專利名稱：培養附著性細胞的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培養動物細胞的方法及裝置，特別是涉及一種培養附著性細胞的方法及裝置。
由于在制藥及生物科技工業對于由動物細胞生產的產品日漸增加的需求，發展動物細胞培養方法在生物醫學界已經是不可或缺的工作，大多數動物細胞的培養，例如哺乳類動物細胞的培養，因為細胞無法在培養基中懸浮生長，所以必須藉助實體讓細胞附著。針對培養附著性動物細胞已經發展出許多細胞培養系統，這些系統例如包括有組織培養器、滾動瓶式、細胞培養器、位于攪拌槽的微載體、中空織微及陶瓷系統(參閱Wei-Shou Hu等人的論文，即“Animal Cell Bioreactors-Recent Advances and challenges to Scale-up”The Canadian Journal of Chemical Engineering，“Specialized Techniques”Volume 69，April，1991，pages 409-420；“Specialized Techniques，”Cultureof Animal Cells，Chapter 23，pages 371-377)。
在動物細胞培養的過程中，一個最基本的需求就是要充分供給例如氧氣的氣體及養份，如果不能供應充足的氣體或養份，會阻礙細胞的生長，另外一個需求就是要控制新陳代謝產物的程度，否則當其在培養基中累積到高濃度時，會阻礙細胞的生長。
該滾動瓶式是一種浴式系統，沒有培養基的循環設備，該系統包括有容納培養基并架在支撐物上滾動的瓶子，一般是在一滾動的瓶子內部盛入約有該瓶子內部容積1/10-1/5量的培養基，讓細胞附著在該瓶子的內部表面生長，并藉由瓶子滾動時在瓶子未浸到的內部表面上所形成的培養基薄膜促進氣相及液相間氣體的交換，增加培養基中的溶氧量，因此即使當細胞密度較高時細胞仍能獲得氣體或氧氣充分的供應，這種系統也提供了增加細胞附著的表面積及平緩的攪動，而使用諸如一吸量管或是蠕動泵的注入裝置或分配設備增加新鮮的培養基。
但是，該系統卻不能夠控制pH值及溶氧，而且，因為缺乏培養基的循環裝置，所以需要經常更換培養基以移除有毒的新陳代謝廢物及養份的消耗，這是非常辛苦的勞力工作。在大量生產時，需要大量數目的瓶子，操作系統非常費力而且難以得到品質均勻的產品，因此，這種滾動瓶式的應用受到了限制。
具有培養基循環系統的細胞培養系統有益于補充培養基及移除新陳代謝的產物，在此種系統中，細胞是持續地浸在其培養基中，并且控制培養基的比例以供給細胞充分的養份及溶氧。
微載體系統為循環型的系統，其能輕易地擴張成大量生產，然而，除了價格昂貴外，基于細胞容易與微實體相分離的原因，尤其是在有高剪力存在的時候，這種系統的操作相當不方便。
另一種培養型的培養系統為栓塞流生物反應器，例如中空織微及陶瓷系統。在中空織微系統中，一培養基以高流速通過織微的內腔并且只有小部分滲透過織微的薄膜，這些中空織微系統通常能提供高的培養密度或效率，但是，因為小分子量的養份供給以及新陳代謝產物的移除通常需要藉由橫過薄膜的濃度梯度的分子擴散來達成，所以溶氧及養份難以附著中空織微的長度及厚度而增加，因此，這種中空織微系統仍然難以生產大尺寸的細胞。
在該陶瓷系統中，細胞植入一多孔性陶瓷圓柱的槽道中，并且讓培養基通過這些槽道以提供養份及移除新陳代謝物，藉由泵使培養基循環以增加溶氧量，然而，為了能夠充分地供給溶氧，通常需要增加培養基的循環速率，而增加培養基的循環速率則會使細胞從附著面脫落，反而對生產效率有不利的影響。
本發明的主要目在于提供一種動物細胞培養系統，包括一能夠輕易移除新陳代謝物及重新補充或置換培養基的培養基循環系統，并且允許細胞附著面自培養基中浮現出來，使其能夠在培養基的薄膜及氣體之間輕易交換氣體，能夠解決即使在高密度細胞下的氧氣不足的問題。
本發明的另一目的在于提供一種培養基循環系統的改進，不會產生高剪力且讓培養基對生長的細胞供給充份的溶氧。
本發明的另一目的在于提供一種動物細胞培養系統，能夠控制及輕易地設計成大規模的生產。
本發明更進一步的目的在于提供一種動物細胞培養系統，能夠經細胞附著的表面積及能夠輕易地讓細胞與其培養實體分離。
上述的目的藉由本發明所提供的培養附著性細胞的裝置及方法來達成。
本發明的裝置包括一個具有入口裝置、出口裝置及含有一個讓細胞附著的附著面的實體裝置的細胞培養室，以及一個用于在該細胞培養室內經由入口裝置及出口裝置循環培養基的裝置。本發明的裝置更進一步包括一個當培養基循環時，用于將該附著面浸入該培養基的裝置，以及一個當培養基循環時，間歇地將該實體裝置從培養基中暴露出來的裝置，以經由該培養基在該附著面所形成的薄膜增加氣體的交換速率。
該實體裝置最好是固定的，且該浸入裝置與該暴露裝置和該循環裝置結合在一起，以升高培養基的液位以浸淹該實體裝置并且降低培養基的液位使附著面上留下一層薄膜。提供一用于儲存培養基的裝置與該培養基循環裝置并以流體方式連通。
該浸入及暴露裝置可包括在入口及出口裝置的控制閥，以控制培養基入口及出口的流量。
本發明的另一特征在于提供一種培養附著性細抱的方法，包括有(a)提供一個細胞培養室，具有一入口、一出口及含有讓細胞附著的附著面的實體裝置；(b)在該培養室內經由該培養室的入口及出口循環培養基；(c)當培養基在循環時，將該附著面浸在該培養基中；及(d)當該培養基在循環時，間歇地將該實體裝置自該培養基中暴露出，以經由在步驟(c)之后在該附著面上所形成的培養基薄膜增加氣體的交換率。
該附著面最好間歇地藉由排放培養基來降低培養基的液位，以在附著面上形成一培養基的薄膜，該附著面藉由培養基的供給將培養基的液位升高到附著面之上的位置以浸入培養基中，該培養基是從培養開始不斷地循環直到細胞附著到附著面上為止，在細胞附著到附著面上之后，該培養基的液位是在一預定的距離下交換地降低及升高，以將該實體裝置的附著面間歇地暴露出，該培養基的循環操作是持續固定變化培養基的液位，以提供培養基平緩的攪動。
下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細說明
圖1是本發明較佳實施例的培養附著性細胞的裝置的示意圖。
圖2是本發明較佳實施例的局部示意圖，其中更詳細地表示出該培養室。
圖3是本發明較佳實施例使用的平板實體組合的示意圖。
如圖1、2、3所示，一培養裝置包括一個容器1，該容器1具有一個用以容納一培養基的培養室11、用以供給培養基的上入口12及入口13、一個用以排放培養基的出口14，及一個讓溢流向外流出的溢流口15。一個第一儲存槽2設在比培養室11低的位置處，而一個第二儲存槽3設在比培養室11高的位置處。
一個包括多個實體板71的實體裝置7設在培養室11內，用以提供細胞生長的附著面，該等實體板71是朝垂直方向延伸且在水平方向間隔分開排列的平板，雖然在本較佳實施例中只用平板來表示細胞附著的實體，但是本發明所使用的實體裝置不應僅限制于此，其他如以往用來讓細胞附著的網狀平板或填墊材料的實體，也可以用在本發明中。
一個用以循環培養基的循環裝置，包括一個供給管41、一個排放管42、一個溢流管43及一循環管線44，該供給管41連接上、下入口12、13及第二儲存槽3，該排放管42連接出口14與該第一儲存槽2，該溢流管43延伸在該溢流口15與該第一儲存槽2之間，該循環管線44則連接該第一儲存槽2及第二儲存槽3并且結合一泵45，用以將培養基從第一儲存槽2輸送到第二儲存槽3。
閥161、第一、二控制閥162、163及溢流閥164是用以控制培養基在溢流管43、排放管42及供給管41內的流量，藉由三向閥的溢流閥164能夠根據培養裝置的操作需求，將培養基經由上入口部12或下入口部13供應到該培養室11內。空氣濾菌器171及172設在培養室11，空氣濾菌器173及174分別設在第一儲存槽2及第二儲存槽3，一個供氣泵5與空氣濾菌器171連接以視需要將新鮮空器抽取到培養室11。一個液位計9連接第一儲存槽2以監測在第一儲存槽2內的培養基的液位變化，當培養基的液位到達一預定的液位時，就啟動該泵45將培養基輸送到第二儲存槽3。
一個虹吸管(siphon device)6一端連接該第一儲存槽2，另一端連接該排放管42，該虹吸管6的高度安排為當工基的液位到達高于該等實體板71高度的液位可使虹吸管6開始吸取培養基，其高度幾乎與溢流口15的高度相同。
本發明的培養裝置可更進一步包括一個用于在培養室頂部或底部側邊的一或二個均勻分配培養基的裝置，如本較佳實施例所示，該均勻分配裝置8設置在該培養室11的頂部用以將培養基均勻分配到平的實體板71上，該裝置8包括連接到入口13且具有多個分布在培養室11頂部側邊的排放開孔的分配管81，及一個具有針孔的盤82用以容納來自分配管81的培養基并將其均勻分配到實體板71上，另一方面，也可以使用一噴淋裝置(圖未示)來代替有針孔的盤82以噴淋培養基。
該裝置的操作始于細胞附著階段，在該階段，培養基是從第二儲存槽3藉由重力或壓力梯度由第二控制閥163控制在一適當的穩定速率供給到培養室11中，在此同時溢流口15的閥161打開以將培養基的液位維持在高度h4或是滿液位狀態，以使所有的實體板71浸在培養基中，從溢流口15流出的培養基藉由重力或壓力梯度經由溢流管43向下流到第一儲存槽2中，藉由液位計9監測在第一儲存槽2內的培養基液位，控制泵45啟動以將培養基輸送到第二儲存槽3中，當第一儲存槽2內的培養基液位低于下限時，該泵45停止運作，如此，該培養基經由通過該培養室11及第一儲存槽2與第二儲存槽3的回路循環，該循環周期約為30分鐘，或是依據細胞附著在實體上所需的期間而更短或更長。
在細胞附著到實體板71的表面之后，關閉溢流閥161并且打開第一控制閥162，而第二控制閥163仍然保持打開的狀態，因為在此狀態下培養基的液位是在滿液位或高于虹吸管6的高度，該培養基則藉由虹吸管6產生的吸力經由排放口14抽取到第一儲存槽2中，當液位降低時，暴露出該等實體板71的附著面并且在各實體板71上只停留下一層薄的培養基，重復操作以使該等實體板71間歇地從培養基中暴露出來，一個操作循環的周期約需要30秒的時間，依據在管41及43中一定體積率的流量f1及f2，從液位下降開始到液位上升結束的循環周期可用如下所述來決定的。
如圖2所示，h1及h2分別表示培養室11底部至實體板71底部的高度，以及培養室11底部至實體板71頂部的高度，h3是培養室11至虹吸管6的高度，以及h4是培養室11底部至溢流口15的高度，培養基的液位高度為H，在圖3中，w為培養室的寬度，1為其長度，當培養基供給到培養室中升高培養基液位時，該虹吸管6并未運作并且在溢流管43的培養基流量f2(除以體積)恒保持于零；在此狀態之下當0＜H＜h1，或h2＜H＜h3，該液位的上升速率是由該方程式決定u1＝f1/w1 (1)當h1＜H＜h2，該液位的上升速率是由該方程式決定u1＝f1/w(1-Nd)(2)(此處N為實體板的數目，d為各實體板的厚度)在虹吸管6運作而使培養基液位下降的階段中，假設在管41及43內的培養基流量f1及f2為常數，在這種情況下，當0＜H＜h1， 或h2＜H＜h3，該液位的下降速率是由該方程式決定u2=f2-f1w1---(3)]]>當h1＜H＜h2，該液位的下降速率是由該方程式決定u2=f2-f1w(1-Nd)---(4)]]>因此，將培養基液位從0升高到h3所需的時間是由該方程式決定t1＝w[(h1+h2+h3)1+(h2-h1)(1-Nd)]/f1(5)以及將培養基液位從h3降低到0所需的時間是由該方程式決定t2＝w[(h1+h2-h3)1+(h2-h1)(1-Nd)]/(f2-f1)(6)結果，從液位下降開始到液位上升結束的循環所需要的總時間為
tp＝t1+t2(7)雖然如以上所述的較佳實施例包括有固定的實體板，藉由升高及降低液位將其間歇地從培養基的液面暴露出來，但是也可以使用向上及向下移動實體板的安排方式來使實體板暴露或浸入培養基中。
權利要求
1.一種培養附著性細胞的裝置，包括一個具有入口、出口的細胞培養室、一個設在該細胞培養內的實體裝置，及一個用以循環培養基經由該細胞培養室、入口及出口的循環裝置，該循環裝置連接該入口及出口，其特征在于該循環裝置間歇地升高及降低該培養基相對于該實體裝置表面的液位，在該實體裝置不相對于該培養室移動之下，于一在該實體裝置高度上方的高液位與一在該實體裝置下方的低液位之間；該循環裝置當該培養基達到該低液位時控制該培養基經該入口流入，且當該培養基達到該高液位時控制該培養基經該出口流出。
2.如權利要求1所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置包括一個第一儲存槽，該第一儲存槽連通該出口且設在比該細胞培養室低的位置處。
3.如權利要求2所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置更包括一個第二儲存槽，該第二儲存槽其位于該細胞培養室的上游且比該細胞培養室的頂部為高的位置。
4.如權利要求3所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置更包括一個介于該第一及第二儲存槽之間的泵。
5.如權利要求4所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置包括一個連接該出口及該第一儲存槽，且在該培養基液位到達高液位時產生一吸力的虹吸管。
6.如權利要求5所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置更包括一個連接該出口且控制該培養基液流出量的第一控制閥，及一個連接該入口且控制該培養基液液入該細胞培養室的第二控制閥。
7.如權利要求6所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置更包括一個在該實體裝置頂部上方的液位與該細胞培養室連通的溢流管，且該溢流管連接一個溢流閥。
8.如權利要求7所述的培養細胞的裝置，其特征在于該循環裝置更包括一個監測在該第一儲存槽內的培養基液位的裝置，且啟動該泵運作的均勻分配裝置。
9.如權利要求8所述的培養細胞的裝置，其特征在于該入口包括一個設在靠近該細胞培養室頂部的第一入口，及一個設在靠近該細胞培養室底部的第二入口。
10.如權利要求9所述的培養細胞的裝置，其特征在于該裝置更包括用以將氣體從該細胞培養室頂部供應到該細胞培養室內的裝置。
11.一種培養附著性細胞的方法，包括(a)提供一個具有一個入口、一個出口的細胞培養室，及一個可附著細胞的實體裝置；(b)將一培養基送入該細胞培養室內且使細胞附著于該實體裝置，其特征在于更包括以下(c)經由該入口及出口循環培養基，且在細胞生長期間交互地升高及降低培養基相對于該實體裝置表面的液位，且在該實體裝置不相對于該培養室移動之下，于一在該實體裝置高度上方的高液位與一在該實體裝置下方的低液位之間，以間歇地將細胞沉入培養基且將細胞暴露于一在該培養基液位上方的氣體環境；(d)當培養基達到該高液位時控制培養基經該出口流出；及(e)當培養基達到該低液位時控制培養基經該入口流入。
全文摘要
一種附著性細胞培養方法及裝置，該裝置包括一具入口、出口的細胞培養室、一設在培養室內的實體裝置以給細胞附著，及一藉培養室、入口及出口循環培養基的裝置。該循環裝置間歇升高及降低培養基相對于實體裝置表面的液位，在實體裝置不相對于培養室移動之下，于一在實體裝置高度上方的高液位與一在實體裝置下方的低液位之間。該循環裝置也可在培養基達到高、低液位時控制其經出、入口流出、入。該方法則是使用該裝置以培養細胞。
文檔編號C12M3/04GK1168921SQ9711363
公開日1997年12月31日 申請日期1997年6月18日 優先權日1996年6月18日
發明者廖明一, 熊定宇 申請人:廖明一