混合榨汁并過濾，將濾液121℃滅菌處理15min，以此作為培養基篩選能夠適應苜蓿生境并快速產酸的菌株。
結果表明，植物乳桿菌cau-a214接種于苜蓿汁培養基中生長良好，產酸快速(表1)，能夠較好的適應苜蓿生境。植物乳桿菌cau-a214菌株為革蘭氏陽性，同型發酵的桿菌，在10～50℃和ph3.5～9.0條件下皆可生長，具有較強耐酸性(表2)；可發酵大多數糖類(表3)。
表1植物乳桿菌cau-a214在苜蓿汁中發酵24h后ph及有機酸含量(mg/ml)
表2植物乳桿菌cau-a214的菌落形態及生理生化特性
注：-，不生長；w，長勢微弱；+，正常生長。
表3植物乳桿菌cau-a214碳源發酵實驗結果
注：-，不生長；w，長勢微弱；+，正常生長。
3、菌株的鑒定
將篩選的植物乳桿菌cau-a214接種在0.5mlmrs液體培養基中，30℃，180rmp培養過夜，利用菌液pcr進行菌種鑒定。
引物選用細菌的16srdna基因擴增的通用引物：
27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’
pcr反應體系(50μl)：
反應條件：
擴增產物送華大基因公司測序，16srdna序列如seqidno.1所示，在genebank上進行序列比對，結合生理生化實驗數據，最終確定分離的菌株屬于植物乳桿菌lactobacillusplantarum，命名為cau-a214。
實施例2：苜蓿青貯飼料的制備
苜蓿青貯飼料的制備包括如下步驟：
(1)將苜蓿晾干至水分含量60％左右，并切斷至1cm～2cm，混合均勻；
(2)向步驟(1)苜蓿中按照6logcfug-1接種植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214，并以無添加(control)、gfg(商業菌劑)、fg1(商業菌劑)為對照，每個處理3個重復；
(3)將步驟(2)苜蓿裝入30cm×20cm的聚乙烯青貯袋，每個處理三袋，每袋裝入100g，用真空密封機抽氣、密封，置于室溫貯藏60d。
苜蓿青貯60d后進行營養成分、發酵品質、微生物分析及體外消化實驗。
1、青貯飼料營養成分和發酵品質的鑒定
青貯開袋后，稱取代表性樣品10g，加入90ml蒸餾水，混合均勻，浸泡12h后得到浸出液，用ph計測定浸出液的ph值。用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，過濾后裝入10ml離心管中，放入-20℃備用，用以測定有機酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)及氨態氮(nh3-n)含量。有機酸測定采用島津gc-14型高效液相色譜儀(色譜柱：kc-811column，shimadzu，日本；檢測器：spd-m10avp，流動相：3mmoll-1高氯酸，準確稱取0.8493g的高氯酸，定容到2l的容量瓶中，流速1mlmin-1；柱溫50℃；檢測波長210nm，進樣量5μl)，將剩余青貯樣品置于65℃烘箱中烘48h，測定干物質(dm)含量。將烘干的樣品粉碎過1mm篩后放入自封袋中保存，用于測定常規化學成分及體外消化實驗。粗蛋白(cp)含量的測定采用凱氏定氮法；中性洗滌纖維(ndf)、酸性洗滌纖維(adf)的測定采用范氏纖維分析法；可溶性糖(wsc)的測定采用蒽酮-硫酸比色法。
苜蓿青貯后的營養成分和發酵品質變化如表4、表5所示，添加cau-a214的處理組ph值最低，氨態氮含量最低，乳酸含量最高，干物質含量最高，粗蛋白及可溶性糖含量高于control、gfg和fg1；梭菌是青貯中的有害微生物，其產生丁酸和氨，降低青貯飼料品質，在對照組及商業菌株添加組內均檢測到不同濃度的丁酸成分，而cau-a214處理組未檢測到丁酸成分，說明菌株cau-a214可以有效抑制梭菌等不良微生物的生長繁殖及蛋白水解。因此，添加植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214可提高苜蓿青貯飼料的營養成分和發酵品質。
表4苜蓿青貯60天后發酵品質
注：dm，干重。
表5苜蓿青貯60天后營養成分
2、微生物分析
微生物含量測定采用涂布平板計數法，稱取10g青貯樣品加入滅菌的90ml蒸餾水中，混勻后，10倍梯度稀釋，然后分別取10-1、10-3和10-5倍樣品稀釋液各20μl涂布在mrs、伊紅美藍、孟加拉紅培養基上分別用于檢測乳酸菌、大腸桿菌、霉菌及酵母；將10-1和10-2倍樣品稀釋液1ml在75℃水浴鍋水浴15min后，分別取20μl涂布在營養瓊脂培養基上用于檢測芽孢桿菌，將這些涂布好的培養基30℃培養48h，其中mrs培養基應放置于厭氧培養箱，其它培養基放置于普通恒溫培養箱即可。
伊紅美藍培養基成分(g/l)：蛋白胨10g；牛肉浸粉3g；乳糖10g；氯化鈉5g；曙紅鈉0.4g；亞甲藍0.065g；瓊脂14g。
孟加拉紅培養基成分(g/l)：蛋白胨5g；磷酸氫二鉀1g；硫酸鎂0.5g；葡萄糖10g；氯霉素0.1g；孟加拉紅0.033g；瓊脂18.5g。
營養瓊脂培養基成分：蛋白胨10g；牛肉粉3g；氯化鈉5g，蒸餾水1l，ph值7.2±0.2。121℃高壓蒸汽滅菌15min。。
苜蓿青貯后的微生物含量變化如表6所示，添加植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214可以顯著降低大腸桿菌及芽孢桿菌等不良微生物的含量。
表6苜蓿青貯60天后微生物含量變化(logcfu/goffm)
注：表中同列數據肩標小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)；fm,鮮重。
3、體外消化實驗
瘤胃液取自3頭安裝有永久性瘺管的奶牛，于晨飼前1h采集瘤胃液，采集后等量混合并經四層紗布過濾，39℃水浴保溫，不斷通入co2保持厭氧環境。將0.220g樣品裝入送入100ml玻璃注射器內。加入瘤胃液和預熱的緩沖液，混合均勻。接種于agrs-ⅲ型微生物發酵微量產氣自動記錄儀，39℃連續培養72h，記錄產氣量。每個處理3個平行，另外設3個空白。發酵結束后，尼龍袋用自來水漂洗至至水清澈，然后用蒸餾水清洗2次。65℃烘干至恒重，計算干物質消化率。
苜蓿青貯后體外消化實驗結果如表7所示，添加植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214可以顯著增加苜蓿青貯飼料的干物質消化率，可以顯著提高產氣量，說明添加植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)cau-a214對青貯飼料的消化有益。
表7苜蓿青貯飼料72h體外消化產氣動力學及干物質體外消化率
注：ivdmd，干物質體外消化率；gp，產氣量；a,理論最大產氣量；c，產氣速率；lag，產氣延滯時間；agpr，平均產氣速率。
sequencelisting
<110>中國農業大學
<120>一種植物乳桿菌及其在制備青貯飼料中的應用
<130>2017
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1426
<212>dna
<213>植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）
<400>1
ctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgg60
gcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagc120
gattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaaga180
gattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtag240
cccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcacc300
ggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgt360
tgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtat420
ccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggta480
aggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtc540
aattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttag600
ctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggac660
taccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacaga720
ccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacac780
atggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcgg840
ttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaat900
aaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgt960
ggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttcttta1020
acaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagact1080
ttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctca1140
gtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgt1200
taccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatct1260
ttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgt1320
tatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaa1380
tgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgac1426