源自腦膜炎奈瑟氏球菌的basb059多肽的制作方法

專利名稱：源自腦膜炎奈瑟氏球菌的basb059多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及多聚核苷酸(這里指的是″BASB059多聚核苷酸″)，由該多聚核苷酸編碼的多肽(這里指的是“BASB059”或“BASB059多肽”)，重組材料以及重組材料的生產方法。另一方面，本發明涉及上述多肽和多聚核苷酸的使用方法，包括防止細菌感染的疫苗。更進一步地，本發明涉及檢測某些病原體感染的診斷方法。
由血清組A的腦膜炎球菌支配的流行病，大部分在中非，有時發病率高達1000/100,000/年(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.臨床微生物學綜述(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。幾乎腦膜炎疾病的所有病例都是由血清組A，B，C，W-135和Y腦膜炎球菌引起的，并且已經有四價的A，C，W-135，Y多糖疫苗(Amand，J.，Arminjon，F.，Mayard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10335-339，1982)。最近，通過和載體蛋白化學交聯的方法，上述多糖疫苗得以改善(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等JAMA 2751499-1503，1996)。
沒有血清組B疫苗，因為有人發現B莢膜多糖不具有免疫原性，很0可能是由于它和宿主的組分具有結構相似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等傳染病雜志(J.Infect.Dis.)126514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Makela，P.M.Lancet ii355-357，1983)。
多年以前就開始并進行了發展基于腦膜炎球菌外膜的疫苗的努力(de Moraes，J.C.l，Perkins，B.，Camargo，M.C.等Lancet3401074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.等3381093-1096，1991)。它證明這樣的疫苗在較大的兒童(＞4歲)和成人中表現出的效力為57％-85％。
在這些疫苗中存在許多細菌的外膜成份，如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB，這些成份對于所觀察到的保護效應的貢獻還有待進一步闡明。通過使用動物的或人的抗體，其它細菌外膜成份，如TbpB和NspA，已經被認為可能與保護性免疫的誘導相關(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R，實驗藥物雜志(J.Exp.Med.)1851173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，p.等傳染病免疫，(Inf.Immun.)63884-890，1995)。保護性免疫的機制可能涉及抗體介導的殺菌活性和調理性噬菌活性(opsonophagocytosis)。
一種菌血癥動物模型被用來結合所有的抗體介導的機制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.Poolman，J.T.Vaccine 7325-328，1989)。一般認為，后期補體成分介導的殺菌機制對于抗腦膜炎球菌疾病的免疫是至關重要的(Ross，S.C.，Rosenthal P.J.，Berberic，H.M.，Densen，P.傳染病雜志(J.Infect.Dis.)1551266-1275，1987)。
在過去的幾十年中腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitiddis)感染的頻率顯著增加。這是由于出現了多抗生素抗性的菌株以及由于免疫系統減弱的人群的增加。分離出具有幾種或所有常規抗生素抗性的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株不再是罕見的現象。這一現象產生了未滿足的醫療需要，以及對新的抗微生物制劑、疫苗、藥物篩選方法、以及對這種生物的診斷檢測的需求。
通過閱讀隨后的說明書和通過閱讀本公開內容的其它部分，對于本領域的技術熟練人員而言，在本公開的發明的精神和范圍內的多種變化和修飾將是顯而易見的。
本發明進一步提供了(a)一種分離的多肽，該多肽包括的氨基酸序列和SEQ IDNO2的同一性至少為85％，更優選地至少為90％，更優選地至少為95％，最優選地至少為97-99％或完全相同。
(b)由一種分離的多聚核苷酸編碼的多肽，上述分離的多聚核苷酸包括的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO1在SEQ ID NO1的全長上的同一性至少為85％，更優選地至少為90％，更優選地至少為95％，最優選地至少為97-99％或完全相同。
(c)由一種分離的多聚核苷酸編碼的多肽，上述分離的多聚核苷酸所編碼的多肽和SEQ ID NO2的氨基酸序列的同一性至少為85％，更優選地至少為90％，更優選地至少為95％，最優選地至少為97-99％或完全相同。
在SEQ ID NO2中提供的BASB059多肽是源自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多肽。
本發明還提供了BASB059多肽的免疫原性片段，即，BASB059多肽的一個連續部分(contiguous portion)，該連續部分的免疫原性和含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同。這就是說，該片段(如果需要的話，與載體偶聯時)能夠引起識別BASB059多肽的免疫應答。這樣的免疫原性片段包括，例如，缺少N-末端引導序列，和/或跨膜區域，和/或C-末端錨定區域的BASB059多肽。在一個優選的方面中，根據本發明的BASB059免疫原性片段含有基本上一個多肽的所有細胞外區域，上述多肽和SEQ ID NO2在SEQ IDNO2的全長上至少具有85％的同一性，更優選地至少90％的同一性，更優選地至少95％，最優選地至少97-99％的同一性。
一個片段是一種多肽，該多肽的氨基酸序列與本發明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分，但不是全部，完全相同。對于BASB059多肽而言，片段可以是“獨立存在的(free-standing)”，或者是被包含在較大的多肽中，在較大的多肽中它們形成一個部分或區域，最優選地是在一個單一的較大多肽中作為單一的連續區域。
優選的片段包括，例如，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其變體的一部分的、截短的多肽，例如包括氨基和/或羧基端氨基酸序列的一系列連續殘基。在宿主細胞中產生的，或由宿主細胞產生的降解形式的多肽也是優選的。進一步優選的是具有結構或功能特征的片段，如含有α-螺旋和α-螺旋形成區域，β-平面和β-平面形成區域，轉角和轉角形成區域，卷曲或卷曲形成區域，親水性區域，疏水性區域，α兩親性區域，β兩親性區域，柔性區域，表面形成區域，底物結合區域和高抗原性指數區域的片段。
進一步優選的片段包括一種分離的多肽，該多肽含有的氨基酸序列至少有15，20，30，40，50或100個源自SEQ ID NO2氨基酸序列的連續氨基酸殘基，或者一種分離的多肽，該多肽含有的氨基酸序列上至少有15，20，30，40，50或100個的從SEQ ID NO2氨基酸序列上截短或缺失連續氨基酸殘基。
通過肽段合成，本發明的多肽片段可以被用于生產相應的全長多肽；因此，這些片段可以被用作生產本發明的全長多肽的中間產物。
特別優選的是一些變體，在這些變體中幾個5-10，1-5，1-3，1-2或1個氨基酸以任何組合形式被替換，缺失或添加。
本發明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白的形式，或較大蛋白如前體蛋白或融合蛋白的一部分。包含一個附加的氨基酸序列經常是有利的，上述序列含有分泌或引導序列，前序列，輔助純化的序列例如多個組氨酸殘基，或一個附加的用于增加重組生產中的穩定性的序列。此外，還考慮到添加外源多肽或脂類末端或多聚核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性潛力。
在一方面，本發明一般涉及經基因工程改造的可溶融合蛋白，上述可溶融合蛋白含有本發明的多肽或其片段，以及免疫球蛋白的各種亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區域的各個部分。優選的免疫球蛋白是人IgG，尤其是IgG1，的重鏈的恒定區，融合在鉸鏈區進行。在一個特定的實施方案中，通過引入能被血凝因子Xa切割的切割序列，可以簡單地將Fc部分除去。
此外，本發明涉及通過基因工程制備這些融合蛋白的方法，以及它們在藥物篩選，診斷和治療上的應用。本發明的一個更進一步的方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技術的例子可以在國際專利申請號WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白可以進行化學交聯，或作為重組融合蛋白表達；重組融合蛋白使得其在表達系統中的生產水平比非-融合蛋白提高了。融合配偶體(fusion partner)可以幫助提供T輔助表位(免疫球蛋白融合配偶體)，優選地為被人類識別的T輔助表位；或幫助蛋白的表達(表達增強子)，使融合蛋白的表達產量比天然重組蛋白更高。優選的融合配偶體將既是免疫球蛋白融合配偶體也是表達增強配偶體。
融合配偶體包括源自Haemophilus influenzae(流感嗜血桿菌)的蛋白D和源自流感病毒的非-結構蛋白，NS1(血凝素)。另一種融合配偶體是被稱為LytA的蛋白。優選的是使用該分子的C末端部分。LytA源自Streptococcus pneumoniae(肺炎鏈球菌)，它合成一種N-乙酰基-L-丙氨酸-酰胺酶，酰胺酶LytA，(由lytA基因編碼{Gene，43(1986)265-272頁})一種特異性降解肽聚糖主鏈上某些化學鍵的自溶素。LytA蛋白的C-末端區域負責對膽堿或一些膽堿類似物例如DEAE的親和性。這個特性已被利用于發展大腸桿菌C-LytA表達質粒，該質粒可用來表達融合蛋白。在蛋白質的氨基末端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已有描述{生物技術(Biotechnology)(1992)795-798頁}。可以使用在LytA分子的C末端從殘基178開始的重復部分，例如殘基188-305。
本發明也包括上述多肽的變體，即與參照多肽相比進行了氨基酸保守替代的多肽，在這樣的多肽中一個殘基被另一具有相似特征的殘基所替代。通常這樣的替代是在Ala，Val，Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe和Tyr之間進行。
本發明的多肽可以用任何適當的方法制備。這樣的多肽包括分離的天然存在的多肽，重組產生的多肽，合成產生的多肽，或通過這些方法的組合產生的多肽。制備這樣的多肽的方法在本領域中已經眾所周知。
本發明的多肽源自腦膜炎奈瑟氏球菌是最優選的，但是，它也可以優選地從相同分類學種屬的其它生物得到。本發明的多肽也可能從，例如，從相同分類學科或目的生物得到。多聚核苷酸本發明的一個目的是提供編碼BASB059多肽的多聚核苷酸，尤其是編碼本文指定的BASB059多肽的多聚核苷酸。在本發明的一個特定的優選實施方案中，多聚核苷酸包含一個編碼BASB059多肽的區域，該區域含有在SEQ ID NO1中列出的序列，該序列包括一個全長基因，或一個全長基因變體。
在SEQ ID NO1中提供的BASB059多聚核苷酸是源自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多聚核苷酸。
作為本發明的進一步的方面，提供了編碼和/或表達BASB059多肽和多聚核苷酸，尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽和多聚核苷酸，的分離的核酸分子，包括，例如，為未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因組DNA，B-和Z-DNA。本發明的進一步的實施方案包括生物學上，診斷上，預防上，臨床上或治療上有用的多聚核苷酸和多肽，和它們的變體，以及包含上述多聚核苷酸，多肽或變體的組合物。
本發明的另一個方面涉及分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包括至少一個全長基因，它編碼推導的具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的BASB059多肽，它還編碼與此緊密相關的多聚核苷酸及其變體。
在本發明的另一個特定的優選實施方案中，有源自腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB059多肽，它包含或由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其變體組成。
利用本文提供的信息，例如在SEQ ID NO1中列出的多聚核苷酸序列，可以通過常規的克隆和篩選方法得到本發明的編碼BASB059多肽的多聚核苷酸，例如那些用腦膜炎奈瑟氏球菌細胞作為起始材料從細菌中克隆和測序染色體DNA片段，然后獲得全長的克隆的方法。例如，為了獲得本發明的多聚核苷酸序列，如在SEQ ID NO1中給出的多聚核苷酸序列，通常用源自部分序列的，放射性標記的寡核苷酸，優選為17聚體或更長，探測在大腸桿菌(E.coli)或其它一些合適的宿主中的腦膜炎奈瑟氏球菌染色體DNA克隆文庫。然后利用嚴緊的雜交條件可以區別出含有與探針DNA相同的DNA的克隆。根據原始的多肽或多聚核苷酸設計測序引物，用測序引物通過雜交鑒定出單獨的克隆，然后就可能在兩個方向上延伸多聚核苷酸序列以確定全長基因序列。這樣的測序可以方便地進行，例如，使用從質粒克隆制備得到的變性雙鏈DNA。適當的技術在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，(MLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL)，2ndEd.(分子克隆實驗手冊，第二版)；冷泉港實驗出版社(Cold SpringHarbor Laobratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約(1989)中有所描述(特別參見1.90的Screening By Hybridization(雜交篩選)和13.70的Sequencing Denatured Doubled-StrandedDNA Template(變性雙鏈DNA模板的測序))。也可以進行直接的基因組DNA測序以得到全長的基因序列。本發明的示例，SEQ ID NO1中列出的各個多聚核苷酸，是在源自腦膜炎奈瑟氏球菌的DNA文庫中發現的。
并且，SEQ ID NO1中列出的各個DMA序列含有一個編碼蛋白的開放閱讀框，上述蛋白大致具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸殘基數，可以通過本領域中的技術熟練人員眾所周知的氨基酸殘基分子量計算得到其推算出的分子量。
SEQ ID NO1中的多聚核苷酸在SEQ ID NO1的核苷酸數1的起始密碼子和在核苷酸數337開始的終止密碼子之間編碼了SEQ IDNO2的多肽。
在一個進一步的方面中，本發明提供了一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有以下部分或由以下部分組成(a)一種多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列和SEQ IDNO1在SEQ ID NO1的全長上的同一性至少為85％，更優選地至少為90％，更優選地至少為95％，最優選地至少為97-99％或完全相同。
(b)一種多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列編碼的多肽和SEQ ID NO2中的氨基酸序列在SEQ ID NO2的全長上的同一性至少為85％，更優選地至少為90％，更優選地至少為95％，最優選地至少為97-99％或100％完全相同。
可以通過一種方法得到編碼本發明的多肽的多聚核苷酸，包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌以外的種屬的同源物或直向同源基因，該方法包括以下步驟用含有SEQ ID NO1的序列或其片段的，或由它們組成的標記的或可檢測的探針，在嚴緊雜交條件下(例如，溫度在45-65℃之間，SDS濃度在0.1％-1％之間)篩選適當的文庫；并且分離出含有上述多聚核苷酸序列的全長的基因和/或基因組克隆。
本發明提供了一種多聚核苷酸序列，該序列在其全長上與SEQ IDNO1的編碼序列(開放閱讀框)完全相同。本發明還提供了一種成熟多肽或其片段的編碼序列自身，或者在閱讀框中與另一編碼序列，如編碼引導或分泌序列，前蛋白序列，或前體蛋白序列，或前前體蛋白序列的序列，在一起的一種成熟多肽或其片段的編碼序列。本發明的多聚核苷酸還可能含有至少一個非編碼序列，包括，例如但不限于，至少一個非編碼的5’和3’序列，如轉錄但不翻譯的序列，終止信號(如rho依賴性和非rho依賴性的終止信號)，核糖體結合位點，Kozak序列，穩定mRNA的序列，內含子和多聚腺苷酸化信號。多聚核苷酸序列還可以含有編碼附加的氨基酸的附加編碼序列。例如，可以編碼便于融合多肽的純化的標記序列。在本發明的某些實施方案中上述標記序列是6組氨酸肽，上述6組氨酸肽由pQE(PQE)載體提供，并且在Gentz等美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86821-824(1989)中有所描述，或者是HA肽標記(Wilson等，Cell 37767(1984))，兩種序列都可以用來純化與其融合的多肽序列。本發明的多聚核苷酸還包括，但不限于，含有結構基因的多聚核苷酸，以及調控基因表達的與基因天然相聯系的序列。
編碼SEQ ID NO2的BASB059多肽的核苷酸序列可以與SEQ IDNO1的核苷酸1到336包含的多肽編碼序列相同。替代地，它也可以是一段由于遺傳密碼的冗余性(簡并性)而同樣編碼SEQ ID NO2的多肽的序列。
此處所用的術語“編碼多肽的多聚核苷酸”包括一些多聚核苷酸，上述多聚核苷酸包括編碼本發明的多肽的序列，上述多肽特別指細菌多肽，更特別地指具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽。該術語還包括含有編碼上述多肽的單一連續區域或不連續區域(例如，多聚核苷酸被整合噬菌體，整合插入序列，整合載體序列，整合轉位子序列所中斷，或者由于RNA編輯或基因組DNA重排所中斷)以及附加區域的多聚核苷酸，上述附加區域也可能含有編碼和/或非編碼序列。
本發明進而涉及此處描述的多聚核苷酸的變體，它編碼具有SEQID NO2的推導的氨基酸序列的多肽的變體。本發明的多聚核苷酸的片段可以被用來，例如，合成本發明的全長多聚核苷酸。
進一步特別優選的實施方案是編碼BASB059變體的多聚核苷酸，上述變體具有SEQ ID NO2的BASB059多肽的氨基酸序列，并且其中幾個，一些，5到10個，1到5個，1到3個，2個，1個或無氨基酸殘基以任何組合形式被替換、修飾、缺失、和/或添加。其中特別優選的是不改變BASB059多肽的特性和活性的沉默替換、添加和缺失。
本發明進一步優選的實施方案是在其全長上和編碼BASB059多肽的多聚核苷酸具有至少85％的同一性的多聚核苷酸，以及與這樣的多聚核苷酸互補的多聚核苷酸，上述BASB059多肽具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列。在這一點上，與同一多聚核苷酸在全長上具有至少90％同一性的多聚核苷酸是特別優選的，在這些特別優選的多聚核苷酸中，那些具有至少95％同一性的是尤其優選的。進而，在那些具有95％同一性的多聚核苷酸中，具有至少97％同一性的那些是高度優選的，其中那些至少98％和至少99％的是特別高度優選的，而具有至少99％的是更為優選的。
所編碼的多肽基本上保留了與SEQ ID NO1的DNA所編碼的成熟多肽一樣的生物學功能或活性的多聚核苷酸為優選的實施方案。
根據本發明的某些優選的實施方案，提供的多聚核苷酸和BASB059多聚核苷酸序列，如SEQ ID NO1中的那些多聚核苷酸序列，雜交，尤其是在嚴緊的條件下雜交。
本發明進一步涉及與本文提供的多聚核苷酸序列雜交的多聚核苷酸。在這一點上，本發明尤其涉及在嚴緊條件下與本文描述的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。本文使用的術語“嚴緊條件”和“嚴緊雜交條件”的意思為只有在序列間的同一性至少為95％，優選地至少為97％時才會發生的雜交。嚴緊雜交條件的特定例子為在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml變性的，剪切的鮭精DNA的溶液中42℃溫育過夜，然后在大約65℃在0.1×SSC中洗滌雜交支持物。雜交和洗滌的條件是眾所周知的，并且在Sambrook，等，分子克隆實驗手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，第二版，冷泉港，N.Y.，(1989)中有示例，尤其是其第11章。也可以用本發明提供的多聚核苷酸序列進行溶液雜交。
本發明還提供了一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有，或由一段多聚核苷酸序列組成，上述多聚核苷酸序列是通過篩選含有SEQ IDNO1中列出的多聚核苷酸序列的完整基因的適當文庫，并且分離上述多聚核苷酸序列而得到的，上述篩選是通過使用具有上述在SEQ IDNO1中列出的多聚核苷酸序列或其片段的序列的探針，在嚴緊的雜交條件下進行的。可用于獲得這樣的多聚核苷酸的片段包括，例如，在本文其它處充分描述的探針和引物。
作為本文別處所討論的關于本發明的多聚核苷酸的分析，例如，本發明的多聚核苷酸，可以被用作RNA，cDNA和基因組DNA的雜交探針以分離編碼BASB059的全長cDNAs和基因組克隆，以及分離和BASB059基因有高同一性，特別是高序列同一性，的其它基因的cDNA和基因組克隆。這樣的探針通常將含有至少15個核苷酸殘基或堿基對。優選地，這樣的探針將含有至少30個核苷酸殘基或堿基對并且可以有至少50個核苷酸殘基或堿基對。特別優選的探針將含有至少20并且少于30個核苷酸殘基或堿基對。
通過用SEQ ID NO1提供的DNA序列合成寡核苷酸探針進行篩選，可以分離BASB059基因的編碼區域。然后用標記的具有與本發明的基因序列互補的序列的寡核苷酸篩選cDNA，基因組DNA或mRNA文庫，從而確定探針與文庫的哪些成員雜交。
有幾種獲得全長DNA，或延伸短DNA的，并且為本領域的技術熟練人員所共知的方法，例如那些基于快速擴增cDNA末端(RapidAmplicaition of cDNA ends，RACE)的方法(參見，例如，Rrohman，等，PNAS USA 858998-9002，1998)。最近的該技術的改造，例如，以MarathonTM技術(Clontech Loboratories Inc.)作為例子，已經顯著簡化了較長的cDNA的搜索。在MarathonTM技術中，從選定的組織中提取得到的mRNA被制備成cDNA，并且在兩端被鏈接上’匹配’序列。然后用基因特異的和匹配特異的寡核苷酸引物共同進行核酸擴增(PCR)以擴增DNA“缺失”的5’末端。利用″嵌套″引物反復進行PCR反應，上述″嵌套″引物即被設計用來在擴增產物中退火的引物(通常匹配特異的引物進一步將匹配序列的3’端退火，基因特異的引物將所選定的基因序列的5’端退火)。然后可以通過DNA測序分析上述反應的產物，全長DNA的構建可以通過直接把產物與已存在的DNA連接以產生全長序列，或者利用新的序列信息設計5’引物單獨進行全長的PCR。
如本文在涉及多聚核苷酸的分析中所進一步討論的，本發明的多聚核苷酸和多肽可以被用作，例如，發現疾病，尤其是人類疾病，的治療和診斷方法的研究試劑和材料。
作為源自序列SEQ ID NO1-2的寡聚核苷酸的本發明的多聚核苷酸可以用于本文所描述的方法中，但優選地用于PCR，以確定本文所鑒定的多聚核苷酸是否在被感染組織的細菌中被部分或全部轉錄。已經認識到這樣的序列也可用于診斷該病原體所達到的感染階段和感染類型。
本發明也提供編碼多肽的多聚核苷酸，該多肽是成熟蛋白加上附加的氨基或羧基-末端氨基酸，或成熟多肽內部的氨基酸(例如，當成熟形式具有一條以上的肽鏈時)。這樣的序列可以在蛋白從前體到成熟形式的過程中起作用，可以允許蛋白運輸，可以延長或縮短蛋白的半衰期，或可以便于蛋白在分析或生產中的操作，等等。通常在體內，附加的氨基酸可以被細胞的酶加工而離開成熟蛋白。
對于本發明的每個多聚核苷酸，本發明提供了與之互補的多聚核苷酸。優選地，這些互補的多聚核苷酸是完全與每個和它們互補的多聚核苷酸完全互補的。
由上述多肽的成熟形式與一個或多個前序列融合而成的前體蛋白可以是該多肽的無活性形式。當前序列被除去時，這種無活性的前體通常被激活。一些或全部的前序列可以在激活之前被除去。通常，這樣的前體被稱為前體蛋白。
在描述本發明的某些多聚核苷酸時除了常規的A，G，C，T/U核苷表示法外，也可以用術語“N”。“N”表示在DNA或RNA序列的該指定位置可以為四個DNA或RNA核苷中的任何一個，但是當以下情況是優選時除外當某個核苷酸與相鄰位置的核苷酸一起，在正確的閱讀框中將導致在這樣的閱讀框中產生提前終止密碼子效應時，N不是那個核苷酸。
總而言之，本發明的多聚核苷酸可以編碼成熟蛋白，成熟蛋白加上引導序列(將被稱為前蛋白)，成熟蛋白的前體，上述前體具有一個或多個并非前蛋白或前前體蛋白的引導序列的前體序列，前前體蛋白是前體蛋白的前體，它具有引導序列和一個或多個前體序列，上述前體序列和引導序列通常在加工步驟中被除去，產生上述多肽的活性成熟形式。
根據本發明的一個方面，提供了本發明的多聚核苷酸在治療或預防上的應用，特別是在基因免疫上的應用。
本發明的多聚核苷酸在基因免疫上的應用將優選地使用適當的輸送方法，例如直接將質粒DNA注射入肌肉(Wolff等，人類分子遺傳學(Hum Mol Genet)(1992)1363，Manthorpe等，人類基因治療(Hum.Gene Ther)(1983)4419)，輸送DNA和特定蛋白載體的復合物(Wu等，生物化學雜志(J Biol Chem.)(1989)26416985)，將DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)839551)，將DNA包入各種形式的脂質體中(Kaneda等，Science(1989)243375)，顆粒轟擊(Tang等，Nature(1992)356152，Eisenbrau等，DNA細胞生物學(DNA Cell Biol)(1993)12791)和用克隆的反轉錄病毒載體進行體內感染(Seeger等，PNAS USA(1984)815849)。載體，宿主細胞，表達系統本發明還涉及含有本發明的一種或幾種多聚核苷酸的載體，用本發明的載體經遺傳工程得到的宿主細胞以及通過重組技術生產本發明的多肽。利用源自本發明的DNA構建體的RNA也可以通過無細胞翻譯系統生產這樣的蛋白質。
通過本領域中的技術熟練人員眾所周知的方法可以從基因工程改造的含有表達系統的宿主細胞制備本發明的重組多肽。因此，在更進一步的一個方面中，本發明涉及含有本發明的一種或幾種多聚核苷酸的表達系統，涉及用這樣的表達系統進行基因工程改造的宿主細胞，并涉及通過重組技術生產本發明的多肽。
為了本發明的多肽的重組生產，可以對宿主細胞進行基因工程改造以使其整合表達系統或表達系統的組成部分，或本發明的多聚核苷酸。可以通過許多常規的實驗室手冊中描述的方法將多聚核苷酸導入到宿主細胞中，例如Davis等，分子生物學基本方法(BASIC METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLOININGA LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港實驗出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，例如磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，轉位，顯微注射，陽離子脂類介導的轉染，電穿孔，轉導，刮棒負載(scrape loading)，彈道法導入(ballisticIntroduction)和感染。
適當宿主的代表例子包括細菌細胞，如鏈球菌，葡萄球菌，腸球菌，大腸桿菌，鏈霉菌，藍細菌，Bacillus subtiLIs(枯草桿菌)，Moraxella catarrhalis(狹鼻摩拉克氏菌)，Haemophilusinfluenzae(嗜血流感桿菌)和Neisseria meningitidis(腦膜炎奈瑟氏球菌)的細胞，真菌細胞如酵母，Kluveromyces(克魯維酵母)，Saccharomyces(啤酒酵母)，basidiomycete(擔子菌類)，Candidaalbicans(白色絲酵母)和Aspergillus(曲菌屬)的細胞；昆蟲細胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9細胞；動物細胞如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑色素瘤細胞；植物細胞如裸子植物和被子植物的細胞。
許多種表達系統可以用于生產本發明的多肽。這樣的載體其中包括源自染色體的，附加體的和病毒的載體，等等，例如，源自細菌質粒，噬菌體，轉位子，酵母附加體，插入元件，酵母染色體元件的載體和源自病毒，如桿狀病毒，乳多空病毒如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，細小核糖核酸病毒，反轉錄病毒和α-病毒的載體以及來自它們的組合的載體，如源自質粒和噬菌體遺傳元件的載體，如粘粒載體和噬菌體粒載體。表達系統構建體可以含有調節并導致表達的調控區域。通常，任何適于在宿主細胞中維持，擴增或表達多聚核苷酸和/或表達多肽的系統或載體都可以在這點上用于表達。可以通過多種眾所周知的常規方法中的任何一種將適當的DNA序列插入到表達系統中，上述方法的例子如，例如，Sambrook等，分子克隆，實驗手冊(MOLECULAR CLONNING.A LABORATORY MANUAL)(上文)中所列出的方法。
為了將翻譯的蛋白分泌到內質網腔，到周質間隙或到細胞外環境，在真核生物重組表達系統中可以將適當的分泌信號整合到表達的多肽中。這些信號可以是上述多肽的內源信號或外源信號。
可以用眾所周知的方法從重組細胞培養物回收和純化本發明的多肽，上述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和植物凝集素層析。最優選地，用金屬離子親和層析(Ion metalaffinity chromatograhpy，IMAC)進行純化。當多肽在細胞內合成，分離和/或純化過程中變性時，可以利用眾所周知的蛋白質重折疊技術重新生成活性構象。
表達系統也可以是重組的活微生物，例如病毒或細菌。感興趣的基因可以被插入到活的重組病毒或細菌的基因組中。上述活載體的接種和體內感染將導致抗原在體內的表達并誘導免疫應答。用于上述目的的病毒和細菌如痘病毒，(例如牛痘病毒，禽痘病毒，金絲雀痘病毒)α-病毒(新培斯病毒，Semliki森林病毒，委內瑞拉馬腦炎病毒)，腺病毒，腺相關病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰質炎病毒，鼻病毒)，疤疹病毒(帶狀水痘病毒，等等)，利斯特菌，沙門氏菌，志賀氏菌，奈瑟氏菌，卡介苗。這些病毒和細菌可以是毒性的，或者是經過多種方法弱化以得到活疫苗。這樣的活疫苗也構成了本發明的一部分。診斷，預測，血清型和突變分析本發明還涉及將本發明和BASB059的多肽多聚核苷酸用作診斷試劑的用途。對真核生物，特別是哺乳動物，尤其是人類，體內的BASB059多聚核苷酸和/或多肽的檢測將提供診斷疾病，確定疾病的階段或確定感染生物體對藥物的反應的方法。可以通過多種眾所周知的技術和本文提供的方法在核酸或氨基酸水平上檢測真核生物，特別是對哺乳動物，尤其是人類，特別是那些感染了或易于被含有BASB059基因或蛋白的生物感染的人。
可以從被懷疑感染了和/或被感染的個體的身體物質獲得用于預測，診斷或其它分析的多肽或多聚核苷酸。源自任何這些來源的多聚核苷酸，特別是DNA或RNA，可以被直接用來檢測，或可以在分析之前通過PCR或任何其它擴增技術用酶進行擴增。RNA，特別是mRNA，cDNA和基因組DNA也可以以相同的方式被應用。利用擴增，可以通過分析個體體內存在的感染或駐留生物體的選定多聚核苷酸的基因型，對上述生物體的物種和菌株的特征進行鑒定。通過將擴增產物和選自相關生物體的參照序列的基因型進行比較而改變折增產物的大小，可以檢測缺失和插入，上述相關生物體優選地為同一屬的不同種或同一種的不同菌株。通過擴增DNA與標記的BASB059多聚核苷酸序列的雜交可以鑒定定點突變。可以通過DNA酶或RNA酶分別對DNA或RNA的水解，或通過檢測融解溫度或復性動力學的差異可以將完好匹配或明顯匹配的序列和不完好匹配或更明顯不匹配的雙鏈體分開。也可以通過比較多聚核苷酸片段與參照序列在凝膠上的電泳遷移性質的改變而檢測多聚核苷酸序列的差異。這可以在存在或不存在變性劑的條件下進行。也可以通過直接的DNA或RNA測序檢測多聚核苷酸的差異。參見，例如，Myers等，Science，2301242(1985)。也可以通過核酸酶保護分析，如RNase，V1和S1保護分析，或通過化學裂解的方法揭示特定部位的序列變化。參見，例如，Cotton等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，854397-4401(1985)。
在另一個實施方案中，可以構建含有BASB059核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探針陣列，以便有效地篩選，例如，基因突變，血清型，分類學的分類或鑒定。陣列技術方法是眾所周知的并且具有廣泛的可應用性，并可以被用于解決分子遺傳學中的許多問題，包括基因表達，遺傳連鎖和遺傳變異性(參見，例如，Chee等，Science，274610(1996))。
因此，在另一方面，本發明涉及一種診斷試劑盒，該診斷試劑盒含有(a)本發明的多聚核苷酸，優選地為SEQ ID NO1中的核苷酸序列，或其片段；(b)與(a)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(c)本發明的多肽，優選地為SEQ ID NO2中的多肽或其片段；或(d)針對本發明的多肽的抗體，優選地為針對SEQ ID NO2中的多肽的抗體。
要明白在所有的這樣的試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包括重要的成分。這樣一種試劑盒在其中診斷一種疾病或情疑一種疾病中是有用途的。
本發明還涉及本發明的多聚核苷酸作為診斷試劑的應用。對與疾病或病原性相關的本發明的多聚核苷酸，優選地為SEQ ID NO1，的突變形式的檢測將提供一種診斷工具，這種診斷工具將增加，或定義，一種疾病的診斷，疾病進程的預測，疾病階段的確定，或對一種疾病的易感性，上述疾病是由于該多聚核苷酸的表達不足，表達過量或表達改變造成的。可以通過各種技術，例如本文其它處所描述的技術，在多聚核苷酸水平上對在這樣的多聚核苷酸上帶有突變的生物，尤其是傳染性的生物進行檢測。
也可以用各種技術，例如，通過血清型分型，在多聚核苷酸或多肽水平上對源自一種生物體的細胞進行檢測，上述生物體在本發明的多聚核苷酸和/或多肽上含有突變或多態性(等位基因變種)。例如，可以用RT-PCR檢測RNA中的突變。尤其優選的是聯合使用RT-PCR和自動化的檢測系統，如，例如，GeneScan。RNA，cDNA或基因組DNA也可以被用于相同的目的，PCR。作為例子，與編碼BASB059多肽的多聚核苷酸互補的PCR引物可以被用于鑒定和分析突變。
本發明進而提供了在5’和/或3’端除去1，2，3或4個核苷酸的引物。這些可以被用于擴增從源自個體的樣品，如身體物質，分離得到的BASB059DNA和/或RNA。上述引物可以被用于擴增從被感染的個體分離得到的多聚核苷酸，以便該多聚核苷酸可以進行多種技術的分析以便闡明該多聚核苷酸的序列。通過這種方法可以檢測多聚核苷酸上的突變并用于診斷和/或預測感染，或感染的階段或進程，或對感染物質進行血清學分型和/或分類。
本發明進而提供了診斷疾病的方法，上述疾病優選地為細菌感染，更優選地為由腦膜炎奈瑟氏球菌導致的感染，上述方法包括確定源自個體的樣品，如身體物質，中具有SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸的表達水平升高了。可以利用本領域中眾所周知的多聚核苷酸定量方法的任何一種測量BASB059多聚核苷酸表達的升高或降低，上述多聚核苷酸定量方法如，例如，擴增，PCR，RT-PCR，RNase保護，Northern印跡法，分光光度法和其它雜交方法。
此外，通過檢測BASB059多肽相對于正常對照組織樣品過量的表達，根據本發明的診斷分析可以被用于，例如，檢測感染的存在。可以用來確定源自宿主的樣品，如身體物質，中BASB059多肽的水平的分析技術對于本領域中具有一定技術的人員是眾所周知的。這樣的分析方法包括放射性免疫分析，競爭結合分析，Western印跡分析，抗體夾心法分析，抗體檢測和ELISA分析。
本發明的多聚核苷酸可以被用作多聚核苷酸陣列的組成成分，上述陣列優選地為高密度的陣列或網格。這樣的高密度陣列對于診斷和預測目的而言是特別有用的。例如，一組點，每個含有不同的基因，并進而含有本發明的一種或幾種多聚核苷酸；利用源自或從身體樣品得到的探針，這樣的一組點可以被用來探測個體中特定多聚核苷酸序列或相關序列的存在例如利用雜交或核酸擴增。這樣的存在可能意味著存在病原體，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌，并且可以用于診斷和/或預測疾病或疾病的進程。含有SEQ ID NO1中的多聚核苷酸序列的許多變體的網格是優選的。含有編碼SEQ ID NO2中的多肽序列的多聚核苷酸序列的變體的網格也是優選的。抗體本發明的多肽和多聚核苷酸或它們的變體，或表達它們的細胞，可以被用作免疫原以生產分別對這樣的多肽或多聚核苷酸具有免疫特異性的抗體。
在本發明的某些優選的實施方案中，還提供了針對BASB059多肽或多聚核苷酸的抗體。
可以利用常規方法，通過對動物，優選地為非人類動物，施用本發明的多肽和/或多聚核苷酸，或兩者之一或兩者的帶表位的片段，或兩者之一或兩者的類似物，或表達或兩者之一或兩者的細胞，來得到針對本發明的多肽或多聚核苷酸的抗體。對于單克隆抗體的制備，可以使用本領域中已知的任何通過連續細胞系培養物產生抗體的技術。例子包括各種技術，如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature256495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫學(Immunology Today)472(1983)；Cole等，Pg.77-96 In單克隆抗體和癌癥治療(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的技術。
生產單鏈抗體的技術(美國專利第4，946，778號)可以被采用來生產針對本發明的多肽或多聚核苷酸的單鏈抗體。同時，轉基因小鼠，或其它生物體或其它動物，如其它哺乳動物，可以被用來表達對本發明的多肽或多聚核苷酸具有免疫特異性的人源化抗體。
替代地，也可以用噬菌體展示技術選擇對本發明的多肽具有結合活性的抗體基因，該抗體基因或者源自原始文庫(naive library)或源自PCR擴增的淋巴細胞V-基因庫，上述淋巴細胞源自經篩選具有抗-BASB059抗性的人類(McCafferty，et al.，(1990)，Nature348，552-554；Marks，等，(1992)生物技術(Biotechnology)10，779-783)。這些抗體的親和性也可以通過，例如，鏈改組得以提高(Clackson等，(1991)Nature 352628)。
以上描述的抗體也可以被用來分離或鑒定表達本發明的多肽或多聚核苷酸的克隆，用來通過，例如，親和層析純化上述多肽或多聚核苷酸。
因此，抗BASB059多肽或BASB059多聚核苷酸的抗體等等可以被用來治療感染，特別是細菌感染。
多肽變體，包括抗原性的，表位的或免疫學上的等效變體構成了本發明的一個特定的方面。
優選地，抗體或其變體被修飾使其在個體中具有較少的免疫原性。例如，如果該個體是人，最優選地抗體可以被“人源化”，在人源化抗體中源自雜交瘤的抗體的一個或幾個互補決定區被轉移到人的單克隆抗體中，例如，如Jones等(1986)，Nature 321，522-525中，或Tempest等，(1991)生物技術(Biotechnology)9，266-273中所描述。拮抗劑與激動劑-分析和分子本發明的多肽和多聚核苷酸可以被用于評測小分子底物與配基和，例如，細胞，無細胞制備物，化學文庫和天然產物混合物的結合。這些底物和配基可以是天然底物和配基或可以是結構或功能類似物。參見，例如，Coligan等，免疫學中的通用方法(CurrentProtocols In Immunology)1(2)第5章(1991)。
篩選方法可以是通過與待選化合物的相關的直接或間接標記簡單地測量待選化合物與多肽或多聚核苷酸，或與帶有該多肽或多聚核苷酸的膜或細胞，或與該多肽的融合蛋白的結合。替代地，該篩選方法可以與標記的競爭物競爭。進而，利用對于含有上述多肽或多聚核苷酸的細胞適當的檢測系統，這些篩選方法可以測試待選化合物是否導致由于該多肽或多聚核苷酸的激活或抑制而產生的信號。通常在存在已知的激動劑的情況下檢測激活的抑制劑，并觀察在待選化合物存在的情況下激動劑的激活效應。具有組成型活性的多肽和/或組成型表達的多肽和多聚核苷酸可以被用于在無激動劑或抑制劑的情況下篩選反激動劑或抑制劑的方法中；上述篩選是通過，根據具體情況，測定待選化合物是否導致對上述多肽或多聚核苷酸的激活的抑制。進而，篩選方法可以簡單地含有以下步驟將待選化合物與含有本發明的多肽或多聚核苷酸的溶液混合以形成混合物，測量混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性，并將混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性與標準進行比較。融合蛋白，如本文先前所描述的Fc部分和BASB059多肽的融合蛋白，也可以被用于鑒定本發明的多肽的拮抗劑，以及鑒定系統發生和/或功能上相關的多肽的高通量篩選檢測(參見D.Bennett等，分子識別雜志(J Mol.Recognition)，852--58(1995)；和K.Johanson等，生物化學雜志(J Biol Chem)，270(16)9459-9471(1995))。
與本發明的多肽結合和/或相互作用的多聚核苷酸，多肽和抗體也可以被用于設計篩選方法，上述篩選方法用于檢測加入的化合物對mRNA和/或多肽在細胞中的生成的影響。例如，通過本領域中眾所周知的方法用單克隆或多克隆抗體建立ELISA方法，以測量分泌的或與細胞相關的多肽的水平。這可以用來在適當的處理過的細胞或組織中尋找可能抑制或增強多肽生成的物質(也分別稱為拮抗劑或激動劑)。
本發明也提供了一種篩選化合物的方法，以鑒定那些增強(激動劑)或阻斷(拮抗劑)BASB059多肽或多聚核苷酸的作用的化合物，特別是那些具有抑菌和/或殺菌作用的化合物。篩選的方法可能涉及高通量技術。例如，為了篩選激動劑或拮抗劑，將一種合成的反應混合物，一種含有BASB059多肽的細胞區室，例如膜，細胞外膜或細胞壁，或任何上述制備物與該多肽的標記底物或配基在有或無待選分子存在的情況下溫育，上述待選分子可能是BASB059的激動劑或拮抗劑。待選分子激活或拮抗BASB059多肽的能力是通過標記配基的結合的下降，或通過從這樣的底物生成的產物的量的降低來反映的。沒有理由地(gratuitously)結合，即，不誘導BASB059多肽的效應，的分子很可能是很好的拮抗劑。結合得很好并且，根據具體情況，提高從底物生成產物的速率，增強信號轉導或增強化學通道活性的分子是激動劑。可以通過使用報告系統增強對，根據具體情況，從底物生成產物的速率，或信號轉導水平或化學通道活性水平的檢測。在這方面有用的報告系統包括，但不限于，本領域中已知的比色系統，被轉化為產物的標記底物，對BASB059多聚核苷酸或多肽活性的變化響應的報告基因以及結合分析。
另一個BASB059激動劑檢測方法的例子是競爭檢測法，該方法將BASB059和可能的激動劑與BASB059-結合分子，重組的BASB059結合分子，天然底物或配基，或底物或配基的類似物混合在一起，在適當的條件下檢測競爭性抑制。BASB059可以被標記，例如通過放射性或比色化合物，以便精確地確定結合到結合分子的，或轉化成產物的BASB059分子數，以便評價可能的拮抗劑的效價。
可能的拮抗劑其中包括有機小分子，肽，多肽和抗體，等等；上述抗體與本發明的多聚核苷酸和/或多肽結合，從而抑制或消除多聚核苷酸或多肽的活性或表達。可能的拮抗劑也可以是有機小分子，肽，多肽，如緊密相關蛋白，或在結合分子上結合相同位點的抗體；例如一個結合分子，它不誘導BASB059所誘導的活性，從而通過排斥BASB059多肽和/或多聚核苷酸的結合，阻止了BASB059多肽和/或多聚核苷酸的作用或表達。
可能的拮抗劑包括與多肽的結合位點結合并占據了結合位點的小分子，它阻止了細胞結合分子的結合，從而阻止了正常的生物學活性。小分子的例子包括但不限于有機小分子，肽或類似肽的分子。其它可能的拮抗劑包括反義分子(這些分子的描述參見Okano，神經化學雜志(J.Neurochem.)56560(1991)；作為基因表達的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸(OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。優選的可能拮抗劑包括涉及BASB059變體的化合物。
在一個更進一步的方面，本發明涉及基因工程改造的可溶性融合蛋白，該融合蛋白包含本發明的多肽或其片段，以及各種亞類的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE)的重鏈和輕鏈的恒定區的各個部分。優選的免疫球蛋白是人類IgG，特別是IgG1的重鏈恒定區，其中融合在鉸鏈區進行。在一個特定的實施方案中，通過引入可以被凝血因子Xa所切割的切割序列，可以簡單地將Fc部分除去。進而，本發明涉及通過基因工程制備這些融合蛋白的方法，以及它們在藥物篩選，診斷和治療上的應用。本發明的一個更進一步的方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技術的例子可以在國際專利申請號WO94/29458和WO94/22914中找到。
本文提供的各個多聚核苷酸序列可以被用于尋找和開發抗菌的化合物。它們所編碼的蛋白表達后可以被用作篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼所編碼的蛋白的氨基末端區的多聚核苷酸序列，或相應mRNA的Shine-Delgarno序列或其它有利于翻譯的序列都可以被用來構建反義序列以控制感興趣的編碼序列的表達。
本發明還提供了本發明的多肽，多聚核苷酸，激動劑或拮抗劑在干擾一種或幾種病原體與真核宿主，優選地為哺乳動物宿主，間的初始物理相互作用上的應用，上述初始物理相互作用造成了感染的結果。具體而言，本發明的上述分子可以被用于防止細菌，特別是革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌，對真核生物，優選地為哺乳動物，埋藏裝置上的或傷口的細胞外基質蛋白的粘附；阻斷真核生物，優選地為哺乳動物，的細胞外基質蛋白和介導組織損傷的細菌BASB059蛋白之間的細菌粘附，和/或；阻斷感染的疾病發生的正常進行，上述感染是由植入埋藏裝置或其它外科技術以外的原因導致的。
根據本發明的另一方面，提供了BASB059激動劑和拮抗劑，優選地為抑菌或殺菌的激動劑或拮抗劑。
本發明的激動劑或拮抗劑可以被用于，例如，防止、抑制和/或治療疾病。
在一個進一步的方面，本發明涉及本發明的多肽的擬表位(mimotopes)。擬表位是一段肽序列，它和天然肽足夠類似(序列上或結構上)，從而能被識別該天然肽的抗體所識別；或者當它與適當的載體偶聯時能引起識別天然肽的抗體。
可以通過添加、缺失或替換選定的氨基酸來設計用于特定目的的肽擬表位。因此，可以對多肽進行修飾以便于與蛋白載體偶聯。例如，對于一些化學偶聯方法而言包括一個末端半胱氨酸是合乎需要的。此外，對于與蛋白載體偶聯的肽而言，含有一個遠離肽的偶聯末端的疏水末端，以便上述肽的自由未偶聯末端保持與載體蛋白的表面相連，這可能是合乎需要的。這樣該肽段呈現的構象最接近于當它處于整體天然蛋白環境時的構象。例如，可以改變肽段使其含有N-末端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化的尾部。替代地，可以添加或替代一個或多個氨基酸的D-立體化學異構體以得到有利的衍生物，例如，以增強上述肽的穩定性。
替代地，可以通過諸如噬菌體展示技術(EP 0 552 267 B1)這樣的技術，利用自身能夠結合本發明的多肽的抗體鑒定肽擬表位。該技術產生大量的模擬天然肽段結構的肽序列，并且因此能夠結合抗-天然肽的抗體，但它們自身不一定和該天然肽具有明顯的序列同源性。疫苗本發明的另一方面涉及在個體中，特別是哺乳動物中，優選地為人類中，誘導免疫應答的方法，該方法包括用BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或變體，對個體接種，上述接種足以產生抗體和/或T細胞免疫應答以保護上述個體免受感染，特別是細菌感染，尤其特別是腦膜炎奈瑟氏球菌感染。還提供了一些方法，其中這樣的免疫應答減慢了細菌的復制。本發明的另一方面涉及在個體中誘導免疫應答的方法，該方法包括為了誘導免疫應答而往上述個體輸送直接表達BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或變體的核酸載體、序列或核酶，以便在體內直接表達BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或變體，從而例如產生抗體和/或T細胞免疫應答，包括，例如，產生細胞因子的T細胞或細胞毒性T細胞，從而保護上述個體免受疾病，不論上述疾病是否已經在上述個體中發生。施用上述基因的一個例子是將其包被在顆粒或其它東西上，從而加速其進入所期望的細胞。這樣的核酸載體可以包括DNA，RNA，核酶，修飾的核酸，DNA/RNA雜合體，DNA-蛋白復合物或RNA-蛋白復合物。本發明的一個進一步的方面涉及一種免疫組合物，當該組合物被引入到能夠被誘導免疫應答的個體，優選地為人類，時在這樣的個體中誘導針對BASB059多聚核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應答，其中上述組合物含有重組的BASB059多聚核苷酸和/或由其編碼的多肽，和/或含有編碼和表達上述BASB059多聚核苷酸，其編碼的多肽，或其它本發明的多肽的抗原的DNA和/或RNA。上述免疫應答可以被用于治療或預防用途，并且可以是抗體免疫和/或細胞免疫的形式，如CTL或CD4+T細胞引起的細胞免疫。
BASB059多肽或其片段可以與輔助蛋白或化學部分融合，上述輔助蛋白或化學部分自身可以產生也可以不產生抗體，但它們能穩定上述第一蛋白并且產生具有抗原性和/或免疫原性的，優選地具有保護特性的，融合的或修飾的蛋白。這樣融合的重組蛋白優選地進一步含有一個免疫原性的輔助蛋白，如源自嗜血流感桿菌(HaemophilusInfluenzae)的脂蛋白D，谷胱氨肽-S-轉移酶(GST)或β-糖苷酶，或任何其它相對較大的，能夠穩定該蛋白并有利于其生產和純化的輔助蛋白。此外，在對接受該蛋白的生物體的免疫系統提供一種普遍的刺激的意義上，該輔助蛋白可以作為一種佐劑。該輔助蛋白可以附接到第一蛋白的氨基或羧基一末端上。
在根據本發明的疫苗組合物中，BASB059多肽和/或多聚核苷酸、或片段、或擬表位、或其變體可以存在于一個載體中，如以上描述的活的重組載體，例如，活的細菌載體。BASB059多肽的非活載體，例如，細菌外膜囊泡或“小泡(blebs)”也是適合的。OM小泡是源自革蘭氏陰性菌兩層膜的外膜，并且有報道表明存在于許多革蘭氏陰性細菌中(Zhou，L等，1998.微生物學快報(FEMS Microbiol.Lett.)163223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。報道表明能產生水泡的細菌病原體的不完全名單還包括Bordetella pertussis(百日咳博德特氏菌)，Borrelia burgdorferi，Brucellamelitensis(馬爾他布魯氏菌)，Esherichia coli(大腸埃希氏菌)，(Brucella ovis)綿羊布魯氏菌，haemophilus Influenza(嗜血流感桿菌)，Legionella pneumophila(嗜肺軍團菌)，Neisseriagonorrhoeae(奈瑟氏淋病菌)，(Neisseria meningitidis)腦膜炎奈瑟氏球菌，Pseudomonas aeruginosa(綠色假單胞菌)和Yersiniaenterocolitica(小腸結腸炎葉爾森氏菌)。
小泡的優點是提供了天然構象的外膜蛋白，因此對于疫苗特別有用。可以對細菌進行改造，從而改變外膜上的一個或多個分子的表達，從而改善其疫苗用途。因此可以引入或上調(例如，通過改變啟動子)外膜上合乎需要的免疫原性蛋白例如BASB059多肽的表達。替代地或另加地，可以下調不相關的(例如非保護性的抗原或免疫顯性的但卻可變的蛋白)或有害的(例如毒性分子如LPS，或自體免疫應答的可能的誘導劑)外膜分子的表達。這些方法將在下文詳細描述。
BASB059基因的非編碼側翼區域含有對該基因的表達很重要的調控元件。這種調控同時在轉錄水平上和翻譯水平進行。可以通過DNA測序獲得處于該基因的開放閱讀框的上游或下游的這些區域的序列。這些序列信息允許人們確定可能的調節基序，如不同的啟動子元件，終止序列，可誘導序列元件，阻抑物，負責期變異(phasevariable)的元件，Shine-Dalgarno序列，可能具有參與調節的二級結構的序列，以及其它類型的調節基序或序列。這些序列是本發明的進一步的方面。
這些序列信息允許人們對BASB059基因天然表達調控。可以通過改變啟動子，Shine-Dalgarno序列，可能的阻抑物或操縱子元件，或任何其它相關的元件來完成對基因表達的上調。類似地，可以通過類似的改變達到對表達的下調。替代地，通過對相變異序列的改變可以將該基因的表達處于位相變異的控制之下，或者可以將其表達與相變異的控制解偶聯。在另一種方法中，可以將該基因置于一個或多個允許對表達進行調控的可誘導元件的控制之下。這樣的調控的例子包括，但不限于，溫度改變，添加誘導底物如選定的碳水化合物或它們的衍生物，痕量元素，維生素，輔因子，金屬離子等的誘導。
可以通過幾種不同的方法引入上文所描述的改造。可以通過隨機誘變，然后篩選所需要的表型，從而在體內對涉及基因表達的序列進行改造。另一種方法包括分離感興趣的區域，然后通過隨機誘變或定點置換，插入或缺失突變進行改造。然后通過同源重組，改造后的區域被重新引入到細菌基因組中，接著測定對基因表達的影響。在另一種方法中，可以利用感興趣的區域的序列知識來置換或缺失部分或所有的天然調節序列。在這種情況下，分離目的調節區域并進行改造，使其含有另一基因的調控元件，含有來自不同基因的調控元件的組合，含有合成的調控區域或含有任何其它調控區域，或者使野生型調控序列的選定部分被缺失。然后通過同源重組，這些改造后的序列可以被重新引入到細菌的基因組。可用于基因表達的上調的優選啟動子的不完全清單包括源自腦膜炎奈瑟氏球菌或奈瑟氏淋病菌的啟動子porA，proB，lbpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；ompCD，copB，lbpB，ompE，UspA1；UspA2；源自M.catarrhalis的TbpB；源自嗜血流感桿菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一個實施例中，可以通過將基因的啟動子換為較強的啟動子(通過分離該基因的上游序列，體外改造該序列，并通過同源重組重新引入到基因組中)而調控基因的表達。可以在細菌和細菌釋放(或產生)的外膜小泡中實現上調表達。
在其它實施例中，所描述的方法可以用于產生重組細菌菌株，在上述重組菌株中用于疫苗用途的特性得到了改善。上述菌株可以是但不限于，弱化的菌株，所選擇的抗原的表達增強的菌株，干擾免疫應答的基因被敲除(或表達降低)的菌株，免疫顯性蛋白的表達受調節的菌株，外膜小泡的釋放受調節的菌株。
因此，本發明也提供了BASB059基因的改造后的上游區域，該改造后的上游區域含有異源調控元件，該異源調控元件改變位于外膜的BASB059蛋白的表達水平。根據本發明的這個方面的上游區域包括BASB059基因的上游序列。上述上游區域緊接著BASB059基因的上游開始，并且從起始密碼子ATG算起，其延伸的位置通常不超過該基因上游大約1000bp。當基因位于多順反子序列(操縱子)時，上游區域可以直接開始于感興趣基因之前，或開始于操縱子中第一個基因之前。根據本發明的這個方面，優選地，改造的上游區域包含一個位于ATG上游500bp到700bp位之間的異源啟動子。
因此，本發明在改造的細菌小泡中提供了BASB059多肽。本發明進一步提供了改造的宿主細胞，該宿主細胞產生無生命的基于膜的小泡載體。本發明進一步提供了含有BASB059基因的核酸載體，該BASB059基因具有改造的含有異源調控元件的上游區域。
本發明進一步提供了根據本發明的宿主細胞和細菌小泡的制備方法。
本發明也提供了組合物，尤其是疫苗組合物，和方法，上述組合物和方法含有本發明的多肽和/或多聚核苷酸，以及免疫刺激的DNA序列，例如在Sato，Y.等Science 273352(1996)中所描述的序列。
本發明也提供了將所描述的多聚核苷酸或其特定的片段應用于多聚核苷酸構建體的方法，上述多聚核苷酸構建體用于在感染腦膜炎奈瑟氏球菌的動物模型中進行基因免疫實驗，上述多聚核苷酸或其特定的片段編碼細菌細胞表面蛋白的非-可變區域。這樣的實驗在鑒定可能引起預防或治療免疫應答的蛋白表位上特別有用。有人認為上述方法為隨后的特定用途的單克隆抗體的制備作了準備，該單克隆抗體源自成功地抵抗或清除感染的動物的必要器官，該單克隆抗體用于開發哺乳動物細菌感染的預防制劑或治療方法，上述細菌感染尤其指腦膜炎奈瑟氏球菌感染，上述哺乳動物尤其指人類。
本發明也包括一種疫苗制劑，它包含本發明的免疫原性的重組多肽和/或多聚核苷酸和合適的載體，例如藥用上可接受的載體。因為多肽和多聚核苷酸在胃中可以被分解，因此優選地，它們通過非腸道途徑施用，包括，例如，皮下的、肌肉內的、靜脈內的或皮內的施用途徑。適用于非腸道施用的制劑包括水溶性的和非水溶性的無菌注射溶液，它們可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌化合物和使該制劑與個體的體液，優選地為血液，等滲的溶劑；還包括水懸浮的和非水懸浮的懸浮液，它們可以含有懸浮制劑或稠化劑。該制劑可以在單一劑量或多劑量的容器中提供，例如在密閉的安瓿和小瓶中，并且在凍干的條件下儲存，只需要在使用之前加入無菌的液體載體。
本發明的疫苗制劑還可以包括佐劑系統以增強該制劑的免疫原性。優選地，該佐劑系統優先引起TH1型的免疫應答。
免疫應答可以被大致區分為兩中極端的類型，體液或細胞介導的免疫應答(經典特征分別為受體和細胞效應器保護機制)。這些應答在分類學上分別被稱為TH1型應答(細胞介導的應答)和TH2型免疫應答(體液應答)。
極端的TH1型免疫應答的特征為產生抗原特異的、單元型限制的細胞毒性T淋巴細胞和天然殺傷細胞應答。在小鼠中TH1型應答的特征經常為IgG2a亞型的抗體的產生，而在人類中這些相應于IgG1型抗體。TH2型免疫應答的特征為產生許多同種型的免疫球蛋白，在小鼠中包括IgG1，IgA和IgM。
有人認為產生這兩種免疫應答背后的驅動力是細胞因子。高水平的TH1型細胞因子傾向于誘導針對既定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的TH2型細胞因子傾向于誘導針對既定抗原的體液免疫應答。
TH1和TH2型免疫應答的區分不是絕對的。事實上，在一個個體中維持的免疫應答被描述為主要TH1型或主要TH2型。但是，按照Mosmann和Coffman在鼠類CD4+veT細胞克隆的描述來考慮細胞因子家族經常是便利的(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細胞導致不同功能特性的淋巴因子分泌的不同模式。免疫學年鑒(TH1 and TH2 cellsdifferent patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties.AnnualReview of Immunology)，7，p145-173)。通常來說，TH1型的應答是與T淋巴細胞產生的INF-γ和IL-2細胞因子的產生相關的。其它與TH1型免疫應答的誘導直接相關的細胞因子，如IL-12，不是由T細胞產生的。相反，TH2型的應答是與IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相關的。
已知某些疫苗的佐劑特別適于刺激TH1或TH2型的細胞因子應答。疫苗接種后或感染后，通常免疫應答TH1∶TH2平衡的最好指示包括在用抗原重復刺激后，直接測量T淋巴細胞在體外產生的TH1或TH2細胞因子；和/或測量對抗原特異的抗體應答的IgG1∶IgG2a比率。
因此TH1型的佐劑為用抗原體外重復刺激時，優先刺激分離的T細胞群產生高水平的TH1型細胞因子，并促進CD8+細胞毒性T淋巴細胞和與TH1型同種型相關的抗原特異性免疫球蛋白的發生的佐劑。
能夠優先刺激TH1型細胞應答的佐劑在國際專利申請WO 94/00153和WO95/17209中有所描述。
3脫-O-酰基單磷酰基脂A(3De-O-acylated monophosphoryllipid A，3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這是從GB2220211(Ribi)中得知的。化學上它是具有4，5或6酰基鏈的3脫-O-酰基單磷酰基脂A的混合物，由Montana的Ribi Immunochem公司制造。優選的3脫-O-酰基單磷酰基脂A形式在歐洲專利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開。
優選地，3D-MPL的顆粒小得足以通過0.22微米的膜(歐洲專利0 689 454)。每劑量提供的3D-MPL在10μg-100μg之間，優選地在25-50μg之間，其中提供的抗原的通常在2-50μg每劑量。
另一種優選的佐劑包括QS21，它是一種源自Quilla.ja SaponariaMolina的樹皮的，經HPLC純化的無毒成分。這種佐劑可以任選地與一種載體一起，任選地與3脫-O-酰基單磷酰基脂A(3D-MPL)混合。
生產QS21的方法在美國專利第5,057,540中有所描述。
含有QS21的非反應原性制劑先前已有描述(WO 96/33739)。當與抗原配制在一起時，這樣的含有QS21和膽固醇的制劑已經被表明是成功的TH1刺激佐劑。
可能是TH1細胞應答的刺激因子的其它佐劑包括免疫調節的寡聚核苷酸，例如WO96/02555中所公開的未甲基化的CpG序列。
不同的TH1刺激佐劑，如上文所描述的那些佐劑，的組合物也被認為是提供了一種作為TH1細胞應答優先刺激物的佐劑。例如，QS21可以和3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比率通常在1∶10到10∶1之間，優選地在1∶5到5∶1之間，并且經常基本上是1∶1。3D-MPL∶QS21的最佳協同效應的優選范圍是2.5∶1到1∶1。
優選地，在根據本發明的疫苗組合物中還存在一種載體。上述載體可以是水包油乳劑或鋁鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁。
優選的水包油乳劑含有可代謝的油，如鯊烯，α生育酚和吐溫80。在一個特別優選的方面，根據本發明的疫苗組合物中的抗原和QS21與3D-MPL在這樣的乳劑中混合在一起。此外，上述水包油乳劑可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酰甘油酯。
通常對于人類施用而言，疫苗中存在的QS21和3D-MPL在1μg-200μg每劑量的范圍內，例如在10-100μg，優選地在10μg-50μg。通常水包油乳劑含有2到10％的鯊烯，從2到10％的α-生育酚和從0.3到3％的吐溫80。優選地，鯊烯α生育酚的比率等于或小于1，因為這樣的乳劑更為穩定。Span85也可以在1％的水平存在。在一些情況下本發明的疫苗進一步含有穩定劑是有利的。
無毒的水包油乳劑優選地在水性載體中含有無毒的油，例如鯊烷或鯊烯，乳化劑，例如吐溫80。上述水性載體可以是，例如，磷酸鹽緩沖液。
一種在水包油乳劑中含有QS21、3D-MPL和生育酚的特別強的佐劑制劑在WO 95/17210中有所描述。
本發明還提供了多價的疫苗組合物，它含有本發明的疫苗制劑以及其它抗原，特別是可用于治療癌癥、自身免疫疾病和相關病情的抗原。這樣的多價疫苗組合物可以包括本文先前描述的TH1誘導佐劑。
雖然本發明的描述是關于某些BASB059多肽和多聚核苷酸，但是應當理解本發明覆蓋了天然存在的多肽和多聚核苷酸的片段，以及進行了添加、缺失或替代而重組多肽或多聚核苷酸的免疫原性性質基本上不受影響的類似多肽和多聚核苷酸。
抗原可以以全細菌(活的或死的)的形式，或者以亞細胞組分的形式輸送，這可能包括奈瑟氏腦膜炎球菌自身。組合物、試劑盒和施用在本發明的一個進一步的方面提供了一種用于對細胞或多細胞生物施用的組合物，該組合物含有BASB059多聚核苷酸和/或BASB059多肽。
本發明還涉及含有本文討論的多聚核苷酸和/或多肽或它們的激動劑或拮抗劑的組合物。本發明的多肽和多聚核苷酸可以和非無菌的或無菌的載體，或者用于細胞、組織或生物體的載體，如適用于對個體施用的載體，一起組成組合物。這樣的組合物含有，例如，介質添加劑(media additive)或治療上有效量的本發明的多肽和/或多聚核苷酸，以及藥用上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體可以包括，但不限于，鹽溶液、緩沖鹽溶液、右旋糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它們的組合。制劑應該與施用的形式相符。本發明進而涉及診斷用的或藥用的包和試劑盒，它們含有一個或多個容器，裝有一種或多種上文所述的本發明的組合物的成分。
本發明的多肽、多聚核苷酸和其它化合物可以單獨使用或者與其它化合物，如治療用的化合物，聯合使用。
藥用組合物可以以任何有效的、方便的方式施用，包括，例如，通過局部施用、口服施用、肛門施用、陰道施用、靜脈內施用、腹膜內施用、肌肉內施用、皮下施用、鼻腔內施用或皮內施用等等途徑。
在治療或預防中，上述活性制劑可以作為可注射的組合物對個體施用，例如，作為無菌的水分散物(aqueous dispersion)，它優選地為等滲的。
在一個進一步的方面，本發明提供的藥用組合物含有治療上有效量的多肽和/或多聚核苷酸，如可溶形式的本發明的多肽和/或多聚核苷酸，激活或拮抗的肽或小分子化合物，以及藥用上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于，鹽溶液、緩沖鹽溶液、右旋糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它們的組合。本發明進而涉及藥用的包和試劑盒，它們含有一個或多個容器，裝有一種或多種上文所述的本發明的組合物的成分。本發明的多肽、多聚核苷酸和其它化合物可以單獨使用或者與其它化合物，如治療用的化合物，聯合使用。
組合物應該和施用途徑相適應，施用途徑如通過全身施用途徑或口服途徑。優選形式的全身施用途徑包括注射，通常通過靜脈內注射。可以使用其它注射途徑，如皮下的、肌肉內的或腹膜內的途徑。全身施用的替代方法包括滲透劑，如利用膽汁鹽或梭鏈孢酸或其它去污劑進行跨粘膜施用或經皮施用。并且，如果本發明的多肽或其它化合物能被配制成腸溶性的或裝入膠囊的制劑，則口服施用也是可能的。這些化合物的施用也可以是局部的(topical)和/或定位的(localized)，其形式為藥膏、糊膏劑、凝膠、溶液、粉末等等。
對于哺乳動物，尤其是人類，的施用而言，預計活性物質的每日劑量在0.01mg/kg到10mg/kg之間，通常在大約1mg/kg。在任何情況下醫生將決定對于個體最適合的實際劑量，實際劑量將根據年齡、體重和特定個體的反應而有所不同。以上劑量是對通常情況的示例。當然，在個別情況下更高或更低的劑量范圍是有利的，這也在本發明的范圍之內。
所需要的劑量范圍依賴于所選擇的肽、施用途徑、制劑的特性、對象病情的特性和參與的執業醫生的判斷。但是，適當的劑量在0.1-100μg每千克對象體重。
疫苗組合物可以方便地為可注射形式。可以利用常規的佐劑來增強免疫應答。疫苗的適當的單位劑量為0.5-5μg抗原/kg，這樣的劑量優選地施用1-3次，每次的間隔為1-3星期。在以上給出的劑量范圍內不會觀察到本發明的化合物的有害的毒性作用，上述有害的毒性作用如果存在的話可能會妨礙它們對適當個體的施用。
考慮到存在許多化合物，并且各種施用途徑的效率不同，應當預期所需要的劑量有很大的變化。例如，預期口服施用所需要的劑量比靜脈內施用所需要的劑量大。可以利用常規的經驗程序對這些劑量水平的變化進行調整，這在本領域中是眾所周知的。序列數據庫、有形介質中的序列和算法多聚核苷酸和多肽序列形成重要的信息資源，該信息資源可用來確定多聚核苷酸和多肽序列的2維或3維結構以及進一步鑒定其它的類似同源性的序列。通過以下手段很容易將以上方法簡化將上述序列儲存在計算機可讀的介質中，然后將存儲的數據應用于已知的大分子結構程序，或通過眾所周知的搜索工具，例如GCG程序包，利用上述存儲的數據搜索序列數據庫。
本發明還提供了特征序列或鏈，尤其是基因序列或編碼的蛋白序列，的分析方法。優選的序列分析方法包括，例如，序列同源性分析方法，如同一性和相似性分析，DNA，RNA和蛋白結構分析，序列組裝，進化枝的分析，序列基序分析，開放閱讀框的確定，核酸堿基呼叫(nucleic acid base calling)，密碼子使用頻率分析，核酸堿基修剪(nucleic acid base trimming)和測序色譜峰分析。
提供了基于計算機的方法以進行同源性鑒定。該方法包括以下步驟在計算機可讀的介質中提供含有本發明的多聚核苷酸序列的第一多聚核苷酸序列；將上述第一多聚核苷酸序列和至少一個第二多聚核苷酸序列或多肽序列比較以鑒定同源性。
提供了基于計算機的方法以進行同源性鑒定，所述方法包括以下步驟在計算機可讀介質中提供會有本發明的多肽序列的第一多肽序列；將上述第一多肽序列和至少一個第二多聚核苷酸或多肽序列比較以鑒定同源性。
在本說明書里應用的所有的出版物和參考文獻，包括但不限于專利和專利申請，都在此全文引入作為參考，就象每一個單獨的出版物或參考文獻都被特地和單獨地被注明在此引入作為參考那樣。任何本申請要求優先權的專利申請也以上文描述的出版物和參考文獻的方式在此全文引入作為參考。定義“同一性”，如本領域中所知的那樣是指，根據具體情況，兩個或多個多肽序列或兩個或多個多聚核苷酸序列之間的關系，這是通過序列的比較而確定的。在本領域中，“同一性”還表示多肽或多聚核苷酸序列之間的序列相關性的程序，這是通過這樣的序列的鏈之間的匹配來確定的。很容易通過已知的方法來計算“同一性”，包括但不限于那些在以下文獻中所描述的方法計算機分子生物學(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.，編著，牛津大學出版社，1988；生物計算機學信息學和基因組主題(BiocomputingInformatics and Genome Projects)，Smith，D.W.，編著，科學出版社，紐約，1993；序列數據的計算機分析，第I部分(Computer Analysis of Sequence Data，Part，I)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編著，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis In MolecularBiology)，von Heine，G.，Academic Press，1987；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。確定同源性的方法的設計使得被測試的序列之間最好地匹配。進而，確定同一性的方法被編寫成了向公眾開放的計算機程序。確定兩個序列之間的同一性的計算機程序方法包括，但不限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Nucleic Acid Research)12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.等，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)215403-410(1990))，和FASTA(Pearson和Lipman美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85；2444-2448(1988))。BLAST家族的程序在NCBI和其它來源上向公眾開放(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLMNIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)215403-410(1990))。眾所周知的Smith Waterman算法也可以被用來確定同一性。
多肽序列比較的參數包括如下算法Needleman和Wunsch，分子生物學雜志(J.Mol Biol.)48443-453(1970)比較矩陣(comparison matrix)來自Henikoff和Henikoff，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)8910915-10919(1992)的BLOSSUM62間隔補償(Gap penalty)8間隔長度補償(Gap length penalty)2可以使用這些參數的程序為Genetics Computer Group，Madison WI的向公眾開放的“Gap”程序。以上描述的參數是肽段比較的默認參數(同時對末端間隔沒有補償)。
多聚核苷酸序列比較的參數包括如下算法Needleman和Wunsch，分子生物學雜志(J.Mol Biol.)48443-453(1970)比較矩陣(comparison matrix)匹配＝+10，不匹配＝0間隔補償(Gap penalty)50間隔長度補償(Gap length penalty)3可以從Genetics Computer Group，Madison WI的“Gap”程序得到。這些為核酸比較的默認參數。
多聚核苷酸和多肽的“同一性”的優選的含義，根據具體情況，分別在下文的(1)和(2)中給出(1)多聚核苷酸實施方案進一步提供了一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO1中的參照序列至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的同一性，其中所述的多聚核苷酸序列可以和SEQ ID NO1中的參照序列完全相同，或者和參照序列相比具有某些整數的核苷酸變化，其中所述的變化可以選自至少一個核苷酸被缺失，替代，包括轉換和顛換，或插入，其中所述的變化可以在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置或在這兩個末端位置之間的任何位置發生，或者獨立地分布于參照序列的核苷酸之間，或者在參照序列中以一個或多個鄰近的組分布，其中所述的變化的核苷酸數是這樣確定的將SEQ ID NO1中的總核苷酸數乘以定義了同一性百分比的整數，除以100，然后將得數從以上所述的SEQ ID NO1中的總核苷酸數中減去，或nn≤xn-(xn·y)，其中nn是核苷酸變化數，xn是SEQ ID NO1中的總核苷酸數，y對于50％是0.50，對于60％是0.60，對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，對于90％是0.90，對于95％是0.95，對于97％是0.97，對于100％是1.00，·是乘號的標志，在從xn中減去之前，xn和y的任何非整數得數被下舍入(rounded down to)為最接近的整數。編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸序列的變化可能在該編碼序列中產生無義的，錯義的或讀碼框移動的突變，從而在變化后改變由該多聚核苷酸編碼的多肽。
作為例子，本發明的多聚核苷酸序列可以與SEQ ID NO1中的參照序列相同，也就是說可以是100％相同，或者與上述參照序列相比可以含有某些整數的核苷酸變化，以便其同一性百分比小于100％同一性。這樣的變化選自至少一個核苷酸被缺失，替代，包括轉換和顛換，或插入，其中所述的變化可以在參照核苷酸序列的5’或3’末端位置或在這兩個末端位置之間的任何位置發生，或者獨立地分布于參照序列的核苷酸之間，或者在參照序列中以一個或多個鄰近的組分布。對于給定的同一性百分比，其變化的核苷酸數是這樣確定的將SEQ ID NO1中的總核苷酸數乘以定義了同一性百分比的整數，除以100，然后將得數從以上所述的SEQ ID NO1中的總核苷酸數中減去，或nn≤xn-(xn·y)，其中nn是核苷酸變化數，xn是SEQ ID NO1中的總核苷酸數，v是，例如對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，等等，·是乘號的標志，其中xn和y的任何非整數得數在從xn中減去之前被下舍入(rounded down to)為最接近的整數。
(2)多肽實施方案進一步包括分離的多肽，該多肽含有的多肽和SEQ ID NO2的多肽參照序列至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的同一性，其中所述的多肽序列可以和SEQ ID NO2中的參照序列相同，或者和參照序列相比具有某些整數的氨基酸變化，其中所述的變化可以選自至少一個氨基酸被缺失，替代，包括保守的替代和非保守的替代，或插入，其中所述的變化可以在參照多肽序列的氨基或羧基末端位置或在這兩個末端位置之間的任何位置發生，或者獨立地分布于參照序列的的氨基酸之間，或者在參照序列中以一個或多個鄰近的組分布，其中所述的變化的氨基酸數是這樣確定的將SEQ ID NO2中的總氨基酸數乘以定義了同一性百分比的整數，除以100，然后將得數從以上所述的SEQ ID NO2中的總氨基酸數中減去，或na≤xa-(xa·y)，其中na是氨基酸變化數，xa是SEQ ID NO2中的總氨基酸數，y對于50％是0.50，對于60％是0.60，對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，對于90％是0.90，對于95％是0.95，對于97％是0.97，對于100％是1.00，·是乘號的標志，在從xa中減去之前，xa和y的任何非整數得數被下舍入(rounded down to)為最接近的整數。
作為例子，本發明的多肽序列可以與SEQ ID NO2中的參照序列相同，也就是說可以是100％相同，或者與上述參照序列相比可以含有某些整數的氨基酸變化，以便其同一性百分比小于100％同一性，這樣的變化可以選自至少一個氨基酸被缺失，替代，包括保守的替代和非保守的替代，或插入，其中所述的變化可以在參照多肽序列的氨基或羧基末端位置或在這兩個末端位置之間的任何位置發生，或者獨立地分布于參照序列的的氨基酸之間，或者在參照序列中以一個或多個鄰近的組分布。對于給定同一性百分比，所述的變化的氨基酸數是這樣確定的將SEQ ID NO2中的總氨基酸數乘以定義了同一性百分比的整數，除以100，然后將得數從以上所述的SEQ ID NO2中的總氨基酸數中減去，或na≤xa-(xa·y)，其中na是氨基酸變化數，xa是SEQ ID NO2中的總氨基酸數，y是，例如對于70％是0.70，對于80％是0.80，對于85％是0.85，等等，·是乘號的標志，其中xn和y的任何非整數得數在從xn中減去之前被下舍入(rounded down to)為最接近的整數。
在本文中，當“個體”是關于生物體時它的意思為多細胞真核生物，包括，但不限于，后生動物，哺乳動物，Ovid，牛科動物，猿猴，靈長類和人類。
“分離的”的意思為“通過人的手”從其天然狀態被改變，也就是說，如果它天然存在，它被人從其初始環境移開或改變，或同時被移開并改變。例如，天然存在于活的生物體中的多聚核苷酸或多肽不是“分離的”，但是同一多肽或多聚核苷酸被從其天然狀態共存的物質分開時，它們就是“分離的”，如該術語在本文中所使用的意思。并且，被通過轉化、基因操作或通過任何其它重組方法被導入到生物體的多肽或多聚核苷酸是分離的，即使它仍然存在于上述生物體中，該生物體可以是活的或無生命的。
“多聚核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區域。
“變體”指和參照多聚核苷酸或多肽不同，但保留了本質特征的多聚核苷酸或多肽。一個多聚核苷酸的典型的變體和參照多聚核苷酸在核苷酸序列上不同。該變體的核苷酸序列的改變可能改變也可能不改變參照多聚核苷酸所編碼的多肽的氨基酸序列。如下文所討論，核苷酸的改變可能導致參照多聚核苷酸所編碼的多肽發生氨基酸的替代、添加、缺失、融合和截短。一個多肽的典型的變體和參照多肽在氨基酸序列上不同。通常，不同之處是有限的，以便參照多肽和變體的序列整體上非常相似，并且，在許多區域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上的差別可以是一個或多個氨基酸以任何組合形式的替代，添加，缺失。替代的或插入的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的。多聚核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，例如等位基因變體，或不是已知的天然存在的變體。多聚核苷酸和多肽的非天然存在的變體可以通過誘變技術或通過直接合成產生。
“疾病”的意思為任何由細菌感染引起或與細菌感染相關的疾病，包括，例如，上呼吸道感染，侵入性細菌疾病，如菌血癥和腦膜炎。
通過基于全細胞的PCR分析以確認轉化物含有BASB059DNA插入序列。將～1.0ml過夜培養的LB Kn肉湯培養基轉移到1.5ml的聚丙烯管中，用Beckman微量離心機(～3分鐘，室溫，～12,000×g)收集細胞。用～200μl無菌水懸浮細胞沉淀，將～10μl的一小份用于進行終體積～50μl的，同時含有BASB059正向和反向擴增引物的PCR反應。PCR反應組分的最終濃度基本上和實施例2中標明的相同，但是使用的Taq聚合酶為～5.0個單位。第一步95℃變性步驟被延伸到3分鐘以確保破壞細菌細胞并釋放質粒DNA。為了從溶解的轉化物細胞樣品中擴增BASB059PCR片段，用ABI Model 9700熱循環儀，32個循環，三步熱擴增模式，即，95℃，45秒；55-58℃，45秒；72℃，1分鐘進行擴增。在熱擴增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％的瓊脂糖在Tris-醋酸鹽-EDTA(TAE)緩沖溶液中)對上述反應體系的約20μl的小份進行分析。在凝膠電泳和溴乙錠染色后用UV照射顯示DNA片段。將DNA分子量標準(1Kb的階梯(Ladder)，Life Technologies)與待測樣品同時電泳以估計PCR產物的分子量大小。產生預期的PCR產物的轉化物被鑒定為含有BASB059表達構建體的菌株。然后分析含有表達質粒的菌株是否能進行BASB059的可誘導表達。CPCR-陽性轉化物的表達分析對于以上鑒定的每個PCR陽性轉化物，用斑點平板的細胞接種含有氨芐青霉素(～100μg/ml)～5.0ml的LB肉湯，并在37℃搖床培養(～250rpm)過夜。用一小份(～1.0ml)過夜種菌培養物接種到含有～25ml LB Kn肉湯的125ml錐形瓶中并在37℃搖床培養(～250rpm)，直到培養物的渾濁度達到O.D.600為～0.5，即對數生長中期(通常為大約1.5-2.0小時)。這時將大約一半培養物(～12.5ml)轉移到第二個125ml的錐形瓶中并且加入終濃度1.0mM(用無菌水制備的1.0M的儲存液，Sigma)的IPTG以誘導重組BASB059蛋白的表達。將IPTG誘導的和未誘導的培養物繼續37℃搖床培養～4小時。誘導期后將誘導的和未誘導的培養物的樣品(～1.0ml)取出，并通過微量離心管室溫離心～3分鐘收集細胞。將每種細胞沉淀用～50μl無菌水懸浮，然后與含有2-巰基乙醇的2×Laemmli SDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，沸水浴～3分鐘以使蛋白變性。將體積相等的(～15μl)IPTG誘導的和未誘導的細胞粗裂解液上樣到相同的兩塊12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的小凝膠，Novex)。誘導的和未誘導的裂解樣品和預染色的分子量標準(SeeBlue，Novex)在常規條件下用常規的SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)一起電泳。電泳后，一塊膠用考馬斯亮藍R250(BioRad)染色，然后脫色以顯示新的BASB059可誘導蛋白。利用BioRad的Mini-Protean II印跡裝置和Towbin’s甲醇(20％)轉移緩沖液4℃～2小時，第二塊膠被電印跡到PVDF膜上(0.45微米孔徑，Novex)。根據本領域中已知的方法進行膜的封閉和抗體溫育。先用單克隆的抗(His)5抗體，然后用交聯了HRP的兔抗鼠二抗(QiaGen)確認BASB059重組蛋白的表達和身分。用ABT不溶底物或使用Hyperfilm以及Amersham ECL化學發光系統顯示抗-His抗體的反應模式。實施例3重組BASB059的生產細菌菌株含有pET24b質粒的大腸桿菌BL21DE3重組表達菌株被用來生產大量細胞，以用于重組蛋白的純化，上述pET24b質粒編碼源自腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB059。表達菌株在含有100μg/ml卡那霉素(″Kn″)的LB瓊脂平板上培養以保證質粒的保持。為了在-80℃冷凍保存，將菌株在含有相同濃度的抗生素的LB肉湯中增殖，然后與等體積的含有30％μg甘油LB肉湯混合。培養基用于生產重組蛋白的發酵培養基由含有100μg/ml Kn的2×YT肉湯培養基(Difco)組成。在發酵罐的培養基中加入0.25ml/L的抗泡沫劑(Antifoam 204，Sigma)。為了誘導BASB059重組蛋白的表達，往發酵罐中加入IPTG(異丙基β-D硫代吡喃型半乳糖苷)(終濃度1mM)發酵往含有50ml工作體積的一個500ml菌種錐形瓶中接種0.3ml融化后的冷凍培養物，或接種幾個來自選擇性瓊脂平板培養物的菌落，然后在37±1℃的150rpm的搖床平臺(Innova 2100，New BrunswickScientific)上溫育Kn約12小時。然后該菌種培養物被用來接種5L工作體積的，內含有Kn抗生素的2×YT肉湯培養基的發酵罐。該發酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)在37±1℃，0.2-0.4VVM空氣噴射，Rushon葉輪250rpm的條件下工作。在錐形瓶菌種培養物中或發酵罐中都不控制pH值。在發酵過程中，發酵罐內的pH值在6.5到7.3的范圍內。當培養物達到對數生長中期時(~0.7O.D.600單位)往發酵罐中加入IPTG(1.0M儲存液，無菌水配制)。細胞被誘導2-4個小時，然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(Sorvall Instruments)離心收集細胞。細胞糊狀物儲存于-20℃，直至進一步處理。純化咪唑和生物技術級或更好的試劑都購自Ameresco Chemical，Solon，Ohio。Triton X-100(t-辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇)，Triton X-114，磷酸鈉，一元堿和尿素為試劑級或更好的，并購自Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri。Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(1×PBS)購自Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(10×PBS)購自BioWhittaker，Walkersville，Maryland。無BSA的五-His抗體購自QiaGen，Valencia，California。過氧化物酶標記的Affini Pure羊抗鼠IgG購自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。所有的其它化學試劑都是試劑級的或更好的。
螯合Ni的Sepharose Fast Flow樹脂購自Pharmacia，Sweden。預灌制的Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝膠，所有的電泳緩沖液和溶液，SeeBlue預染色分子量標準，MultMark多色標準和PVDF轉移膜都購自Novex，San Diego，California。SDS-PAGE銀染試劑盒購自Daiichi Pure Chemicals Company Limited，Tokyo，Jknan。考馬斯染色溶液購自BioRad Laboratories，Hercules，California。ArcrodicPF 0.2m注射濾器購自Pall GelmanSciences，Ann Arbor，Michigan.GD/X25mm一次性注射濾器購自Whatman Inc.，Clifton，New Jersey。截留分子量8,000的透析管購自BioDesign Inc.，Od New York，Carmal New York。BCA蛋白檢測試劑和蛇皮透析管，截留分子量3,500，購自Pierce ChemicalCo.，Rockford，Illinois。提取方法細胞糊狀物在室溫融解30到60分鐘。將細胞糊狀物破碎后，上清用1.0％的Triton X114分配，將這個級分通過螯合Ni的SepharoseFast Flow樹脂，上述樹脂預先用含10％甘油和0.005％Triton X100的PBS(pH＝7.5)平衡。用含有200mM咪唑的同一緩沖液洗脫蛋白。將含有洗脫物質的級分用4體積的含2mM EDTA，10mM氯化鈉和0.005％Triton X 100的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)稀釋后通過DEAE-Sepharose FF樹脂。收集流出部分并用截留分子量3KDa的攪拌池濃縮，然后對含0.1％Trion X100的PBS(pH 7.4)透析。最終制劑通過對0.1％Triton X-100和1×PBS，pH 7.4，透析過夜，中間換3次透析液，配制BASB059。對純化的蛋白進行特征鑒定，并用來產生抗體，如下文所述。SDS-PAGE的結果(

圖1A)表明大約10KDa的一條蛋白帶被純化到純度大于90％，并且能夠通過Western印跡與抗His抗體反應(圖1B)。生物化學特征SDS-PAGE和Western印跡分析純化的重組蛋白在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上解析后100V1小時電泳轉移到PVDF膜上，如先前所描述(Thebaine等，1979，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)764350-4354)。然后將PVDF膜用含有5％脫脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液預處理。所有的以下溫育都是在該預處理緩沖液里進行的。
PVDF膜與抗His尾部抗體的稀釋液在室溫溫育1小時。然后將PVDF膜用洗滌緩沖液(含有150mM氯化鈉和0.05％Tween-20的20mMTris緩沖液，pH 7.5)洗滌兩次。將PVDF膜與25ml 1∶5000稀釋的過氧化物酶標記的物種特異的交聯物室溫溫育30min。然后用洗滌緩沖液將PVDF膜洗滌4次，并用Zymed(SanFrancisco，CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和尿素過氧化物分別顯色10分鐘。實施例4用重組BASB059免疫小鼠在0，14，28天向Balb/C小鼠三次注射在大腸桿菌中表達的，部分純化的重組BASB059蛋白(10只動物/組)。通過皮下途徑向動物注射兩種不同配方形式的約5μg抗原或者吸附在100μg AlPO4上或者和SBAS2乳劑一起配制(每劑量含有5μg MPL和5μgQS21的SB62乳劑)。在實驗中還添加了陰性對照組，陰性對照組由僅用SBAS2乳劑進行免疫的小鼠組成。小鼠在第28天(第二次注射后14天)和第35天(第三次注射后7天)被放血以檢測抗BASB059的特異性抗體。通過ELISA測量從AlPO4和SBAS2收集得到的血清(得自10只小鼠/組)中的特異性抗BASB059抗體(分別檢測)，同時對從兩種配方收集得到血清進行Western印跡分析(血清被混合在一起)。只利用第三次注射后的血清。圖2中出示的結果清楚地表明，ELISA實驗說明在兩種配方中都有特異性的BASB059抗體應答，而沒有檢測到抗大腸桿菌抗體或抗大腸桿菌抗體很低。源自逐漸康復的病人的血清中存在抗BASB059抗體在這個實驗中通過Western印跡法檢測了幾個逐漸康復病人的血清對純化的BASB059重組蛋白的識別。簡言之，將6μg部分純化的BASB059腦膜炎奈瑟氏球菌B蛋白在SDS-PAGE梯度凝膠(4-20％，Novex，編號n°EC6029)上進行電泳遷移。利用BioRad Trans-blot系統(編號n°170-3930)100伏1∶30小時將蛋白轉移到硝酸纖維素片(0.45μm，BioRad編號n°162-0114)上。然后，在與人血清溫育之前將濾膜用PBS-0.05％吐溫20室溫封閉過夜。檢測了如下逐漸康復病人的血清病人#262068，261732，262117，261659，261469，261979和261324。用PBS-0.05％吐溫20將這些血清稀釋100倍，利用mini-blotter系統(Miniprotean，BioRad編號n°170-4017)與硝酸纖維素片室溫溫育2小時，同時輕柔地搖晃。用PBS-0.05％吐溫20重復洗滌3次，每次5分鐘后，將硝酸纖維素片與用同一洗滌緩沖液1/500稀釋的適當交聯物(生物素化的抗人Ig抗體，源自綿羊，Amersham編號n°RPN1003)在輕柔搖晃的條件下室溫溫育1小時。如前一步，洗滌三次后，將膜與用洗滌緩沖液1/1000稀釋的鏈親和素-過氧化物酶復合物(Amersham編號n°1051)在攪拌的條件下溫育30分鐘。在最后的三次重復洗滌后，將膜與50ml含30mg 4-氯-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml超純水和30μl H2O2的溶液溫育20分鐘進行顯色。染色在用蒸餾水幾次沖洗膜時被終止。在圖3和4中出示的結果表明，在所有的7個逐漸康復的測試中都與10KDa的主帶反應。這意味著BASB059蛋白可能在將來作為候選疫苗起作用。
序列信息BASB059多聚核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1源自菌株ATCC13090的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB059多聚核苷酸序列ATGAACACACGCATCATCGTTTCGGCTGCGTTCGTTGCGTTGGCATTAGCAGGTTGCGGCTCAATCAATAATGTAACCGTTTCCGACCAGAAACTTCAGGAACGTGCCGCGTTTGCCTTGGGCGTCAGCCAAAATGCCGTAAAAATCAGCAACCGCAGCAATGAAAGCATACGCATCAACTTTACCGCAACTGTGGGTAAGCGCGTGAGCCAATGCTATGTTACCAGTGTAATCAGCACAATCGGCGTTACCACTTCCGATGCAATTTGTTTGGGAGGCGGAACGCACAAAGGCAAAAGTCAATGCAATGCTTTGCTTAAAGCGGCAGGCCGTTGCTAASEQ ID NO2從SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列推導得到的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽序列MNTRIIVSAAFVALALAGCGSINNVTVSDQKLQERAAFALGVSQNAVKISNRSNESIRINFTATVGKRVSQCYVTSVISTIGVTTSDAICLGGGTHKGKSQCNALLKAAGRCSEQ ID NO3AGG CAG AGG CAT ATG AAC ACA CGC ATC ATC GTT TCSEQ ID NO4AGG CAG AGG CTC GAG GCA ACG GCC TGC CGC TTT AAG C保藏的材料含有腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的保藏物在美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection)(本文中的“ATCC”)于1997年6月22日保藏，被指定的儲藏號(deposit number)為13090。該保藏物被稱為腦膜炎奈瑟氏球菌(Albrecht和Ghon)，它是凍干的，由腦膜炎奈瑟氏球菌分離物構建得到的1.5-2.9 kb的插入物文庫。該保藏物在Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.8∶1-15(1958)中有所描述。
該腦膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在本文中稱為“該保藏菌株”或“該保藏菌株的DNA”。
該保藏菌株含有全長的BASB059基因。該保藏菌株中所含有的上述多聚核苷酸的序列，以及由其編碼的任何多肽的氨基酸序列，如果和本文序列的任何描述有所沖突的話都得到核實(controlling)該保藏菌株的保藏是根據關于為了專利目的的微生物保藏物的國際共識(International Recognition of the Deposit ofMicro-organisms for Purposes of Patent Procedure)的布達佩斯條約(Budapest treaty)的條款進行的。在專利公開后，該菌株將無限制，無條件地，不可撤銷地向公眾開放。該保藏菌株僅僅是為了本領域的技術人員的便利而提供的，并不等于承認保藏物對于啟動(enablement)是必須的，如35 U.S.C.§112中所要求的那樣。
序列表序列表<110>Smithkline Beecham Biologicals S.A.
<120>新化合物<130>BM4S367<160>4<170>用于Windows的FastSEQ程序(3.0版)<210>1<211>339<212>DNA<213>(Neisseria Meningitidis)<214>奈瑟氏腦膜炎球菌<400>1atgaacacac gcatcatcgt ttcggctgcg ttcgttgcgt tggcattagc aggttgcggc 60tcaatcaata atgtaaccgt ttccgaccag aaacttcagg aacgtgccgc gtttgccttg120ggcgtcagcc aaaatgccgt aaaaatcagc aaccgcagca atgaaagcat acgcatcaac180tttaccgcaa ctgtgggtaa gcgcgtgagc caatgctatg ttaccagtgt aatcagcaca240atcggcgtta ccacttccga tgcaatttgt ttgggaggcg gaacgcacaa aggcaaaagt300caatgcaatg ctttgcttaa agcggcaggc cgttgctaa 339<210>2<211>112<212>PRT<213>Neisseria meningitidis<214>奈瑟氏腦膜炎球菌<400>2Met Asn Thr Arg Ile Ile Val Ser Ala Ala Phe Val Ala Leu Ala Leu1 5 10 15Ala Gly Cys Gly Ser Ile Asn Asn Val Thr Val Ser Asp Gln Lys Leu20 25 30Gln Glu Arg Ala Ala Phe Ala Leu Gly Val Ser Gln Asn Ala Val Lys35 40 45Ile Ser Asn Arg Ser Asn Glu Ser Ile Arg Ile Asn Phe Thr Ala Thr50 55 60Val Gly Lys Arg Val Ser Gln Cys Tyr Val Thr Ser Val Ile Ser Thr65 70 75 80Ile Gly Val Thr Thr Ser Asp Ala Ile Cys Leu Gly Gly Gly Thr His85 90 95Lys Gly Lys Ser Gln Cys Asn Ala Leu Leu Lys Ala Ala Gly Arg Cys100 105 110<210>3<211>35<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220>
<223>引物<400>3aggcagaggc atatgaacac acgcatcatc gtttc 35<210>4<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220>
<223>引物<400>4aggcagaggc tcgaggcaac ggcctgccgc tttaagc 3權利要求
1.一種分離的多肽，它包含的氨基酸序列和SEQ ID NO2中的氨基酸序列至少有85％的同一性。
2.權利要求1中所要求的分離的多肽，其中的氨基酸序列和SEQID NO2的氨基酸至少有95％的同一性。
3.權利要求1中所要求的多肽，其包含SEQ ID NO2中的氨基酸。
4.一種SEQ ID NO2的分離多肽。
5.權利要求1到4中任何一項所要求的多肽的免疫原性片段，其中上述免疫原性片段的免疫原活性基本上和SEQ ID NO2的多肽的免疫原活性相同。
6.一種分離的多聚核苷酸，它包含編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列。
7.一種分離的多聚核苷酸，它包含SEQ ID NO1中的多聚核苷酸。
8.一種含有編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的，分離的多聚核苷酸，它可以通過用標記的探針在嚴緊的雜交條件下篩選適當的文庫得到，上述探針具有SEQ ID NO1或其片段的序列。
9.一種表達載體或活的重組微生物，它包含有根據權利要求6-8中任何一項的分離的多聚核苷酸。
10.根據權利要求6-8中任何一項的多聚核苷酸的表達方法，它包括用含有至少一種上述多聚核苷酸的表達載體轉化宿主細胞，并在足以使任何一種上述多聚核苷酸表達的條件下培養上述宿主細胞。
11.一種疫苗組合物，它含有權利要求1到5任何一項中的有效量的多肽，以及藥用上可接受的載體。
12.一種疫苗組合物，它含有權利要求6到8任何一項中的有效量的多聚核苷酸，以及藥用上可接受的載體。
13.根據權利要求11或12中任何一項的疫苗組合物，其中所述的組合物含有至少一種其它腦膜炎奈瑟氏球菌抗原。
14.一種抗體，它對權利要求1到5任何一項中所要求的多肽或其免疫片段具有免疫特異性。
15.診斷腦膜炎奈瑟氏球菌感染的一種方法，該方法包括鑒定生物樣品中存在的權利要求1到5任何一項中所要求的多肽，或者對上述多肽具有免疫特異性的抗體，上述生物樣品源自懷疑患有這樣感染的動物。
16.一種組合物在一種藥物的制備中的應用，所述組合物含有免疫學上有效量的，權利要求1到5任何一項中所要求的多肽，所述藥物用于在一種動物中產生免疫應答。
17.一種組合物在一種藥物的制備中的應用，所述組合物含有免疫學上有效量的，權利要求6到8任何一項中所要求的多聚核苷酸，所述藥物用于在一種動物中產生免疫應答。
18.一種用于治療患有腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的藥用組合物，該組合物至少含有一種針對權利要求1到5任何一項中所要求的多肽的抗體，以及適當的藥用載體。
全文摘要
本發明提供了BASB059多肽和編碼BASB059多肽的多聚核苷酸以及通過重組技術產生這樣的多肽的方法。本發明也提供了診斷，預防和治療上的應用。
文檔編號A61P37/04GK1415013SQ00805839
公開日2003年4月30日 申請日期2000年1月25日 優先權日1999年1月29日
發明者J·通納德 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司