專利名稱：人尿激酶原的生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及生產非糖基化單鏈尿激酶原(以下簡稱proUK)的重組DNA方法，特別是涉及生產非糖基化尿激酶原的方法，該方法包括從已建立的細胞系中提取mRNA，基于所說的mRNA制備cDNA，將cDNA插入載體內，再將所得質粒導入細菌細胞中，從而產生轉化株并由所說的細菌細胞中回收非糖基化的proUK。本發明還涉及用于上述方法的某些表達質粒。
由于對調節生理血纖維蛋白溶解作用之分子間相互影響的認識逐漸加深，已導致了在了解血凝塊溶解機制和開發新的血栓溶解劑方面的重要進展。
在人血纖維蛋白溶解系統中，酶原即血纖維蛋白溶酶原可被幾種類型的血纖維蛋白溶酶原激活劑活化成活性酶，即血纖維蛋白溶酶(Collen，D.andLijnen，H.R.，CRCCriticalReviewsinoncology/hematology，4，n.3，P.249，1986;Verstraete，M.andCollen，D.Blood，67，n.6，P.1529，1986)。血纖維蛋白溶酶是負責降解血凝塊中血纖維蛋白成分的主要蛋白酶(Rakoczi，I.，Wiman，B.andCollen，D.Biochim.Biophys.Acta，540，P.295，1978;Robbins，K.C.，Summaria，L.，Hsieh，B.;andShah，R.S.J.Biol.Chem.242，P.2333，1967;Wiman，B.;Eur.J.Biochem.76，P.129，1977)。
然而，血纖維蛋白也可對參予凝血途徑的幾種血漿蛋白，即血纖維蛋白原、因子Ⅴ和Ⅷ發揮其蛋白水解作用(Collen，D.andLijnen，H.R.，CRCCriticalReviewsinoncology/hematology，4，n.3，P.249，1986;Verstraete，M.andCollen，D.Blood，67，n.6，P.1529，1986;Wiman，B.，Lijnen，H.R.andCollen，D.;Biochim.Biophys.Acta，579，P.142，1979)。
血纖維蛋白溶酶原的活化可在全身水平上發生，導致循環血纖維蛋白溶酶迅速被α2抗血纖維蛋白溶酶中和，從而不能用于血纖維蛋白溶解作用(Collen，D.and Lijnen，H.R.，CRC Critical Reviews in oncology/hematology，4，n.3，P.249，1986;Verstraete，M.and Collen，D.Blood，67，n.6，P.1529，1986)。
當α2抗血纖維蛋白溶酶水平明顯降低時，血纖維蛋白溶酶被中和的迅速減慢。且不只對血纖維蛋白，還對如前所述的血凝蛋白產生其蛋白溶解作用。
血漿中血纖維蛋白原、因子Ⅴ和Ⅷ的濃度過度降低，加上血纖維蛋白原對止血過程、血小板聚集及血纖維蛋白聚合產生的抑制作用將導致止血缺陷，進而造成出血的危險(Latallo，Z.S.andLopaciuk，S.;Thrombos.Diath.Haemouh.，56，P.253，1973;Totty，W.G.，Gilula，L.A.，Mc.Clennman，M.，Ahmed，P.，andSherman，L.，Radiology，143，P.59，1982)。另一方面，血纖維蛋白溶酶原的活化可在血纖維蛋白水平上發生(即血纖維蛋白結合的血纖維蛋白溶酶原活化)，形成與血纖維蛋白結合的血纖維蛋白溶酶(Collen，D.and Lijnen，H.R.，CRC Critical Reviews in oncology/hematology，4，n.3，P.249，1986;Verstraete，M.and Collen，D.Blood，67，n.6，P.1529，1986)，從而不受α2抗纖維蛋白溶酶的影響，且不能誘發全身性血纖維蛋白原溶解作用。
常規用于人體血栓溶解治療的血纖維蛋白溶酶原激活劑即尿激酶和鏈激酶對血纖維蛋白并沒有特異活性。兩種化合物可相對無差異地活化循環的或與血纖維蛋白結合的血纖維蛋白溶酶原(Zamarron，C.，Lijnen，H.R.，VanHoef，B.，andCollenD.，Tromb.Haemostas.52，P.19，1984;Samama，M.，andKher，A.，Sem.Hop.Paris，61，n.20，P.1423，1985)。因此，在用鏈激酶和尿激酶治療時，盡管已證明它們具有臨床效果，但由于常常出現全身性止血障礙繼而增加出血危險，而限制了這些血栓溶解劑的廣泛臨床應用(Samama，M.，andKher，A.Sem.Hop.Paris，61，n.20，P.1423，1985;Maizel，A.S.，andBookstein，J.J.Cardiovasc.Intervent.Radiol.，9，P.236，1986;Bell，W.R.，Thromb.Haemostas.，35，P.57，1976;Acar，J.，Vahanian，A.，Michel，P.L.，Slama，M.，Cormier，B.andRoger，V.，SeminavsinThromb.andHaemost.，13，n.2，P.186，1987;GruppoItalianoPerlostudiodellaStreptochinasenell′infartomiocardico(GISSI);Lancet，1，P.397，1986)。
相反，組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)(Hoylaertes，M.，Ryken，D.C.，Lijnen，H.R.and Collen，D.J.Biol.Chem.，257，n.6，P.2912，1982)和新近的尿激酶原(pro-UK)(Husain，S.S.，and Gurewich，V.，Arch.Biochem.Biophys.220，P.31，1983)這兩種天然蛋白質，被證明是循環血纖維蛋白溶酶原的弱激活劑，是與血纖維蛋白結合之血纖維蛋白溶酶原的強激活劑，它們不會引起全身性止血機制障礙或α2抗血纖維蛋白溶酶與血纖維蛋白溶酶原的消耗，因而在臨床應用時出血危險較小。
已根據t-PA通過位于分子內三個二硫鍵結合的“Kringle區域”中的特異性賴氨酸位點結合血纖維蛋白的能力解釋了t-PA的血纖維蛋白特異性血栓溶解活性。
因此，可在沒有明顯止血障礙的情況下活化血纖維蛋白結合的血纖維蛋白溶酶原(Collen，D.，andLijnen，H.R.Haemostasis;16，n.3，P.25，1986)。另一方面，proUK(也稱之為單鏈尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑，scu-PA)并不與血纖維蛋白結合，但它表現有血纖維蛋白特異性血栓溶解活性，且沒有全身性止血因子消耗(Pannell，R.andGurewich，V.，Blood，67，P.1215，1986;GurewichV.，andPannell，R.;SeminarsinTromb.andHaemost.，13，n.2，P.146，1987;Lijnen，H.R.，Zamarron，C.，Blader，M.，Winbler，M.E.，andCollen，D.，J.Biol.Chem.261，P.1253，1986)。
將重組t-PA在急性心肌梗塞病人身上作了多中心臨床試用，結果表明其在重新疏通被阻塞之冠狀動脈上比鏈激酶有效得多(TheEuropeanCooperativeStudyGroupforRecombinantTissue-typePlasminogenActivator;Lancet，1，P.842，1985;Sheehan，F.H.，Braunwald，E.，Canner，P.，Doodge，H.T.，Gore，J.，VanNatta，P.，Passamani，E.R.，Williams，D.O.，Zaret，B.Circulation，75，4，P.817，1987)。
尿激酶原目前處在早期臨床試用階段，它在血栓溶解活性和安全性方面被認為至少是與t-PA一樣有效的(VandeWerf，F.，Nobuhara，M.，andCollen，D.AnnalsofInternalMedicine，104，P.345，1986;VandeWerf，F.，Vanhaecke，J.，DeGeest，H.，Verstraete，M.，andCollen，D.Circulation，74，n.5，P.1066，1986)。
發現尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑(u-PAs)在人尿、血漿和各種細胞系的條件培養基中至少有三種不同的存在形式。第一種形式是由410個氨基酸的纖維蛋白溶解活性多肽組成的U-PA，其表觀分子量為54000道爾頓，含有兩條以二硫鍵連接的鏈(Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F.，Kim，SM.A.，Frankus，E.，andFlohe′，L.Hoppe-Seyler′sZ.Physiol.Chem.363，P.1155，1982)。
A鏈或輕鏈含有157個氨基酸及一個三重二硫鍵結合的“Kringle”結構。該鏈還含有一個正常和腫瘤細胞(單核細胞、類單核細胞及A431表皮細胞)的受體結合區。B鏈或重鏈(30000道爾頓)由253個氨基酸組成并含有催化區域。
U-PA的這一分子形式通常被稱為尿激酶(UK)、雙鏈尿激酶(TC-UK)或高分子量尿激酶(HMW-UK)(Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F.，Buze，G.，andFloh′e，L.Hoppe-Seyler′sZ.Physiol.Chem.363，P.133，1982)。
第二種形式的U-PA分子量為33000道爾頓，是由HMW形式經血纖維蛋白溶酶或胰蛋白酶的蛋白水解降解而產生的，稱為低分子量尿激酶(LMW-UK)。蛋白質順序測定結果顯示，LMW-UK與HMW-UK基本相同，不同的是它沒有經血纖維蛋白溶酶或胰蛋白酶的降解作用特異除去的NH2末端135個氨基酸(Steffens，G.J.，Gunzler，W.A.，Oetting，F.，Frankus，E.，and Flohe′，L.，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，363，P.1043，1982)。天然尿激酶原(proUK)是單鏈形式的尿激酶(54000道爾頓)，也稱為單鏈尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑(scu-PA)。如前所述，proUK表現有血纖維蛋白特異性血栓溶解活性，因此與目前使用的高分子量或低分子量尿激酶相比，其為一種更好的血栓溶解劑。
為了生產尿激酶原，本發明人發展了用于大量制備proUK多肽鏈的重組DNA方法。
文獻中已描述了幾種生產proUK的方法(Holmes，W.E.，Pennica，D.，Blaber，M.，Rey，M.W.，Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.andHeynecker，H.L.;Biotechnology，3，P.923，1985;EuropeanPatentApplication0092182)。雖然本發明所述的方法中利用了在大腸桿菌中表達異源蛋白質的重要參數，但此前卻從未將這些組合應用于生產重組proUK。
主要參數(其組合可用于建立大腸桿菌的重組菌株，以產生proUK，并代表了本發明的目的)是大腸桿菌啟動子Ptrp、來自噬菌體MS-2的Shine-Dalgarno順序MS-2，以及作為表達人proUK基因之宿主的大腸桿菌菌株(見下文)。這種組合是很嚴格的，用其他表達信號取代這些參數中之一，均不能產生這樣多的proUK。
因此，本發明的主題是一種制備非糖基化proUK的方法，其特征在于非糖基化proUK是在大腸桿菌B之大腸桿菌啟動子Ptrp和Shine-Dalgarno順序MS-2的控制下表達的。
本發明涉及用遺傳工程技術構建能高水平表達人ProUK基因的大腸桿菌菌株。因此，這些重組菌株能夠大量合成ProUK多肽鏈。
為了分離所說的大腸桿菌重組菌株，必須經過下列幾個步驟-分離編碼ProUK的人cDNA基因;
-將所說的基因插入適當的表達質粒中;
-用工程質粒轉化選擇的大腸桿菌菌株，并在適當條件下培養轉化株。
1)克隆編碼ProUK的人cDNA基因為了得到編碼人尿激酶原的cDNA克隆，本發明人利用了文獻中已發表的蛋白質順序資料(Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F.，Kim，SM.A.，Frankus，E.，andFlohe′，L.Hoppe-Seyler′sZ.Physiol.Chem.，363，P.1155，1982;Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F.，Buze，G.，andFlohe′，L.Hoppe-Seylers′Z.Physiol.Chem.363，P.133，1982;Steffens，G.J.，Gunzler，W.A.，Oetting，F.，Frankus，E.，andFlohe′，L.，Hoppe-Seylers′Z.Physiol.Chem.，363，P.1043，1982)。
為此，制備了特異性探針并篩選了適用的cDNA文庫。
化學合成了編碼選擇之單鏈尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑肽的寡核苷酸(Caruthers，M.H.，Gassen，H.G.andLang，J.A.(eds)Verlag-Chimie，Weinheim，DeefieldBeach，Basel，P.71，1982)，以用作監測proUKmRNA的富集和由富集的cDNA文庫中選擇含尿激酶原cDNA之克隆的探針。這些寡聚物長度為14至17個單核苷酸(mer)，各寡聚物是作為單一順序(定名為P7)或含兩個(定名為P1、P2、P3)或16個(定名為P6)寡核苷酸的儲備形式合成的。用Northern雜交法試驗這些寡聚物對proUK的特異性(參見
圖1)。為進行這一分析，從HEP-3類表皮癌中提取含PolyA的RNA(Miskin，R.，Haemostasis(Switzerland)，11，No.suppl.1，P.63，1982)。如Suggs等人進行Southem印跡雜交所計算的(Suggs，S.V.，Hirose，T.，Miyake，T.，Kawashima，E.G.，Johnson，M.Y.，Itakura，K.andWallach，R.B.，DevelopmentalBiologyUsingPurifiedGenes;Brown，D.D.andFox，C.F.(eds)，AcademicPress，NewYork，P.638，1981)，在雜交反應后對每種寡聚物的洗滌溫度均調到低于最小熔融溫度2-5℃。如圖1所示，該試驗中有五個proUK探針與一個共同的約2.3Kb的主要癌mRNA帶發生了反應，其大小正是預期的proUKmRNA的大小。
使用從MEp-3類表皮癌中富集的mRNA部分進行克隆。提取RNA制品并經兩次連續蔗糖梯度約富集3倍。用Oligo-dT作引物，按已知方法合成cDNA(Efstratiadis，A.，Kafatos，F.C.，Maxam，A.M.andManiatis，T.，Cell，7，P.279，1976;Buell，G.N.，Wickens，M.P.，Payvar，F.andSchimkeR.T.，J.Biol.Chem.，253，P.2471，1978)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離較長的分子并電洗脫適當的凝膠部分。然后用標準的苯酚/氯仿提取法提取cDNA并用乙醇沉淀之。
按照改良的Davis方法(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.Molecular Cloning，A Labratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1982)，首先將這些cDNA分子連接到EcoRI接頭上，然后再克隆到噬菌體λgt10載體中。如此便構建了含2×105個Pfu(噬斑形成單位)的文庫。
在兩個對應濾膜上篩選文庫的一半，其中一個濾膜帶有32P標記的探針P1，另一個濾膜帶有探針P3和P6的混合物。總共得到36個陽性克隆，其中七個在兩對應濾膜上均顯陽性，從而證明cDNA插入物相當于大部分ProUK編碼順序。
與3個探針雜交的重組噬菌體即使用探針P1純化的噬斑，可用EcoRI限制性酶切法和DNA順序測定法進一步確定其特征。總cDNA文庫中陽性克隆部分表明尿激酶原mRNA在HEp-3類表皮癌中的出現頻率約為0.01%。
對四個ProUKcDNA的順序分析顯示，其中三個克隆有缺失或順序不與酶的氨基酸順序一致。只有一個克隆，即λUc17具有與已知的氨基酸順序完全相符的順序。
然而，λUc17并不包含mRNA的整個3′非編碼端，而且缺少編碼順序的30個核苷酸。將含有5′非編碼區和大部分編碼順序的1325bpλUc17SmaⅠ-BamHⅠ片段，與含有來自另一個克隆λUc6的其余缺失3′區的BamHⅠ-EcoRⅠ片段連接，即構建成全長前尿激酶原cDNA克隆(圖2)。
將該構建物連接到質粒載體pUN121(NilssonB.，Uhlen，M.，JosephsonS.，GatenbeckS.andPhilipsonL.，NucleicAcidResearch11，P.8019，1983)中，從而除去大部分cI基因，得到質粒pcUK176(圖3)。
圖4中給出了完整cDNA克隆的DNA順序。該順序由2296個核苷酸組成，在5′端包含69個非編碼核苷酸，中間有1296個編碼核苷酸，3′端則是931個非編碼核苷酸，之后有一超過80個殘基的Poly(A)尾部。
編碼順序是以編碼含“前尿激酶原”之20個氨基酸的60bp開始的(Heyneker，H.L.，Holmes，W.E.andVehar，G.A.(1983)，EuropeanPatentApplicationPubl.No.0092182)，然后是編碼完整前尿激酶原蛋白的順序，此與氨基酸順序完全符合。
已通過順序和限制性酶切分析檢查了該完整順序，并將編碼成熟之前尿激酶原的順序插入到用于生產的表達載體中。
2)ProUK表達質粒的構建使用存在于PcUK176中的原始全長cDNA構建前尿激酶原表達質粒，即pEC44，其中的proUK基因分別處于啟動子Ptrp和“Shine-Dalgarno”順序MS-2的轉錄與轉譯控制下。圖7中顯示了質粒pEC44。
為得到pEC44而構建了幾個中間質粒。由pDS20(圖5)(Duester，G.，Helfard，R.M.andHolmes，W.M.Cell30，P.855，1982)開始，我們首先用來自M13mp8載體(Vieira，J.andMessing，I.，Gene19，P.259，1982)的EcoRⅠ-HindⅢ多聚接頭順序取代編碼半乳糖操縱子啟動子Pga1的EcoRⅠ-HindⅢ片段，得到一新的質粒，定名為PAB1(圖5)。
由質粒PDR720(購自Pharmacia公司)中作為EcoRⅠ-SalⅠ限制性片段得到啟動子Ptrp。將該片段在EcoRⅠ和Sa1Ⅰ位點之間插到pAB1的多聚接頭區中。如此我們得到新質粒pFC10(圖5)。
pFC10可被看作是基礎載體，在該載體中我們插入了proUK基因及來自噬菌體MS-2的“Shine-Dalgarno”順序。
為了表達成熟的尿激酶原，必須使由成熟蛋白質第一個密碼子開始的ProUK編碼順序融合到起始因子三聯體ATG上。這樣“Shine-Dalgarno”順序必定處在這一融合之前。
來自細胞噬菌體MS-2的核糖體結合部位(RBS)是已知的，并且已公開了它們的核苷酸順序(Fiers，W.，Contreras，R.，Duerinck，F.，Haegeman，G.，Iserentant，D.，Merregaert，J.，MinJou，W.，Molemans，F.，Raeymaekers，A.，VandenBerghe，A.，Volckaert，G.andYsebaert，M.，Nature260，P.500，1976)。
一般認為它是促使mRNA有效轉錄的強信號。因此我們選擇了這個區域作為生產ProUK的轉譯信號。為了實現與ProUK基因的正確核苷酸融合，我們合成了直接連接到ProUK基因開始端之MS-2RBS的雙鏈DNA區域。一個TagⅠ位點存在于成熟ProUK順序的第25個核苷酸上。我們利用了這一位點的優點，并用化學合成方法分離了下列DNA順序HindⅢ5′－AGCTTTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTA3′-AATTATCTGCGGCCGGTAAGTTTGTACTCCTAATTaqⅠCCCATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3′GGGTACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5′該順序上游側接HindⅢ位點，下游側接TaqⅠ位點。其中粗體字母顯示起始密碼子ATG。編碼成熟ProUK順序之起始區的順序下面劃有橫線。
合成的片段被用于與下列兩個限制性片段的連接反應
-來自pcUK176的TaqⅠ-Bg1Ⅱ片段(圖3)，它攜從核苷酸155至核苷酸392的ProUK片段(參見圖4);
-來自pEC10的大的BamHⅠ-HindⅢ片段(圖5)，它攜帶氨芐青霉素抗性基因及啟動子Ptrp。
通過這一構建，我們分離了一個新的質粒，定名為pAB8，其構建圖解如圖6所示。該質粒中，啟動子Ptrp和MS-2RBS被融合到成熟proUK基因的前260個核苷酸上(相當于圖4中的核苷酸131-391)。另外，pAB8有一獨特的NcoⅠ位點，在其中我們通過pcUK176的NcoⅠ-NcoⅠ限制性片段插入了其余的proUK順序。該連接過程在非編碼區中proUK基因的下游造成了NcoⅠ-Bg1Ⅱ片段的重復。但這種重復并不影響質粒的穩定性。通過這一構建信號，現在能夠指導完整proUK順序的合成(參見圖6)。
到現在為止，已描述的所有質粒都是基于氨芐青霉素抗性在大腸桿菌K-12宿主菌株C-600galk(ATCC33955)中選擇的。它們確實攜帶編碼β內酰胺酶的基因(β內酰胺酶可在培養基中降解氨芐青霉素)。早期實驗表明，可將pEC16成功地插入大腸桿菌B型菌株中，并導致高水平產生重組ProUK。
但為了適應生產重組DNA衍生產品之國際準則的要求，我們修飾了質粒pFC16，以得到能夠以高水平表達ProUK基因的新的四環素抗性質粒。具體地說，我們已從已知的質粒pBR322(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.MolecularCloning.AIaboratorymanual.ColdSpringHarbourLaboratory.ColdSpringHarbour，NY，1982)(圖6)中分離了一個EcoRⅠ-AvaⅠ片段，并使用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段將其粘性末端填成平頭(Perbal，B.，AWiley-IntersciencePublication.JohnWileyAndSons，P.231，1984)。如此，我們便用四環素抗性基因取代了β內酰胺酶基因及其控制順序的氨基末端部分。然后以與ProUK基因相同的取向連接四環素抗性基因。
此外，在PvuⅠ和EcoRⅠ位點之間連接處產生了一個前已填充的新的EcoRⅠ位點。新的質粒PEC44(參見圖7)是用于生產重組尿激酶原的最后構建物。
質粒PEC44(有四環素抗性的)和pFC16(有氨芐青霉素抗性的)是本發明的目的之一。有關表達異源蛋白的文獻(RemautE.，StranssensP.andFiersW.，Nucl.Acid.Res.11，P.4677，1983)已經描述了存在于這兩個質粒中的表達信號，即啟動子Ptrp和Shine-Dalgarno順序“MS-2”，但此前從未將它們聯合用于表達ProUK基因。
3)大腸桿菌B型菌株的轉化本發明的第二個主要目的是使用大腸桿菌B型菌株表達和生產尿激酶原。本發明人發現，在大腸桿菌B型菌株中插入質粒PFC16或PFC44將導致高水平產生ProUK多肽鏈。令人感興趣的是，在其他大腸桿菌菌株(K-12型、C型、W型等)中插入質粒PFC16或PFC44則不能產生如此多的ProUK。可見，宿主菌株類型對于成功地生產ProUK似乎是很關鍵的。
可以得到大腸桿菌的幾個B型菌株，并成功地用于表達ProUK基因。優選的菌株是ATCC12407、ATCC11303、NCTC10537。下面是用質粒PFC44轉化菌株NCTC10537，繼而培養轉化株的一個實例。
用Mandel和Higa的氯化鈣法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.53，P.154，1970)制備菌株NCTC10537的感受態細胞。用2μl質粒DNA(濃度約5μg/ml)轉化約200μl上述細胞制劑(1×109細胞/ml)。在含有12.5μg/ml四環素的L瓊脂平板上選擇轉化體。用木質牙簽在含有同種抗生素的L-瓊脂板上劃線接種兩個小菌落(每個牙簽劃三條長約1cm的線)。37℃保溫12小時后，通過接種于10ml LB培養基(含濃度為2.5μg/ml的四環素)并于37℃保溫過夜，檢查劃線部分是否產生人尿激酶原。第二天用含有同濃度四環素的培養基將培養物稀釋100倍，并于37℃保溫6小時。按Laemmli所述的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Laemmli，U.K.，Nature，227，P.680，1970)分析250μl等分培養物中的總細胞蛋白量(O.D.550＝1-1.5)。在兩份樣品中查到分子量相當于非糖基化人尿激酶(45000道爾頓)的一條主要蛋白帶(圖8)。
隨意選出一組相當于菌落No.2(菌落2)的劃線，作進一步定性并選為ProUK生產菌株。
材料和方法生長培養基按Maniatis等人所述的方法(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.MolecularCloning.AIaboratorymanual.ColdSpringHarbourLaboratory.ColdSpringHarbour，Ny，1982)制備培養基。使用Difcobacto產品制備LB培養基、LB瓊脂和MacConkey瓊脂。M9培養基中含有Na2HPO4，6g/l;KH2PO4，3g/l;NaCl，0.5g/l;NH4Cl，1g/l。上述各組分經高壓消毒(1大氣壓，120℃，20分鐘)后，每升內加入1M MgSO41ml、1M CaCl20.1ml、22%葡萄糖16ml、0.5mg/ml硫胺素(SIGMA)20ml和2%酪蛋白氨基酸(DIFCO)20ml。所得溶液經過濾除菌。
限制性核酸內切酶及其他酶的使用限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶及DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)購自NewEnglandBiolabs公司和BoehringerMannheim公司;這些酶均按制造商要求的條件使用。
質粒DNA的制備基于Birnboim和Doly的方法(Birnboim，H.C.andDoly，J.，NucleicAcidRes.7，P.1513，1979)制備質粒DNA，其中包括使用染料-浮力密度離心法(dye-buoyantdensitycentrifugation)。
DNA順序分析使用AmershamM13順序分析試劑盒，按照制造商推薦的方法獲得順序資料。簡單地說，這一基于Sanger方法(Senger，F.，Science214，P.1205，1981)的技術包括在以其單鏈構型得到的適用M13載體(“mp家族”)中再克隆各限制性片段。單鏈形式與“通用引物”一起退火后，有可能用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)拷貝DNA模板。經在四種二脫氧核苷酸存在下拷貝模板，即可能導致鏈延伸的隨機終止。然后在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離截短的片段，并經放射自顯影顯示電泳圖形。
寡核苷酸使用AppliedBiosystem(ABI)DNA合成儀，按照ABⅠ使用說明書介紹的程序合成用于質粒構建及在DNA順序分析中用作引物的寡核苷酸。
其他操作按照Maniatis等人所述的方法(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.MolecularCloning.Alaboratorymanual.ColdSpringHarbourLaboratory.ColdSpringHarbour，NY，1982)進行核酸的瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳。按照Laemmli所述的方法(Laemmli，U.K.，Nature，227，P.680，1970)經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。通過電泳進入透析袋，由瓊脂糖凝膠中提取DNA，并經乙醇沉淀濃縮之。
圖1顯示了探針P1、P2、P3、P6和P7的核苷酸順序、互補的mRNA順序以及由探針編碼的ProUK肽。
圖2顯示限制性內切酶裂解產物的大小和定位，這一結果是經用電泳法估計并經DNA順序分析證實的。黑區代表成熟ProUK蛋白的編碼順序，劃斜線的區域代表“前-原”肽編碼順序，白區為5′和3′非轉譯順序。mRNA的5′端在左側。限制圖下方的線指示兩部分克隆λUc17和λUc6的貢獻。
圖3顯示攜帶已插入PUN12中以取代大部分cⅠ基因之cDNA克隆的EcoRⅠ-SmaⅠ片段。質粒PcUK176仍帶有四環素和氨芐青霉素抗性。＊cI代表失活的CI蛋白。
圖4顯示克隆PcUK176的完整cDNA順序及其相應的轉譯之氨基酸順序。已用于質粒構建的限制性位點下面劃有橫線。成熟ProUK順序中2264和2277位上的兩個聚腺苷酸化位點及Ⅰ位的絲氨酸也以下劃橫線標示。
圖5顯示了四個中間構建物。攜帶通用本底構建元件的起始質粒PDS20經由不同的中間質粒松釋了啟動子Pga1、galk基因和β內酰胺酶基因。
圖6顯示包括質粒PFC16的另外三個中間構建物，其中所說的質粒可高水平地表達ProUK(詳見正文)。
圖7顯示PFC44中成熟ProUK的編碼順序處于啟動子Ptrp和來自噬菌體MS-2之“核糖體結合位點”的控制下。四環素基因已被插入到β內酰胺酶基因的位置，因此PFC44是對氨芐青霉素敏感的。
圖8顯示樣品的電泳分析結果。按正文所述的方法制備和分析樣品，并加于12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠(丙烯對雙丙烯酰胺之比為40∶1)。其中泳道1和2含有用PEC44轉化之兩個NCTC10537菌株培養物的材料。箭頭指示重組尿激酶原蛋白的位置。泳道3顯示得自對照宿主菌株NCTC10537的材料。泳道4中顯示分子量標準。
本發明涉及生產非糖基化尿激酶原的重組DNA方法。該方法是基于在大腸桿菌菌株中插入編碼ProUK的人基因，然后培養所說的轉化菌株。
在大腸桿菌中生產異源蛋白質是現代生物工藝學的一個熱門課題(HarrisT.J.R.andEmtageJ.S.MicrobiologicalSciences，3，P.28-31，1986)。當今分子生物學家充分利用了啟動子、Shine-Dalgarno順序、終止子等幾種表達信號，用以選擇表達所需的蛋白質。啟動子啟動信使RNA的合成，而Shine-Dalgarno順序將保證mRNA有效地轉譯成多肽鏈。
然而，這些參數(信號)的結合是異源基因表達的一個重要特征。例如，將有效的Shine-Dalgarno順序融合到不同的啟動子區，可導致不同的表達水平。此外，攜帶表達信號之限制性片段的長度常常會影響生產水平(McCarthyJ.E.G.，SebaldW.，GrossG.andLammersR.，Gene，41，P.201，1986)。
在建立有效生產方法的過程中，宿主菌株的選擇也是一個關鍵性步驟。事實上，已知在不同菌株內插入同一表達質粒可出現很不相同的表達效率(HarrisT.J.R.andEmtageJ.S.，MicrobiologicalSciences，3，P.28-31，1986)。
雖然本發明描述的表達信號是現有技術中已知的，但它們的結合卻從未用于人尿激酶原的特定表達。具體地說，本發明的質粒PFC16和PFC44攜帶處于大腸桿菌啟動子Ptrp和噬菌體Shine-Dalgarno順序MS-2控制下的ProUK基因。
因此，本發明公開的生產方法是基于使用與以前所述表達質粒不相同的質粒，即PFC16和PFC44，它們代表了本發明的一個新穎方面，也是本發明的目的之一。
另外，本文所公開的方法中利用了大腸桿菌B型菌株的優點。而現有文獻中描述的表達方法是基于使用K-12型大腸桿菌菌株完成的。因此，在B型大腸桿菌菌株中生產ProUK代表了本發明的另一個新穎的方面。
該第二個方面是極為重要的。事實上，對宿主生物體的選擇可以在幾個步驟上影響整體生產過程。
例如，宿主類型可以顯著地影響高生物量發酵過程。本發明人及其他小組的研究人員均已發現，B型大腸桿菌菌株要比其他菌株如K-12菌株更易于生長。在K-12菌株如C600傳代重組菌株中插入同樣的表達質粒，在發酵罐中并不能象重組B型菌株那樣有效地生長。換句話說，當使用同樣的表達質粒時，B型菌株中重組非糖基化ProUK的產率要更高些。
與選擇宿主菌株有關的另一個重要特征是ProUK生產過程中的細菌污染物不同。某些污染物，如蛋白酶，可嚴重地影響重組產物的產率。
有趣的是，Winkler和Blaber(Winkler，M.E.，Blaber，M.Biochemistry，25，n.14，P.4041，1986)于1986年已介紹了基于使用K-12菌株294(ATCC31446)生產Pro-UK的方法。該方法中，作者必須采用多種措施以避免ProUK遭受蛋白水解作用。據作者分析，這些蛋白水解活性是由來自宿主菌株的細菌蛋白酶產生的。與之相反，本發明使用的B型菌株細胞提取物中蛋白水解活性要低得多。特別是發現由K-12菌株C600中提取的Pro-UK要比從B菌株中提取的Pro-UK污染尿激酶的量高。
總之，本發明人相信，與現有技術相比，使用本文描述的方法可獲得更高產率的重組Pro-UK，此代表了一個不可預料的結果，并且是對已知方法的一種改進。
權利要求
1.一種制備非糖基化Pro-UK的方法，特征在于非糖基化Pro-UK是在大腸桿菌啟動子ptrp和Shine-Dalgarno順序MS-2的控制下由大腸桿菌B表達的。
2.根據權利要求1的方法，其中非糖基化單鏈尿激酶原分子量約為45000道爾頓。
3.根據權利要求1的方法，特征在于大腸桿菌B主要表達Pro-UK的順序。
4.根據權利要求1的方法，特征在于Pro-UK的cDNA順序是由HEp-3類表皮癌細胞的mRNA獲得的。
5.根據權利要求1的方法，特征在于啟動子Ptrp是由得自質粒PDR-720的EcoRⅠ-Sa1Ⅰ限制性片段構成的。
6.根據權利要求1的方法，特征在于含有Shine-Dalgarno順序MS-2、ATG起始密碼子和Pro-UK基因之起始部分、上游接有HindⅢ位點且下游接有TaqⅠ位點的順序是HindⅢ5′－AGCTTTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTA3′-AATTATCTGCGGCCGGTAAGTTTGTACTCCTAATTaqⅠCCCATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3′GGGTACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5′
7.如圖6所示的表達質粒FC-16。
8.如圖7所示的表達質粒FC-44。
全文摘要
本發明提供一種生產非糖基化單鏈尿激酶原(prouk)的方法。該方法包括培養已用攜帶編碼prouk之cDNA順序的質粒轉化的大腸桿菌菌株。
文檔編號C12N15/09GK1042181SQ8910858
公開日1990年5月16日 申請日期1989年10月10日 優先權日1988年10月11日
發明者安內·布蘭德茲, 波洛·薩米恩道斯, 蓋塔諾·沃爾西尼 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司